一种减轻水蛭出血不良反应的水蛭肽制备工艺的制作方法

本发明属于医药及生物技术领域，具体涉及一种减轻水蛭出血不良反应的水蛭肽制备工艺，尤其是一种减轻水蛭出血不良反应并且具有防治动脉粥样硬化作用的水蛭肽制备工艺。

背景技术：

动脉粥样硬化(atherosclerosis，as)是一种脂类代谢缺陷疾病，其特征是脂质和纤维类物质在大中型弹性血管中积累，由于血管堵塞可能会导致心脏、大脑或四肢缺血，导致梗塞。因此as也被认为是众多心脑血管疾病发病的主要原因，包括心肌梗死、冠心病及脑血栓等。准确的说，as的病变代表了一系列高度特异性的细胞和分子反应，它是血管受损后发生的一种慢性炎症过程，而炎症反应也贯穿于动脉粥样硬化发生和发展的整个过程。事实上，as的早期病变脂肪纹的形成常见于婴幼儿，它只是一种纯粹的由单核细胞源的巨噬细胞和淋巴细胞组成的炎症病变，不具有临床意义，但是它是脂质坏死碎片和平滑肌细胞(smoothmusclecells，smcs)积累形成晚期病变的先兆特征，由此可见as的发生是一个缓慢的过程。

血管内皮是心血管系统中的连续细胞内膜，它是血液的天然容器，是调节心血管系统稳态网络中的关键调节位点。as病变形成的最早变化发生在内皮中，也被称作是内皮功能紊乱(endothelialcelldysfunction，ecd)，这些变化包括内皮细胞在no，前列环素，血小板衍生生长因子(plateletderivedgrowthfactor，pdgf)，血管紧张素和内皮素的介导下对脂蛋白和其他血浆成分的渗透性增加，使包括l-选择素、整合素、血小板-内皮细胞粘附分子-1(plateletendothelialcelladhesionmolecule-1，pecam-1)在内的白细胞粘附分子以及包括e-选择素、p-选择素、icam-1和vcam-1在内的内皮粘附分子上调，使血液循环中的单核细胞进入内膜，分化成巨噬细胞后吞噬ox-ldl形成泡沫细胞；活化的内皮细胞和巨噬细胞产生多种趋化因子和生长因子作用于smcs诱导其增殖并在内膜内合成细胞外基质从而产生纤维斑块。发展中的斑块进行结构重建形成一个覆盖ox-ldl、胆固醇晶体和细胞碎片组成的坏死核心的纤维帽。这些复杂斑块的外侧边缘有丰富的炎性细胞群，可以进一步调节内皮的促炎表型并通过对细胞外基质的蛋白水解修饰形成不稳定斑块。不稳定的斑块可能会释放与血栓形成密切相关的内容物，引发动脉粥样硬化血栓栓塞。

目前治疗动脉粥样硬化的药物包括他汀类药物、细胞因子抑制剂和一些天然产物。在大多数双子叶植物中存在的大量环戊二烯单萜类化合物，被广泛研究，在体内和体外模型的大量研究中证明了含有环烯醚萜草本植物的不同抗炎活性，特别是在夹竹桃科、唇形科、茜草科、马钱科、玄参科和马鞭草科的植物中。另外大蒜、红倍酚、亚麻籽及其中的亚麻木酚素(secoisolariciresinoldiglucoside，sdg)和亚麻木脂素复合物(flaxlignancomplex，flc)、白藜芦醇等都可以不同程度抑制高胆固醇血症as。

水蛭是我国传统的中药材，它具有破血、逐淤等功能，其煎剂、口服液等剂型广泛用于心血管疾病的防治。但是其不良反应也时有发生，其中出血不良反应最为突出，严重影响其患者的健康。中医上常用水蛭粉和水蛭煎剂治疗多种疾病，但是这类水蛭制剂常伴有多种不良反应，如：出血、呕吐、腹泻等。单味水蛭也可以引起消化系统不良反应，包括胃肠道不适、恶心、呕吐等。还有报道称在中药水蛭粉碎过程中，工作人员因长时间吸入水蛭粉尘可导致咳血、鼻腔出血和喉咙干燥等不良反应。另有患有脑梗塞、及糖尿病患者在服用以水蛭为主要成分的活血通络胶囊5个月后，导致眼球结膜下出血，经停用后症状有明显缓解。临床上应用水蛭粉进行疾病的治疗时，水蛭粉服用过量或者服用过长时间都可能导致出血不良反应，水蛭制剂不能长时间应用的主要原因也是因为容易造成出血反应(内出血)。临床上应用水蛭粉服用时间不超过2个月，而且要在服用期间定期监测血凝调整用药量。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明通过实验获得一种既不影响内皮细胞中凝血相关因子mrna的表达，又能够抑制动脉粥样硬化发展的水蛭提取物的制备方法，从而找到一种临床可长期用于动脉粥样硬化的预防，安全可靠的，出血不良反应弱的新型水蛭口服制剂。

本发明的目的之一提供一种既能减少出血不良反应(不影响内皮细胞中凝血相关因子mrna的表达)，又能够抑制动脉粥样硬化发展的水蛭提取物的制备方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

将水蛭干体粉碎匀浆后，36-38℃、ph2.0，加入胃蛋白酶10000nfu/g，酶解8h及以上；将酶解液进行醇沉，取滤液浓缩冻干获得水蛭提取物。

优选的实施方案中，匀浆前先进行浸泡，更优选的实施方案中，加入20倍的超纯水4℃浸泡48小时。通过浸泡步骤，有利于水蛭干体溶胀便于匀浆释放水蛭胞内活性成分。

优选的实施方案中，匀浆操作在冰浴条件下进行且为高速匀浆，具体的，高速匀浆转速为18000r/min，时间为30min。

优选的实施方案中，加入胃蛋白酶酶解，37℃酶解8h，每小时调节一次ph值。在本发明中，发明人预实验发现加入胃蛋白酶的酶解选择以及酶解温度、ph、酶量、时间的组合因素，对于降低水蛭提取物的出血不良反应，至关重要。

优选的实施方案中，醇沉过程为向酶解液中加入95％的乙醇，使得乙醇的体积分数为75％，4℃静置醇沉12h。

优选的实施方案中，醇沉后，将醇沉的提取物进行抽滤，离心得上清，然后在37℃下减压浓缩至总体积的二十分之一，冻干得到获得水蛭提取物。本发明通过醇沉和浓缩过程，进一步去除了可影响出血效应的水蛭组分。

本发明最优选的实施例为：

(1)水蛭干体经过粉碎机粉碎成粉。

(2)将水蛭粉入到烧杯中，并加入20倍的超纯水4℃浸泡48小时，中间可以用玻璃棒搅拌几次。

(3)浸泡好的水蛭粉在冰浴条件下进行高速匀浆，转速为18000r/min，时间为30min。

(4)匀浆液预热至37℃，调节ph为2.0，加入胃蛋白酶10000nfu/g，37℃酶解8h，每小时调节一次ph值。

(5)酶解完成后，向酶解液中加入95％的乙醇，使得乙醇的体积分数为75％，4℃静置醇沉12h。

(6)将醇沉的提取物进行抽滤，离心得上清，然后在37℃下减压浓缩至总体积的二十分之一，冻干得到冻干粉末phl，-40℃保存备用。

本发明的目的之二在于提供一种由上述方法制备得到的既能减少出血不良反应(不影响内皮细胞中凝血相关因子mrna的表达)，又能够抑制动脉粥样硬化发展的水蛭提取物。

本发明的目的之三在于，提供一种包含上述水蛭提取物的药物组合物。

医药组合物所用的辅料可为固态或液态。固态形式的制剂包括粉剂、片剂、分散颗粒、胶囊、药丸及栓剂。粉剂及片剂可包含约5％至约95％的活性成分。适当的固体辅料可以是碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、糖或者乳糖。片剂、粉剂、药丸及胶囊为适于口服用的固态剂型。液态形式的制剂包括溶液、悬浮液及乳液，如非经肠注射用水溶液或水-丙二醇溶液，或添加甜味剂及造影剂的口服溶液。此外，还可制成注射用小水针、注射用冻干粉针、大输液或小输液。

此外，本发明的目的还包括上述水蛭提取物在制备抑制动脉粥样硬化的药物中的用途，所述用途中水蛭提取物能减少出血不良反应(不影响内皮细胞中凝血相关因子mrna的表达)。

本发明还包括上述水蛭提取物或上述药物组合物与至少一种其它心血管疾病药物药物合用。如可与本发明新颖化合物组合使用的其它心血管疾病药物包括具有抗血栓形成、抗血小板聚集、抗动脉粥样硬化、抗再狭窄症及/或抗凝血、血管舒张活性的药物等。

本发明取得了以下有益效果：

本发明提供了一种水蛭提取物及其制备方法，使用该方法制备的水蛭提取物phl可以在不影响内皮细胞凝血因子的前提下抑制动脉粥样硬化进程。这为找到一种临床可长期用于动脉粥样硬化的预防，安全可靠的，出血不良反应弱的新型口服制剂提供了可靠的制备工艺。

附图说明

图1mtt法检测不同浓度lp、phl、pthl、cehl、mrs、mrs-1、mrs-2和mrs-3对ea.hy926细胞存活率的影响，(a)lp对ea.hy926细胞存活率的影响；(b)phl对ea.hy926细胞存活率的影响；(c)pthl对ea.hy926细胞存活率的影响；(d)cehl对ea.hy926细胞存活率的影响；(e)mrs对ea.hy926细胞存活率的影响；(f)mrs-1对ea.hy926细胞存活率的影响；(g)mrs-2对ea.hy926细胞存活率的影响；(h)mrs-3对ea.hy926细胞存活率的影响；“*”表示p＜0.05vs对照组，“**”表示p＜0.01vs对照组。

图2lp对ea.hy926细胞的凝血相关因子mrna表达量的影响，(a)rt-pcr实验结果，(b)imagej软件对ea.hy926细胞促凝血因子pai、vwfmrna表达量的数据处理结果，(c)imagej软件对ea.hy926细胞抗凝血因子tpa、ps、tfpi和tmmrna表达量的数据处理结果。“*”表示p＜0.05vs对照组，“**”表示p＜0.01vs对照组，“***”表示p＜0.001vs对照组。

图3phl对ea.hy926细胞的凝血相关因子mrna表达量的影响，(a)rt-pcr实验结果，(b)imagej软件对ea.hy926细胞促凝血因子pai、vwfmrna表达量的数据处理结果，(c)imagej软件对ea.hy926细胞抗凝血因子tpa、ps、tfpi和tmmrna表达量的数据处理结果。“*”表示p＜0.05vs对照组，“**”表示p＜0.01vs对照组，“***”表示p＜0.001vs对照组。

图4pthl对ea.hy926细胞的凝血相关因子mrna表达量的影响，(a)rt-pcr实验结果，(b)imagej软件对ea.hy926细胞促凝血因子pai、vwfmrna表达量的数据处理结果，(c)imagej软件对ea.hy926细胞抗凝血因子tpa、ps、tfpi和tmmrna表达量的数据处理结果。“*”表示p＜0.05vs对照组，“**”表示p＜0.01vs对照组，“***”表示p＜0.001vs对照组。

图5cehl对ea.hy926细胞的凝血相关因子mrna表达量的影响，(a)rt-pcr实验结果，(b)imagej软件对ea.hy926细胞促凝血因子pai、vwfmrna表达量的数据处理结果，(c)imagej软件对ea.hy926细胞抗凝血因子tpa、ps、tfpi和tmmrna表达量的数据处理结果。“*”表示p＜0.05vs对照组，“**”表示p＜0.01vs对照组，“***”表示p＜0.001vs对照组。

图6mrs对ea.hy926细胞的凝血相关因子mrna表达量的影响，(a)rt-pcr实验结果，(b)imagej软件对ea.hy926细胞促凝血因子pai、vwfmrna表达量的数据处理结果，(c)imagej软件对ea.hy926细胞抗凝血因子tpa、ps、tfpi和tmmrna表达量的数据处理结果。“*”表示p＜0.05vs对照组，“**”表示p＜0.01vs对照组，“***”表示p＜0.001vs对照组。

图7mrs-1对细胞的凝血相关因子mrna表达量的影响，(a)rt-pcr实验结果，(b)imagej软件对ea.hy926细胞促凝血因子pai、vwfmrna表达量的数据处理结果，(c)imagej软件对ea.hy926细胞抗凝血因子tpa、ps、tfpi和tmmrna表达量的数据处理结果。“*”表示p＜0.05vs对照组，“**”表示p＜0.01vs对照组，“***”表示p＜0.001vs对照组。

图8mrs-3对ea.hy926细胞的凝血相关因子mrna表达量的影响，(a)rt-pcr实验结果，(b)imagej软件对ea.hy926细胞促凝血因子pai、vwfmrna表达量的数据处理结果，(c)imagej软件对ea.hy926细胞抗凝血因子tpa、ps、tfpi和tmmrna表达量的数据处理结果。“*”表示p＜0.05vs对照组，“**”表示p＜0.01vs对照组，“***”表示p＜0.001vs对照组。

图9不同浓度的tnf-α处理不同时间对ea.hy926细胞il-6mrna表达量的影响，(a)rt-pcr实验结果，(b)imagej数据处理结果。“*”表示p＜0.05vs对照组，“**”表示p＜0.01vs对照组，“***”表示p＜0.001vs对照组。

图10不同浓度的tnf-α处理不同时间对ea.hy926细胞mcp-1mrna表达量的影响，(a)rt-pcr实验结果，(b)imagej数据处理结果。“*”表示p＜0.05vs对照组，“**”表示p＜0.01vs对照组，“***”表示p＜0.001vs对照组。

图11phl对ea.hy926内皮细胞功能紊乱的保护作用，(a)rt-pcr实验结果，(b)imagej数据处理结果。图中的大写字母p为phl的简化形式，大写字母t为tnf-α的简化形式。“^#”表示p＜0.05vs对照组，“*”表示p＜0.05vs模型组，“**”表示p＜0.01vs模型组，“***”表示p＜0.001vs模型组。

具体实施方式

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1不同条件下水蛭提取物的制备

基于不同的目的需求，水蛭提取物的制备有不同的组合方式，此外，目前基于水蛭的研究主要是活性物质的分离纯化，体外模拟人体胃肠道环境对水蛭进行酶解，但是肠道微生物在物质的代谢转化中也有着不容忽视的作用，大多数中草药口服过程中，都难以避免的与肠道内的肠道微生物接触并被它们代谢转化，然后被胃肠道吸收到血液中，这些肠道微生物都具有优秀的酶系，可以使它们参与到催化和水解过程。

本发明以水蛭的干燥全体为原材料，分别用水提、胃蛋白酶酶解、胃蛋白酶和胰蛋白酶联用双酶解和粗酶酶解四种制备方法得到4种水蛭提取物，分别命名为水蛭粉水提物(lp)、胃蛋白酶酶解水蛭提取物(phl)、胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解的水蛭提取物(pthl)和粗酶酶解的水蛭提取物(cehl)。另外将得到的phl和pthl的水蛭提取物进行乳酸杆菌的代谢转化，得到了乳酸杆菌在mrs培养基中的代谢产物(mrs)、乳酸杆菌在不含氮源的mrs培养基中的代谢产物(mrs-1)以及乳酸杆菌在phl作为氮源的mrs培养基中的代谢转化产物(mrs-2)和乳酸杆菌在pthl作为氮源的mrs培养基中的代谢转化产物(mrs-3)4种提取物，共制备了8个样品。

1.1水蛭粉水提物的制备

(1)水蛭干体经过粉碎机粉碎成粉。

(2)将水蛭粉入到烧杯中，并加入20倍的超纯水4℃浸泡48h，中间可以用玻璃棒搅拌几次。

(3)浸泡好的水蛭粉在冰浴条件下以转速18000r/min进行高速匀浆，时间为30min。

(4)匀浆液经过抽滤，旋蒸，冻干得到冻干粉末水蛭粉水提物lp，-40℃保存备用。

1.2胃蛋白酶酶解的水蛭提取物的制备

(1)水蛭干体经过粉碎机粉碎成粉。

(2)将水蛭粉入到烧杯中，并加入20倍的超纯水4℃浸泡48h，中间可以用玻璃棒搅拌几次。

(3)浸泡好的水蛭粉在冰浴条件下以转速18000r/min进行高速匀浆，时间为30min。

(4)水浴锅预热到37℃，将匀浆液放置在水浴锅内，调节ph为2.0，加入胃蛋白酶10000nfu/g，在37℃下酶解8h，每小时调节一次酶解的ph值。

(5)酶解完成后，向酶解液中加入95％的乙醇，使得乙醇的体积分数为75％，4℃静置醇沉12h。

(6)将醇沉的提取物进行抽滤，离心得上清，然后在37℃下减压浓缩至总体积的二十分之一，冻干得到冻干粉末phl，-40℃保存备用。

1.3胃蛋白酶和胰蛋白酶双酶解的水蛭提取物的制备

(1)水蛭干体经过粉碎机粉碎成粉。

(2)将水蛭粉入到烧杯中，并加入20倍的超纯水4℃浸泡48h，中间可以用玻璃棒搅拌几次。

(3)浸泡好的水蛭粉在冰浴条件下以转速18000r/min进行高速匀浆，时间为30min。

(4)水浴锅预热到37℃，将匀浆液放置在水浴锅内，调节ph为2.0，加入胃蛋白酶10000nfu/g，在37℃下酶解4h；4h后将酶解液预热至50℃，后加入ph8.5的tris-hcl缓冲液，再用6mnaoh溶液调节ph为8.5，加入胰蛋白酶5000nfu/g在50℃下继续酶解8h。酶解过程中每小时调节一次ph值。

(5)酶解完成后，向酶解液中加入95％的乙醇，使得乙醇的体积分数为75％，4℃静置醇沉12h。

(6)将醇沉的提取物进行抽滤，离心得上清，然后在37℃下减压浓缩至总体积的二十分之一，冻干得到冻干粉末pthl，-40℃保存备用。

1.4粗酶酶解的水蛭提取物的制备

(1)水蛭干体经过粉碎机粉碎成粉。

(2)将100g水蛭粉入到烧杯中，并加入20倍的超纯水4℃浸泡48h，中间可以用玻璃棒搅拌几次。

(3)浸泡好的水蛭粉在冰浴条件下以转速18000r/min进行高速匀浆，时间为30min。

(4)匀浆液预热至50℃，加入ph8.5的tris-hcl缓冲液，然后用6mnaoh调节ph为8.5。

(5)向匀浆液中加入粗酶(含蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶)5g，在50℃条件下进行酶解；5h后加入胰蛋白酶5000nfu/g在50℃下继续酶解4h，酶解过程中每小时调节一次ph值。

(6)酶解完成后，向酶解液中加入95％的乙醇，使得乙醇的体积分数为75％，4℃静置醇沉12h。

(7)将醇沉的提取物进行抽滤，离心得上清，然后在37℃下减压浓缩至总体积的二十分之一，冻干得到冻干粉末cehl，-40℃保存备用。

1.5乳酸杆菌在mrs培养基中培养

(1)配制mrs液体培养基(mrs培养基(ph＝6.2～6.4)，胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，柠檬酸二胺2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温801ml，k2hpo42g，mgso4·7h2o0.58g，mnso4·4h2o0.25g，超纯水1000ml)，121℃高压蒸汽灭菌20min。

(2)将分离纯化好的菌株挑取几个单菌落接种于mrs液体培养基中，37℃进行扩大培养。

(3)将扩大培养好的乳酸杆菌进行离心，4000rpm离心20min，然后用无菌水重悬，1/4体积接种于配制好的mrs液体培养基中，37℃恒温培养箱中进行培养24h。

(4)将含有菌体的培养液进行离心去除菌体，4000rpm离心20min，上清液中加入95％的乙醇使得总的乙醇体积分数为75％，4℃静置醇沉12h。

(5)将醇沉的培养液进行抽滤，离心得上清，然后在37℃下减压浓缩至小体积，然后冻干得冻干粉末mrs，-40℃保存备用。

1.6乳酸杆菌在mrs不含氮源的培养基中培养

(1)将mrs培养基的配方中蛋白胨，牛肉膏，酵母提取物等提供氮源的物质去除掉，配制mrs不含氮源的培养基，121℃高压蒸汽灭菌20min。

(2)将1.5中(3)中用无菌水重悬的乳酸杆菌1/4体积接种于配制好的mrs不含氮源的培养基中,37℃恒温培养箱中进行培养24h。

(3)将含有菌体的培养液进行离心去除菌体，4000rpm离心20min，上清液中加入95％的乙醇使得总的乙醇体积分数为75％，4℃静置醇沉12h。

(4)将醇沉的培养液进行抽滤，离心得上清，然后在37℃下减压浓缩至小体积，然后冻干得冻干粉末mrs-1，-40℃保存备用。

1.7乳酸杆菌代谢转化胃蛋白酶酶解水蛭提取物

(1)将mrs培养基的配方中蛋白胨，牛肉膏，酵母提取物等提供氮源的物质去除掉，配制mrs不含氮源的培养基，121℃高压蒸汽灭菌20min。

(2)将之前冻干得到的粉末phl用无菌水溶解，再用无菌的0.22μm的微孔滤膜过滤。加入到配制好的mrs不含氮源的培养基中为乳酸杆菌提供氮源。

(3)将1.5中(3)中用无菌水重悬的乳酸杆菌1/4体积接种于配制好的上步的培养基中,37℃恒温培养箱中进行培养24h。

(4)将含有菌体的培养液进行离心去除菌体，4000rpm离心20min，上清液中加入95％的乙醇使得总的乙醇体积分数为75％，4℃静置醇沉12h。

(5)将醇沉的培养液进行抽滤，离心得上清，然后在37℃下减压浓缩至小体积，然后冻干得冻干粉末mrs-2，-40℃保存备用。

1.8乳酸菌代谢转化胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解水蛭提取物

(1)将mrs培养基的配方中蛋白胨，牛肉膏，酵母提取物等提供氮源的物质去除掉，配制mrs不含氮源的培养基，121℃高压蒸汽灭菌20min。

(2)将之前冻干得到的粉末pthl用无菌水溶解，再用无菌的0.22μm的微孔滤膜过滤。加入到配制好的mrs不含氮源的培养基中为乳酸杆菌提供氮源。

(3)将1.5中(3)中用无菌水重悬的乳酸杆菌1/4体积接种于配制好的上步的培养基中,37℃恒温培养箱中进行培养24h。

(4)将含有菌体的培养液进行离心去除菌体，4000rpm离心20min，上清液中加入95％的乙醇使得总的乙醇体积分数为75％，4℃静置醇沉12h。

(5)将醇沉的培养液进行抽滤，离心得上清，然后在37℃下减压浓缩至小体积，然后冻干得冻干粉末mrs-3，-40℃保存备用。

实施例2不同水蛭提取物对内皮细胞凝血活性的影响

vecs是血管内腔表面的连续单层扁平状细胞，它除了介导血液与组织间的物质交换外，vecs在炎症、凝血激活中都起主要作用。vec可以通过合成和释放多种凝血相关因子在机体止血和抗凝的动态平衡过程中起着双向调节作用。它表达的促凝血相关因子主要有：tf、血栓素a2(thromboxanea2，txa2)、vwf、血小板活化因子(plateletactivatingfactor，paf)、pai等；抗凝血相关因子主要有：内皮源性血管舒张因子no、enos、tm、抗凝血酶-iii(antithrombiniii，at-iii)、ps、tpa、tfpi、pgi2、硫酸乙酰肝素(heparinsulfate，hs)等。本发明通过检测ea.hy926内皮细胞凝血相关因子mrna的表达情况来探究不同水蛭提取物对内皮细胞凝血活性的影响

2.1mtt法检测水蛭不同提取物对ea.hy926内皮细胞存活率的影响

选取生长状况良好的细胞经过消化离心后，用含10％fbs的dmem培养基吹打重悬，经过细胞计数后将细胞以5×10³个/孔接种于96孔板中，每孔100μl，放入37℃，5％co2，饱和湿度培养箱进行培养。24h后加药，药物浓度为0，12.5，25，50，100，200，400和800μg/ml，每个药物浓度设6个复孔，放入培养箱中继续培养。48h后，向每孔中加入10μl的5mg/ml的mtt溶液。放入培养箱中继续培养。4～6h后去除培养液，加入100μldmso溶液。检测波长570nm，参比波长630nm，检测每孔的吸光度计算细胞的存活率并作图。

利用mtt能测各个提取物对ea.hy926细胞存活率的影响，结果如图1所示，结果显示，lp、pthl、cehl、mrs和mrs-3这5个样品在0-200μg/ml的作用浓度下对ea.hy926细胞无明显毒性；phl在100μg/ml的浓度下开始对ea.hy926细胞有明显的增殖作用；而mrs-1和mrs-2这两个样品在25μg/ml的浓度下开始对ea.hy926细胞有明显的毒性，但是mrs-1在0-50μg/ml的浓度范围内ea.hy926细胞的存活率仍然在80％以上，而mrs-2在25μg/ml浓度时ea.hy926细胞存活率即小于80％，因此mrs-2不适合继续用于后续试验，其余样品后续实验中使用的浓度为0、12.5、25和50μg/ml。

2.2rt-pcr检测水蛭提取物对ea.hy926细胞凝血相关因子的影响

表1ea.hy926细胞凝血相关因子检测所用引物

ea.hy926细胞总rna的提取

(1)实验准备：打冰、离心机降温到4℃；准备无酶用品；用酒精喷实验台，并用酒精棉擦拭移液枪，尤其是扎枪头的部位。

(2)将细胞从培养箱取出，吸去培养液后用适量pbs洗两遍后加入1mltrizol裂解液，使trizol均匀覆盖于细胞表面，水平放置3min后吹打细胞使其脱落，将所有液体移入1.5ml无酶离心管中，冰上静置5min。

(3)加入1/5v(200μl)的氯仿(chcl3)，剧烈震荡15s，待充分乳化后静置15min。

(4)4℃，12000rpm离心15min。中间白色的一层为蛋白，下层为有机相。

(5)取上步上清(约500μl)移入一个新的1.5ml无酶离心管中，加入500μl异丙醇，颠倒混匀6-7次，室温静置10min。上下颠倒时动作要轻缓，防止rna断裂，而且切勿吸到中间的蛋白质。

(6)4℃，12000rpm离心10min。

(7)弃上清，加入1ml75％乙醇(750μl无水乙醇+250μl无酶水)，轻轻上下颠倒洗涤。

(8)4℃，12000rpm离心5min。将上清中乙醇去除干净。横放室温干燥2～5min，待晾干后用适量无酶水(20～50μl)溶解沉淀。

(9)测量od260/280值，当od260/280在1.8～2.0之间时说明rna纯度较好。

(10)-80℃保存

反转录反应

上步中所得rna浓度可用，用反转录试剂盒进行反转，试验中所用到的枪尖和pcr管均无酶，且全部操作都在冰盒上进行，反转录体系如下：

pcr管中加入体积：templaterna2～3μl，oligo(dt)18primer1μl，rnasefreedh2oto12μl，总体积：12μl；

反应条件：pcr仪设定65℃5min，4℃+∞。

上述变性、退火后反应液：5×reactionbuffer4μl，ribolockrnaseinhibiter1μl，dntpmixture(10mm)2μl，revertaidm-mulvrt(200u/μl)1μl，总体积：20μl；

反应条件：pcr仪设定42℃，60min；70℃，5min；4℃，+∞。所得cdna保存在-20℃。pcr扩增

pcr扩增体系：dreamtaq^tmpcrmastermix25μl，forwordprimer1μl，reverseprimer1μl，templatedna1μl，rnasefreedh2oto50μl；

pcr扩增程序：①94℃，5min；②94℃，40s；③tm，45s；④72℃，60s；⑤goto②40cycles；⑥72℃，10min；⑦4℃，+∞。

琼脂糖凝胶电泳

(1)用超纯水将配制好的50×tae电泳缓冲液稀释至1×工作液。

(2)将凝胶托盘放置在制胶盒中，调解水平，插好加样梳，然后配制2％的琼脂糖凝胶，微波炉高火加热2min，倒至凝胶托盘中，若有气泡可以用移液器小心吸出，30min后即可使用。

(3)将制好的凝胶放入电泳槽，向孔中依次加入样品和maker，电压调至110v，时间为35min。

(4)电泳结束后，将凝胶放置到凝胶成像仪上面进行拍照，保存图片，然后用imagej作柱形图。

lp对ea.hy926细胞凝血相关因子的影响

不同浓度的lp对ea.hy926内皮细胞凝血相关因子mrna表达量的影响如图2所示。不同浓度的lp均可以显著促进ea.hy926内皮细胞凝血相关因子，包括促凝血因子pai、vwf和抗凝血因子tpa、ps、tfpi、tmmrna表达量的升高。

phl对ea.hy926细胞凝血相关因子的影响

不同浓度的phl对ea.hy926细胞凝血相关因子mrna表达量的影响如图3所示。phl在0-50μg/ml的浓度内对ea.hy926细胞凝血相关因子，包括促凝血因子pai、vwf和抗凝血因子tpa、ps、tfpi、tmmrna表达量均无明显影响。

pthl对ea.hy926细胞凝血相关因子的影响

不同浓度的pthl对ea.hy926细胞凝血相关因子mrna表达量的影响如图4所示。pthl在0-50μg/ml的浓度内可以显著降低ea.hy926细胞凝血相关因子，包括促凝血因子pai、vwf和抗凝血因子tpa、ps、tfpi、tm抗凝血因子mrna的表达量。

cehl对ea.hy926细胞凝血相关因子的影响

不同浓度的cehl对ea.hy926细胞凝血相关因子mrna表达量的影响如图5所示。结果显示，cehl在0-50μg/ml的浓度内，浓度依赖性的促进ea.hy926细胞内psmrna的表达，在50μg/ml时可以促进ea.hy926细胞内paimrna的表达；而对ea.hy926细胞中vwf、tpa、tfpi、tm的mrna的表达均有一定的抑制作用。

mrs对ea.hy926细胞凝血相关因子的影响

不同浓度的mrs对ea.hy926细胞凝血相关因子mrna表达量的影响如图6所示。结果显示，mrs在0-50μg/ml的浓度内，可以促进ea.hy926细胞中pai、vwf、tpa、tmmrna的表达；而对ps和tfpimrna的表达无显著影响。

mrs-1对ea.hy926细胞凝血相关因子的影响

不同浓度的mrs-1对ea.hy926细胞凝血相关因子mrna表达量的影响如图7所示。结果显示，mrs-1在0-50μg/ml的浓度内，对ea.hy926细胞中pai、vwf、tpa、ps、tfpi、tm的mrna的表达无明显影响。

mrs-3对ea.hy926细胞凝血相关因子的影响

不同浓度的mrs-3对ea.hy926细胞凝血相关因子mrna表达量的影响如图8所示。结果显示，mrs-3在0-50μg/ml的浓度内，可以促进ea.hy926细胞中pai、vwf、tpa、ps、tmmrna的表达；而对tfpimrna的表达无显著影响。

实施例3phl对内皮细胞功能紊乱相关分子的影响

3.1内皮功能紊乱模型的建立

选取生长状况良好的ea.hy926细胞消化离心后用含10％fbs的dmem培养基重悬，进行细胞计数后以2×10⁵个/孔接种于6孔板，培养箱中培养至汇合度为80％左右加入tnf-α，浓度分别为0，1，5，10和100ng/ml，放入培养箱继续培养，分别在6，12和24h后对相对应的细胞总rna进行提取，对相关炎症因子il-6和mcp-1进行pcr、电泳并作图，从而筛选出tnf-α合适的处理浓度及时间。

rt-pcr方法检测了0，1，5，10和100ng/ml的tnf-α分别作用于ea.hy926内皮细胞6h，12h和24h后，ea.hy926内皮细胞il-6和mcp-1mrna表达量的变化情况(图9和图10)。结果显示诱导组与空白对照组相比，经过不同浓度tnf-α诱导6h或更长时间后，细胞内il-6和mcp-1mrna表达量均有明显升高，而且用10ng/ml的tnf-α处理12h后，il-6和mcp-1mrna表达量与空白对照组相比分别升高了2.28和4.11倍，差异性最为明显(***p<0.001)。说明利用tnf-α处理ea.hy926细胞可以成功建立内皮功能紊乱模型，且最佳处理时间为12h，最佳处理浓度为10ng/ml。

3.2phl对内皮细胞功能紊乱相关分子的影响

选取生长状况良好的ea.hy926细胞，消化离心后用含10％fbs的dmem培养基重悬，进行细胞计数后以2×10⁵个/孔接种于6孔板。实验分为空白对照组，tnf-α诱导组，12.5μg/mlphl+tnf-α组，25μg/mlphl+tnf-α组，50μg/ml+tnf-α组和20μm的辛伐他汀(simvastatin，sim)阳性对照组6组。培养至汇合度为70％左右后按照上述分组加入不同浓度的药物，培养24h后用10ng/ml的tnf-α诱导12h，对相对应的细胞总rna进行提取，对相关炎症因子et-1、inos、il-6和mcp-1进行pcr、电泳并作图。

表2内皮细胞功能紊乱相关分子检测所用引物序列

et-1、inos、il-6和mcp-1是内皮发生功能紊乱时的特征表现因子，为检测内皮发生功能紊乱时它们的表达情况，本发明利用rt-pcr技术检测经过phl预处理和tnf-α处理的内皮细胞et-1、inos、mcp-1和il-6因子mrna表达情况。结果显示(图11)，tnf-α诱导组(0+t)与对照组相比，et-1、inos、mcp-1和il-6因子mrna表达量分别升高了53.95％、31.80％、60.77％和27.14％(^#p<0.05)，均有显著差异。而经过不同浓度的phl和20μmsim预处理后，这种由tnf-α诱导的4种因子的表达量增加有所降低。50μg/ml的phl预处理组与tnf-α诱导组相比，ea.hy926细胞内et-1、inos、mcp-1和il-6因子mrna表达量分别下降了28.06％、33.30％、19.8％和52.34％；20μmsim预处理组与tnf-α诱导组相比ea.hy926细胞内et-1、inos、mcp-1和il-6因子mrna表达量分别下降了49.20％、60.73％、64.80％和32.22％。说明phl可以不同程度的抑制由tnf-α诱导的ea.hy926细胞内et-1、inos、mcp-1和il-6因子mrna表达量的升高，且50μg/ml的phl预处理组对il-6因子mrna表达量升高的抑制作用优于20μmsim预处理组。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

sequencelisting

<110>山东大学

<120>一种减轻水蛭出血不良反应的水蛭肽制备工艺

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