本发明提供一种塔拉低聚肽及其工业化生产工艺及其用途，属于食品深加工领域。
背景技术：
塔拉(caesalpiniaspinosekuntze)又名刺云实(tara)，系苏木科云实属植物，主要分布主要在南美洲西北部的秘鲁、厄瓜多尔、哥伦比亚等国家，盛产于秘鲁。它耐干热、速生、常绿、四季开花，是绿化荒山的优良树种之一。它的寿命长达50余年，盛产期约20年，栽后3-4年亩产豆荚可达300余千克。是花工少，投资小，收益大，一劳多益的优良经济林树种。上世纪90年代初，中国林业科学研究院资源昆虫研究所从南美引进了替代五倍子生产没食子单宁及其系列产品的补充原料植物-塔拉，并在云南省干热、干暖河谷地区种植成功。至2006年，云南已发展塔拉近1.5万亩，贵州、四川、广西及海南等省区也开始引种。塔拉豆荚含塔拉单宁55-61％，可生产上百种医药和化工产品；其种仁含半乳葡萄糖甘露聚糖约34％，可生产在食品、医药、纺织、造纸和石油钻井等方面有重要用途的塔拉胶，同时种仁中含有13％脂肪酸(亚油酸占总脂肪酸的52-54％)。研究者从塔拉豆中提取了豆甾醇和谷甾醇(两醇约占甾醇总量的90％，前者是生产云大120的主要原料，后者可生产降血脂药，价值达1000余美元/千克)。该豆用途广，且无毒可食，是一种珍贵木本豆类。据研究表明塔拉豆中含有13％以上的蛋白质，是一种重要的植物蛋白来源。与蛋白相比，其水解产物塔拉低聚肽除氨基酸组成与塔拉蛋白一样具有优质蛋白的特点以外，还具有塔拉蛋白所不具备
的良好的溶解性、稳定性等理化性质，而且具有易吸收和低过敏原性、降低血脂和胆固醇、降低血压、促进矿物质吸收和脂肪代谢、增强运动员体能等多种生理功能，因此开发塔拉低聚肽已经成为食品药品领域的研究热点。我们前期专利cn105925648a公开了塔拉蛋白及其肽的制备工艺，肽含量不低于70wt％，95％以上的肽分子量小于1500dalton，灰分在10％左右。为了获得肽含量更高且灰分更低的塔拉低聚肽，并且应用于工业生产，本发明提供了一种更优的塔拉低聚肽制备工艺，制备所得的塔拉低聚肽的肽含量在80％以上，灰分控制在5％以下。同时，生物活力实验表明，本工艺生产的塔拉低聚肽粉同样具有更好的抗氧化活性，可以制备用于治疗自由基过多引起相关疾病的药物、食品或保健品。
食品中除含有大量有机物质之外，还含有较丰富的无机成分。这些无机成分维持人体的正常生理功能，构成人体组织方面有着十分重要的作用。食品经过高温灼烧后残留的无机物质称为灰分。灰分主要为食品中的矿物盐或无机盐类，测定食品中灰分是评价食品质量的指标之一。对于食品行业来说，灰分是一项体的重要的质量指标。例如，在面粉加工中，常以总灰分含量来评定面粉等级，因为小麦麸皮的灰分含量比胚乳高20倍左右，因此，面粉的加工精度越高，灰分含量越低。在生产果胶、明胶等胶质产品时，总灰分可说明这些制品的胶冻性能；水溶性灰分则在很大程度上表明果酱、果冻等水果制品中的水果含量；而酸不溶性灰分的增加则预示着污染和掺杂。这对保证食品质量是十分重要的。食品和药品中灰分的控制具有下述重要意义：
(1)食品的总灰分含量是控制食品成品或半成品质量的重要依据。比如：牛奶中的总灰分在牛奶中的含量是恒定的。一般在0.68％--0.74％，平均值非常接近0.70％，因此可以用测定牛奶中总灰分的方法测定牛奶是否掺假，若掺水，灰分降低。另外还可以判断浓缩比，如果测出牛奶灰分在1.4％左右，说明牛奶浓缩一倍。又如富强粉，麦子中麸皮灰分含量高，而胚乳中蛋白质含量高，麸皮的灰分比胚乳的含量高20倍，就是说面粉中的精度高，则灰分就低。
(2)评定食品是否卫生，有没有污染。不同的食品，因所用原料、加工方法及测定条件的不同，各种灰分的组成和含量也不相同，当这些条件确定后，某种食品的灰分常在一定范围内。如果灰分含量超过了正常范围，说明食品生产中使用了不合乎卫生标准要求的原料或食品添加剂，或食品在加工、贮运过程中受到了污染。因此，测定灰分可以判断食品受污染的程度
(3)判断食品是否掺假。
(4)评价营养的参考指标(可通过测各种元素)。
(5)可以评判食品的加工精度和食品品质。无机盐是六大营养要素之一，是人类生命活动不可缺少的物质，要正确评价某食品的营养价值，其无机盐含量是一个评价指标。譬如常以总灰分含量评定面粉等级，富强粉为0.3-0.5％；标准粉为0.6-0.9％。生产果胶、明胶之类的胶质品时，灰分是这些制品的胶冻性能的标志。
技术实现要素：
本发明公开了一种塔拉低聚肽及其工业化制备工艺，旨在保证产品收率的前提下，提供一种肽含量更高且灰分更低的塔拉低聚肽的工业化制备工艺，工艺更为简便，绿色环保，适合大规模生产。本工艺生产的塔拉低聚肽粉具有更好的抗氧化活性，可以用于治疗或预防自由基过多引起的症状的药物、食品或保健食品。
在塔拉低聚肽的制备过程中，由于蛋白提取以及酶解过程中，为达到生物酶反应条件，不断的加入盐酸和氢氧化钠，造成盐的含量高，从而造成灰分含量高。较高的灰分，影响了产品中肽含量。由于盐的分子量较小，前期肽的纯化方法都是较大分子量的超滤膜，最后收集的为超滤膜的透过液，因此肽、氨基酸以及盐均在透过液，不能将盐除去。
现有技术中多种食品的灰分控制在8wt％，如大豆肽粉的国家标准(gbt22492-2008，其内容在此全部引入并作参考)。但利用本申请的制备方法，灰分可控制在5wt％以下。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种塔拉低聚肽，其特征在于：采用gb/t22492-2008附录a与附录b的检测方法，测得肽含量在80wt％以上，分子量小于1500dalton以下的占98％以上，其分子量分布如下：
其中所述灰分小于5wt％；
优选地，肽含量为82.3wt％以上，分子量小于1500dalton以下的占98.5％以上。
优选地，肽含量为85wt％以上，分子量小于1500dalton以下的占98％以上。
优选地，肽含量为90wt％以上，分子量小于1500dalton以下的占98％以上。
优选地，肽含量为95wt％以上，分子量小于1500dalton以下的占98％以上。
本发明还提供了所述塔拉低聚肽粉的制备方法，包括下述步骤：
(1)将塔拉豆粉碎，过40目以上筛网从而获得塔拉豆粉；
(2)将塔拉豆粉与纯化水按质量比为1∶10～1∶20混合，加入豆粉质量的0.1％～1％的聚糖降解酶，调节ph至5～8，恒温40℃搅拌1～2h，完成后，离心过滤，滤液待用；
(3)将步骤(2)中的滤渣与其质量比为1∶10～1∶20的纯化水混合，调节ph至8～10，恒温40℃提取1～2h，提取完成后离心过滤，弃去滤渣，滤液待用；
(4)合并步骤(2)和(3)中的滤液，调节ph为3～5，静置1～2h，弃去上清液，得到蛋白沉淀物；
(5)将步骤(4)中的蛋白沉淀物中加入体积比为1∶5～1∶15的纯化水，搅拌均匀形成蛋白复溶液；
(6)将步骤(5)中的蛋白复溶液加热至40～55℃，加入塔拉豆粉质量的0.5～2％蛋白酶，搅拌酶解4～6h后，调整ph为2～6，煮沸灭活10～30min，离心过滤，滤液备用；
(7)将步骤(6)中的滤液使用孔径为0.5μm以下的微滤膜进行过滤，透过液再经100～400dalton纳滤膜处理后，截留液浓缩干燥后，得到塔拉低聚肽粉。
所述的制备方法，其特征在于：所述的浓缩方法可以为膜浓缩、减压浓缩或常压浓缩；所述的干燥方法可以为喷雾干燥、真空干燥、加热干燥或冷冻干燥。
所述的制备方法，其特征在于：所述的聚糖降解酶选自食品级的β-葡聚糖酶(酶活力≥2000u/g)和甘露聚糖酶(酶活力≥2000u/g)中的一种或者它们的混合物，优选地使用β-葡聚糖酶。
所述塔拉低聚肽的工业化制备方法，其特征在于：所述生物酶选自食品级的中性蛋白酶(酶活力≥30万u/g)、木瓜蛋白酶(酶活力≥40万u/g)、菠萝蛋白酶(酶活力≥30万u/g)、碱性蛋白酶(酶活力≥20万u/g)、胃蛋白酶(酶活力≥50万u/g)、胰酶(酶活力≥3000u/g)中的一种或者它们的混合物，优选地使用中性蛋白酶。
更优选地，所述制备方法包括在分离纯化步骤中使用100～400dalton纳滤膜处理的步骤。
本发明还提供了一种组合物，其含有上述的塔拉低聚肽粉，和药物或食品上可接受的助剂。
所述组合物的剂型选自素片、薄膜包衣片、糖衣片、肠衣片、分散片、胶囊、颗粒剂、口服溶液或口服混悬液。
本发明所述的塔拉低聚肽粉、组合物，都用于制备治疗或预防自由基过多引起的症状的药物、食品或保健品的应用。用于制备改善由pm2.5颗粒物引起的心血管毒性；降低pm2.5颗粒物对巨噬细胞抑制作用；增强巨噬细胞对pm2.5颗粒物的吞噬功能；促进肠道对pm2.5颗粒物的分泌作用的药物、食品或保健品的应用。所述的塔拉豆低聚肽粉是由中性蛋白酶制备的。
实施例
下面通过实施例对本发明作进一步说明。应该理解的是，本发明实施例所述方法仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。如无特别说明，实施例中用到的所有原料和溶剂均为市售产品。活性实施中所用本发明产品和阳性对照药品的量，均按照试验受体的最大耐受剂量加入。
对比实施例：
专利cn105925648a的制备方法获得的肽粉：将塔拉豆(云南易门药材市场)粉碎，过40目以上筛网从而获得塔拉豆粉。将100kg塔拉豆粉与纯化水按质量比为1∶10混合，加入豆粉质量的0.1％的β-葡聚糖酶(酶活力3000u/g)，调节ph至6，恒温40℃提取2h；提取完成后，离心过滤，滤液待用；再将滤渣与其质量比为1∶15的纯化水混合，调节ph至9，恒温40℃提取2h；提取完成后离心过滤，弃去滤渣，滤液待用；最后合并以上待用滤液，调节ph为3.5，静置1h，弃去上清液，往沉淀物中加入体积比为1∶10的纯化水，搅拌均匀得到蛋白复溶液。将蛋白复溶液加热至45℃，加入塔拉豆粉质量的1％中性蛋白酶(酶活力为30万u/g)，恒定ph为7，搅拌酶解4h后，煮沸灭活30min，离心，上清液即为蛋白酶解液。将蛋白酶解液使用孔径为0.5μm的微滤膜进行过滤，透过液再经5000dalton超滤膜处理后，透过液在50℃下浓缩至固含为6.5wt％时，进行喷雾干燥，得到淡黄色塔拉低聚肽(批号为tl-1)，产率为5.9wt％，测得肽含量为71.32wt％，至少95.77％肽分子量分布在1500dalton以下。
通过本发明方法获得的肽粉：将塔拉豆(云南易门药材市场)粉碎，过40目以上筛网从而获得塔拉豆粉。将100kg塔拉豆粉与纯化水按质量比为1∶10混合，加入豆粉质量的0.1％的β-葡聚糖酶(酶活力3000u/g)，调节ph至6，恒温40℃提取2h；提取完成后，离心过滤，滤液待用；再将滤渣与其质量比为1∶15的纯化水混合，调节ph至9，恒温40℃提取2h；提取完成后离心过滤，弃去滤渣，滤液待用；最后合并以上待用滤液，调节ph为3.5，静置1h，弃去上清液，往沉淀物中加入体积比为1∶10的纯化水，搅拌均匀得到蛋白复溶液。将蛋白复溶液加热至45℃，加入塔拉豆粉质量的1％中性蛋白酶(酶活力为30万u/g)，恒定ph为7，搅拌酶解4h后，调节ph至5，煮沸灭活30min，离心，上清液即为蛋白酶解液。将蛋白酶解液使用孔径为0.5μm的微滤膜进行过滤，透过液再经100dalton超滤膜处理后，截留液液在50℃下浓缩至固含为6.2wt％时，进行喷雾干燥，得到淡黄色塔拉低聚肽(批号为tl-2)，产率为7.1wt％，测得肽含量为82.3wt％，至少98.5％肽分子量分布在1500dalton以下。
生物活性实施例1：
1.dpph自由基清除实验：
1.1dpph乙醇溶液的配制：精密称取dpph4mg，置于100ml棕色容量瓶中，加入50ml乙醇，超声30s，用乙醇定容至刻度，摇匀，待用。本品须现配现用。
1.2供试品溶液的配制：精密称取适量塔拉低聚肽粉，加乙醇溶解后，定容，稀释成所需浓度，即可。
1.3操作步骤：准确吸取2ml供试品溶液和2mldpph溶液混合均匀；准确吸取2ml供试品溶液和2ml乙醇混合均匀；准确吸取2mldpph溶液和2ml乙醇混合均匀，室温放置30min，在515nm波长处测定吸光度，并根据以下计算公式计算自由基清除率：
ir％＝[1-(ai-aj)/a0]*100％；
其中，ai表示待测溶液和dpph混合后溶液的吸光度；
aj表示待测溶液和溶剂混合后溶液的吸光度；
a0表示dpph和溶剂混合后溶液的吸光度。
2.abts+自由基清除实验：
2.1pbs缓冲液的配制：称取氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸二氢钾0.24g，十二水合磷酸氢二钠3.62g，置于1000ml烧杯中，加入800ml蒸馏水，搅怑使其溶解，用盐酸或氢氧化钠调节ph至7.4，转移至1000ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，待用。
2.2abts+贮存溶液的配制：精密称取abts+78mg左右，置于20ml棕色容量瓶中，加入15ml蒸馏水，超声5min，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。精密称取过硫酸钾76mg左右，置于2ml棕色容量瓶中，加入1ml蒸馏水，超声使其溶解，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。精确吸取352μl过硫酸钾溶液加入至abts溶液中，摇匀，静置过夜。
2.3abts+工作溶液的配制：精确吸取贮存溶液1ml，加入65ml左右pbs缓冲液，摇匀。
2.4供试品溶液的配制：精密称取适量塔拉低聚肽，加pbs缓冲液溶解后，定容，稀释成所需浓度，即可。
2.5操作步骤：准确吸取0.5ml供试品溶液和5mlabts工作溶液混合均匀；准确吸取0.5ml供试品溶液和5mlpbs缓冲液混合均匀；准确吸取5mlabts工作溶液和0.5mlpbs缓冲液混合均匀，立即在734nm处测定吸光度，并根据以下公式计算自由基清除率：
ir％＝[1-(ai-aj)/a0]*100％；
其中，ai表示待测溶液和abts混合后溶液的吸光度；
aj表示待测溶液和溶剂混合后溶液的吸光度；
a0表示abts和溶剂混合后溶液的吸光度。
3.srsa超氧阴离子自由基清除实验：
3.1nbt溶液的配制：精密称取氯化硝基四氮唑蓝(nbt)24.5mg，置于100ml棕色容量瓶中，加入50ml蒸馏水，超声30s，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，待用。
3.2nadh溶液的配制：精密称取烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型辅酶i(nadh)33.2mg，置于100ml棕色容量瓶中，加入50ml蒸馏水，超声30s，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，待用。
3.3pms溶液的配制：精密称取吩嗪硫酸甲酯(pms)4.59mg，置于250ml棕色容量瓶中，加入150ml蒸馏水，超声30s，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，待用。
3.4tris-hcl缓冲溶液的配制：精密称取三羟甲基氨基甲烷(tris)3.025g，置于500ml烧杯中，加入200ml蒸馏水，搅拌使其溶解，用1mhcl调节ph至8.0，转移至250ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，待用。使用时，取16ml上述溶液置于100ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度。
3.3供试品溶液的配制：精密称取适量塔拉低聚肽，加tris-hcl缓冲液溶解后，定容，稀释成所需浓度，即可。
3.4吸光值检测及自由基清除率的计算：准确吸取1mlnadh溶液，1mlnbt溶液和3ml供试品溶液，对照加3mltris-hcl缓冲溶液，分别混合均匀，各加1mlpms溶液混匀，室温放置5min，在558nm处测定吸光度，自由基清除率计算公式如下：
ir％(srsa)＝(1-ai/a0)*100％
其中，ai表示待测溶液和检测试剂混合后溶液的吸光度；
a0表示空白溶液和检测试剂混合后溶液的吸光度。
分别配制不同实施例的塔拉低聚肽产品(批号为tl-1及tl-2)浓度为1mg/ml，以维生素c为阳性对照(浓度为0.1mg/ml)，测试结果如表1所示：
表1塔拉低聚肽粉抗氧化活性
由表1可知，两种方法所制备的塔拉低聚肽粉对abts自由基具有较强的清除作用，清除率均超过90％，而对dpph自由基和超氧阴离子(srsa)的清除率超过50％，表现为中等强度清除作用。而通过本专利所公开方法所制备的塔拉低聚肽(tl-2)对三种自由基的清除效果较好，推测原因为较高的肽含量。可见使用本专利的发明方法所制备的塔拉低聚肽粉同样可用于制备治疗或预防自由基过多引起的症状的药物、食品或保健食品。