本发明属于生物医学领域，涉及用于诊断男性骨质疏松症的分子标志物。
背景技术：
：骨质疏松症是多种原因引起的一组骨病，骨组织有正常的钙化，钙盐与基质呈正常比例，以单位体积内骨组织量减少为特点的代谢性骨病变。在多数骨质疏松中，骨组织的减少主要由于骨质吸收增多所致。以骨骼疼痛、易于骨折为特征。世界卫生组织已将骨质疏松列为仅次于心血管疾病的第二大危害人类健康的疾病。据中国健康促进基金会最新发布的《2013中国骨质疏松骨折防治蓝皮书》显示，骨质疏松骨折是一种脆性骨折，即在受到轻微创伤或日常活动中遭受低能量外伤即可发生的骨折。骨质疏松骨折的常见部位是脊椎、髋骨和前臂远端。我国50岁以上人群约6944万人患有骨质疏松症，约2.1亿人骨量偏低。在我国，针对老年男性骨质疏松症的关注程度以及研究深度远远不够。但老年男性骨质疏松症的危害并不亚于女性，男性髋部骨折的患病率和病死率明显高于女性。国内外研究表明，男性骨质疏松症的危险因素包括：(1)年龄年龄增长是男性骨质疏松症的一项独立危险因素。年龄对于骨代谢的影响可能包括对骨吸收相对活跃，而成骨作用受到抑制，导致骨吸收大于骨形成。与此同时，随着年龄增长，肾lα羟化酶活性下降，活性1,25(oh)2d3减少，肠道钙吸收下降，血钙减少，引起继发性甲状旁腺功能亢进，导致骨质丢失。(2)体重指数(bodymassindex，bmi)bmi是影响老年男性骨质疏松症患病率的一个重要指标。男性骨质疏松症患病率的一个重要指标。研究显示，bmi小于20-25kg/m2的人群患骨质疏松症可能性会增大，而且与bmi大于25kg/m2的人群比较，bmi为15-20kg/m2的患者髓部骨折的可能性会增加。另外有研究发现，bmi每增加1kg/m2测得股骨颈、髓部和腰椎的bmd分别增加0.1sd，0.11sd以及0.09sd。bmi增加可引起骨骼的机械负荷增大，刺激骨形成并减少骨吸收。(3)内分泌激素的影响雄激素水平降低是老年男性骨质疏松症的一个重要危险因素。骨细胞上存在雄激素受体，雄激素直接作用于这些受体以促进成骨细胞强化骨骼。老年男性下丘脑一垂体一性腺轴功能减低，睾丸功能减退，睾酮水平下降，而性激素结合球蛋白水平升高，引起成骨细胞的成骨作用减弱，导致骨密度下降。(4)遗传因素遗传因素在男性骨质疏松症的发病占有重要地位。目前骨质疏松症遗传研究主要包括群体遗传学和分子遗传学两大方面，分别针对人种、家系和基因多态性进行研究。峰值骨量最显著的决定因素是遗传因素，影响可能占60％-80％。(5)营养水平患者长期饮食习惯和食物的构成配比尤其是食物中钙剂和维生素d的含量对骨质疏松症的发病也起到了一定作用。meta分析表明补充钙和维生素d3的人群，bmd有所增高，发生骨折的风险降低。钙剂可以减少骨量流失，预防椎体骨折，并且对预防非椎体骨折也可能有帮助。另外，生活习惯包括运动、吸烟、大量饮酒也是男性骨质疏松症的重要危险因素。诊断骨质疏松症，首先必须进行骨密度的测定。骨密度实际上就是表示骨的健康程度，或是反过来说表示骨的老化程度。常用的检测手段包括：x线摄片法：使用历史最早，但由于有放射性，其测验结果不能量化，已逐渐被取代。单光子测定仪：费用低、方便、辐射量小而安全。但因不能测躯干骨以及不能区别皮质骨、松质骨、软组织等而受限制，已逐渐被取代。定量超声法：低廉、方便、又无放射性损伤。适合各年龄段人群的骨状态普查工作。不仅能检测骨密度，还能了解骨的质量即可反应骨的微结构及弹性。但目前只用于跟骨、胫骨和指骨，不能进行全身骨骼的检测。双能x线吸收法：是目前最理想的测定法，是诊断骨质疏松症的金标准，国内外通用，可测全身各部位骨骼，也能测软组织厚度，但该设备数量较少且价格昂贵，因此对于骨质疏松症患者的诊断来说经济负担大。为此寻找一种敏感性高、准确度高且价格合理的诊断骨质疏松症的方法是亟待解决的问题。近年来，遗传因素已经成为了骨生物学中最活跃的研究领域之一，已有研究表明维生素d受体基因(vdr)和维生素d结合蛋白(dbp)是较早发现的骨质疏松症的候选基因，另外还发现esr1基因、esr2基因、cyp19a1基因、cyp17a1基因、esrra基因和esrrg基因与骨质疏松症的发病具有相关性。此外，已经有相当数量的专利申请涉及骨质疏松症的基因诊断，如申请号为：201610272604.0、201610922798.4、201510628024.6、201510628081.4、201510725408.x、201510628042.4、201610530383.2、201510629348.1、201510627056.4、201510627060.0、201610555353.7的专利。可见利用基因来诊断骨质疏松症成为了今后骨质疏松症早期诊断的发展趋势。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种用于诊断男性骨质疏松症或者预测男性骨质疏松症预后的生物标志物。本发明利用高通量测序和qpcr实验证明了gm2a基因在男性骨质疏松症患者的血液中的表达水平显著低于正常男性，因此可将gm2a基因作为诊断男性骨质疏松症或者预测男性骨质疏松症预后的生物标志物。根据本发明的一个方面，本发明提供了检测gm2a(gm2gangliosideactivator，gm2神经节苷脂激活因子)基因表达的试剂在制备男性骨质疏松症辅助诊断或预测预后产品中的应用。进一步，所述试剂包括检测gm2a基因mrna表达水平的试剂，和/或检测gm2a蛋白表达水平的试剂。检测gm2a基因mrna表达水平的试剂是如pcr、如southern杂交、northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(fish)、dna微阵列、aso法、高通量测序平台等定性地、定量地、或半定量地检测基因mrna表达水平的方法中使用的任何试剂。进一步，所述检测gm2a基因mrna表达水平的试剂包括qpcr中使用的引物，和/或探针。在本发明的具体实施方案中，所述检测gm2a基因mrna表达水平的试剂包括qpcr中使用的引物，所述引物序列如seqidno.1和seqidno.2所示。上面所述的引物可以通过化学合成来制备，使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。前面所述的探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。检测gm2a蛋白表达水平的试剂是如elisa、放射免疫测定法、免疫组织化学法、western印迹等能够检测蛋白表达水平的方法中使用的任何试剂。本发明可用于检测gm2a蛋白表达水平的试剂包括针对gm2a蛋白的抗体，所述抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)。前面所述的本发明的所述产品检测的样本不受特别限制，只要它适于本发明的测定；例如，它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。在本发明的具体实施方案中，所述样本来自受试者的血液。根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种用于男性骨质疏松症辅助诊断或预测预后的产品，所述产品包括前面所述的检测gm2a基因表达的试剂。进一步，本发明前面的所述产品包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断男性骨质疏松症的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知gm2a基因的异常与男性骨质疏松症相关也属于gm2a基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。本发明还提供了一种男性骨质疏松症辅助诊断或预测预后的方法，所述方法包括如下步骤：(1)获取男性受试者含有gm2a基因表达产物的样本；(2)检测样本中gm2a基因或蛋白的表达水平；(3)将测得的gm2a基因或蛋白的表达水平与受试者的患病与否关联起来。(4)与正常对照相比，如果gm2a基因或蛋白的表达水平降低，则该男性受试者被诊断为骨质疏松症，或男性骨质疏松患者被确定为预后差。在本发明的上下文中，“诊断男性骨质疏松症”既包括判断男性受试者是否已经患有男性骨质疏松症、也包括判断男性受试者是否存在患有男性骨质疏松症的风险。预测预后是指预测患者状况的过程或结果，并不意味着能以100％的准确度预测患者状况的过程或结果。预测预后是指确定某些过程或结果的可能性是否增加，而并不意味着通过与某些过程或结果不发生的情况比较来确定发生某些过程或结果的可能性。如本发明而言，本发明中gm2a基因或gm2a蛋白的水平降低的患者中，与不显示该特征的人相比，更有可能观察到特定过程或结果。如本文所用，术语”抗体”，意指特异性结合至特定抗原或与特定抗原相互作用的任意抗原-结合分子或分子复合体，其包含至少一个互补决定区(cdr)。术语”抗体”包括含有4个多肽链(即，通过双硫键相互连接的2个重(h)链以及2个轻(l)链)以及其多聚体(例如igm)。每个重链含有重链可变区以及重链恒定区。重链恒定区含有3个结构域ch1、ch2和ch3。每个轻链含有轻链可变区以及轻链恒定区。轻链恒定区含有一个结构域(cl1)。vh与vl区可进一步细分成高变区(称为互补决定区(cdr))，其中散布着较保守的称为框架区(fr)的区域。每个vh和vl均由三个cdr和四个fr组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3和fr4。如本文所用，术语“抗体”还包括整个抗体分子的抗原结合片段。抗体的抗原结合片段可以利用任何适宜的标准技术，例如蛋白水解消化或涉及编码抗体可变区和任选恒定区的dna的操纵和表达的重组基因改造技术，从例如完整的抗体分子衍生。这样的dna是已知的及/或很容易从例如市售来源、dna库(包括例如噬菌体-抗体库)获得，或可以被合成。该dna可以被测序且以化学方法或分子生物学技术加以操纵，从而例如将一个或多个可变区和/或恒定区排列成适宜的构型，或引入密码子、产生半胱氨酸残基、修饰、添加或删除氨基酸等。抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)fab片段；(ii)f(ab')2片段；(iii)fd片段；(iv)fv片段；(v)单链fv(scfv)分子；(vi)dab片段；以及(vii)由模拟抗体高变区(例如孤立的互补决定区(cdr)，如cdr3肽)的氨基酸残基组成的最小识别单元或约束型fr3-cdr3-fr4肽。抗原结合片段还包括其它工程化的分子，如结构域特异性抗体、单域抗体、结构域缺失的抗体、嵌合抗体、cdr移植的抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微抗体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小模块免疫药物(smallmodularimmunopharmaceuticals)(smip)，以及鲨鱼可变ignar域。“单克隆抗体”是由单克隆的b-淋巴细胞或由已经将编码单个抗体(或其抗原结合片段)的抗体轻链和重链可变区的核酸转染至其中的细胞或其后代产生的抗体。单克隆抗体通过本领域技术人员已知的方法产生，例如通过从骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合制造杂合抗体形成细胞来进行。这些融合细胞和它们的后代被称为“杂交瘤”。“多特异性抗体”可以是对一个标的多肽的不同表位具有特异性或者可能含有对超过一个标的多肽具有特异性的抗原-结合域。参见例如tutt等,1991,j.immunol.147:60-69；kufer等,2004,trendsbiotechnol.22:238-244。抗体或其片段在功能上可以链接(例如，通过化学偶合、遗传融合、非共价缔合或其他方式)至一或多个其他分子实体，诸如另一个抗体或抗体片段，以产生带有第二种结合特异性的双特异性或多特异性抗体。附图说明图1显示利用qpcr检测gm2a基因在男性骨质疏松症患者和正常男性中的表达差异。具体的实施方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1筛选男性骨质疏松症患者和正常男性的差异表达基因1、研究对象：检测骨密度，选择骨质疏松症男性患者3例，年龄分别为60岁、82岁、68岁；正常对照组男性2例，年龄分别为71岁、69岁。骨质疏松症患者的纳入标准：(1)符合骨质疏松症诊断标准者，参照《中国人骨质疏松症建议诊断标准(第二稿)；(2)患者均知情同意。排除标准：糖尿病、严重肝肾疾病、甲状腺疾病、内分泌疾病引起疾病的老年男性；服用过治疗骨质疏松症药的老年男性，如阿伦磷酸钠等(间断性服用小剂量钙剂除外)。2、血液总rna提取(1)前处理直接取新鲜的血液(外周血)，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，10,000rpm离心1分钟。彻底吸弃上清，收集白细胞沉淀。每100-200μl血液收集的白细胞沉淀加入1mltrizol。(2)分层a.样品加入trizol后，室温放置5min，使样品充分裂解。b.每1mltrizol加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置3-5min使其自然分相。(3)rna沉淀a.4℃12,000rpm离心10-15min。样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，rna主要在水相中，把水相(通常可吸取550μl)转移到新管中。b.在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置10-20min。4℃12,000rpm离心10min，弃上清，rna沉淀于管底。(4)rna漂洗a.rna沉淀中加入1ml75％乙醇(用rnase-free水配制)，温和振荡离心管，悬浮沉淀。每1mltrizol加入1ml75％乙醇。b.4℃5,000-8,000rpm离心1-2min，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，室温放置1-2分钟晾干沉淀。(5)溶解rna沉淀中加入50-100μlrnase-free水，轻弹管壁，以充分溶解rna，-70℃保存。3、rna样品的质量分析利用nanodrop2000对所提rna的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测rna完整性，agilent2100测定rin值。单次建库要求rna总量5μg，浓度≥200ng/μl，od260/280介于1.8～2.2之间。4、片段化rnaillumina平台是针对短序列片段进行测序，mrna平均长度可能达几kb，因此需要对其进行随机打断。利用金属离子，可以将rna随机断裂成200bp左右的小片段。5、反转合成cdna在逆转录酶的作用下，利用随机引物，以mrna为模板反转合成一链cdna，进行二链合成时，dntps试剂中用dutp代替dttp，使cdna第二链中碱基包含a/u/c/g。6、连接adaptor双链的cdna结构为粘性末端，加入endrepairmix将其补成平末端，随后在3’末端加上一个a碱基，用于连接y字形的接头。7、ung酶消化cdna二链在pcr扩增前，用ung酶将cdna第二链消化，从而使文库中仅包含cdna第一链。8、illuminax-ten上机测序illuminax-ten测序平台，进行2*150bp测序。9、生物信息学分析测序数据获得以后的rawdata分析过程如下所示：(1)用cutadapt对reads的5’和3’段进行trim，trim掉质量<20的碱基，并且删掉n大于10％的reads；(2)tophat比对到参考基因组上。所用的参考基因组版本为grch38.p7，fasta和gff文件下载自ncbi；(3)cuffquant定量mrna的表达量并标准化输出；(4)在r环境下用degseq包比较对照组跟疾病组mrna的表达差异。显著差异mrna筛选条件：p-value<0.05。10、结果用以上标准筛选得到差异表达基因3296个，其中表达上调的基因1428个，表达下调的基因有1868个。实施例2qpcr实验验证男性骨质疏松症患者和正常男性的差异表达基因选择实施例1筛选出的gm2a基因进行大样本验证。1、研究对象：测骨密度，选择骨质疏松症男性患者30例，年龄为60-82岁；正常骨密度对照组男性30例，年龄为60-82岁。骨质疏松症患者的纳入标准：(1)符合骨质疏松症诊断标准者，参照《中国人骨质疏松症建议诊断标准(第二稿)；(2)患者均知情同意。排除标准：糖尿病、严重肝肾疾病、甲状腺疾病、内分泌疾病引起疾病的老年男性；服用过治疗骨质疏松症药的老年男性，如阿伦磷酸钠等(间断性服用小剂量钙剂除外)。2、血液总rna提取(1)前处理直接取新鲜的血液(外周血)，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，10,000rpm离心1分钟。彻底吸弃上清，收集白细胞沉淀。每100-200μl血液收集的白细胞沉淀加入1mltrizol。(2)分层a.样品加入trizol后，室温放置5min，使样品充分裂解。b.每1mltrizol加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置3-5min使其自然分相。(3)rna沉淀a.4℃12,000rpm离心10-15min。样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，rna主要在水相中，把水相(通常可吸取550μl)转移到新管中。b.在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置10-20min。4℃12,000rpm离心10min，弃上清，rna沉淀于管底。(4)rna漂洗a.rna沉淀中加入1ml75％乙醇(用rnase-free水配制)，温和振荡离心管，悬浮沉淀。每1mltrizol加入1ml75％乙醇。b.4℃5,000-8,000rpm离心1-2min，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，室温放置1-2分钟晾干沉淀。(5)溶解rna沉淀中加入50-100μlrnase-free水，轻弹管壁，以充分溶解rna，-70℃保存。3、逆转录利用takara公司的逆转录试剂盒进行rna的逆转录。4、qpcr(1)引物设计根据genbank中gm2a基因和β-actin基因的编码序列设计qpcr扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：gm2a基因：正向引物为5’-ctctgaaggtggatttagtt-3’(seqidno.3)；反向引物为5’-ctgccaatgtagtctgtg-3’(seqidno.4),β-actin基因：正向引物为5’-gcaggtcatcaccatcgg-3’(seqidno.5)；反向引物为5’-gctgtcaccttcaccgttc-3’(seqidno.6)。(2)按照表1配制pcr反应体系：其中，sybrgreen聚合酶链式反应体系购自invitrogen公司。表1pcr反应体系试剂体积正向引物1μl反向引物1μlsybrgreen聚合酶链式反应12.5μl体系模板2μl去离子水补足25μl(3)pcr反应条件：95℃10min，(95℃15s，60℃40s)*45个循环。以sybrgreen作为荧光标记物，在lightcycler荧光定量pcr仪上进行pcr反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，δδct法进行相对定量。5、结果结果如图1所示，与正常男性相比，男性骨质疏松症患者血液中gm2a基因的mrna水平显著下降，差异具有统计学意义(p<0.05)，结果同rna-seq实验。上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。sequencelisting<110>首都医科大学附属北京友谊医院<120>gm2a基因作为男性骨质疏松症诊断和预后的标志物<160>4<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1ctctgaaggtggatttagtt20<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列<400>2ctgccaatgtagtctgtg18<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列<400>3gcaggtcatcaccatcgg18<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列<400>4gctgtcaccttcaccgttc19当前第1页12