探针组合物、基因捕获芯片、试剂盒及其应用的制作方法

本发明通常涉及生物检测领域，具体地涉及探针组合物、基因捕获芯片、试剂盒及其应用。
背景技术：
：癌症是一种由人体基因发生变异导致的复杂疾病，这些基因变异会使细胞失去正常的调控功能，从而无限增殖，最终导致癌症的发生。靶向药物可以针对携带特定基因变异的肿瘤细胞进行杀伤，疗效显著。但是，对于不同的患者，其体内携带的基因变异也是千差万别的，这种差异导致了每名患者对于相同的抗肿瘤药物所表现出来的敏感性与毒副反应不尽相同。而研究发现化疗药物对肿瘤细胞的杀伤效应与特定的一种(一组)基因的表达和/或多态性显著相关；每种化疗药物均有其对应的评估靶标，靶标在不同患者体内的差异是导致化疗药物耐药以及产生毒副作用的主要原因。精准用药类基因检测产品越来越多的涌现于市场，且检测方法聚焦在外显子杂交捕获技术及第二代高通量测序技术。我们发现目前精准用药类基因检测产品存在两个问题：第一，检测方法集中在靶向用药相关基因检测，而化疗用药基因检测很少涉及；第二，针对单癌种设计的靶向用药基因检测产品只着眼于fda/cfda批准用于该癌种的药物，给予一级用药指导缺乏潜在可用药物指导性意见，可供临床医生获得的用药选择信息较少。临床存在大量化疗用药基因检测需求，且美国国立综合癌症网络(nationalcomprehensivecancernetwork，nccn)在癌症治疗中也指出在进行化疗治疗前需通过基因检测预测评估化疗疗效。早在2008年nccn乳腺癌治疗指南中建议，将21基因复发评分(rs)用于低危乳腺癌患者中选择需要接受化疗的患者。目前的化疗用药基因检测仍以传统的分子病理检测为主，而分子病理检测存在单次反应只能检测一个基因的局限性。临床化疗组合方案中通常需同时进行多个化疗药物的多个基因及位点检测，此时分子病理检测样本需求量亦会增加，无法满足全部用药相关基因检测，尤其是对于大量组织样本采集困难的肿瘤患者(如肺癌患者)。目前靶向用药基因检测产品按照癌种界限设计存在临床可用指导药物信息缺乏的局限性。根据fda/cfda已批准用于单向癌种的药物及nccn指南推荐检测的靶点进行设计，只能提供给临床医生一级用药指导信息，缺乏二级推荐使用药物指导信息，无法获得全面的治疗指导方案。如司美替尼获批用于iii期或iv期分化型甲状腺癌(dtc)患者，一项前瞻性、随机、两期临床试验表明，司美替尼联合多烯紫杉醇对晚期kras突变的非小细胞肺癌患者治疗有效。肿瘤患者的临床常规用药检测目前仍然停留在“化疗检测－化疗1—化疗2－靶向检测－靶向治疗”层级递进的“检测+治疗”模式，持续时间长，无法快速得到最佳的治疗方案，延误了最佳治疗期，且在不断的治疗方案替换过程中大大增加了治疗费用。因此，如何使用少量组织样本经过一次检测即可得到靶向、化疗用药相关基因检测结果是我们亟待解决的技术问题。技术实现要素：为了解决至少部分上述技术问题，本发明人根据临床常见的靶向药物和化疗药物，以这些靶向、化疗药物对应的基因及位点设计专用捕获目标基因的探针，并进一步开发目标基因的探针组合物。至少基于上述部分内容完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。本发明的一方面，提供探针组合物，其包括至少38条探针，且含有特异性结合至目标基因的探针，所述目标基因由靶向用药相关基因、化疗用药相关基因、预后相关基因和信号通路相关潜在用药基因组成。在某些实施方案中，所述靶向用药相关基因选自akt1、nras、braf、pdgfra、egfr、pik3ca、fgfr1、smo、fgfr2、tsc1、her2、hras、kit、kras和met；和/或所述化疗用药相关基因选自cda、ercc2、cyp19a1、gstp1、cyp2c19、mdr1、cyp2c8、mthfr、cyp2c9、nqo1、cyp2d6、rrm1、cyp3a4、tyms、dhfr、ugt1a1、dpyd、xrcc1和ercc1；和/或所述预后相关基因选自idh1和/或idh2；和/或所述信号通路相关潜在用药基因选自notch1和/或smad4。在某些实施方案中，所述探针组合物以所述探针的混合物形式提供，或者以每种所述探针独立存在的形式提供。在某些实施方案中，所述探针组合物选自序列如seqidno:1-73所示的核苷酸组成的组。本发明的另一方面，提供基因捕获芯片，其包括固相载体和固定在所述固相载体上的探针的点阵，其中所述探针选自本发明所述的探针组合物。本发明的再一方面，提供基因捕获试剂盒，其包括本发明的探针组合物。本发明的又一方面，提供基因捕获方法，其包括：构建样本全基因组dna文库；与根据权利要求1至4任一项所述的探针组合物杂交；洗脱非目标基因的dna片段，获得所述目标基因的dna片段。在某些实施方案中，所述全基因组dna文库中dna片段的大小为245-325bp。本发明的其他方面，提供非诊断性检测方法，其包括使用本发明的探针组合物或本发明的基因捕获芯片或本发明的基因捕获试剂盒的步骤；或者以本发明的基因捕获方法作为步骤。本发明包含了临床常见靶向化疗药物对应的目标基因及位点，涵盖了市场上常见的传统分子病理检测项目。利用本发明特异性结合至目标基因的探针组合物，用少量的样本，通过高通量测序平台实现高深度测序，可以一次性平行检测多个化疗药物基因多态性及靶向用药相关基因变异形式，例如点突变、插入/缺失或dna拷贝数改变。为临床医生提供真正意义上的“有选择”，一次检测即可获得更适用的治疗方案且更大程度上为患者节省了治疗费用。附图说明图1是本发明其中一个实施例中的操作流程图；图2是本发明其中一个实施例中序列的测序深度分布图；图3是本发明其中一个实施例中序列的测序深度分布图；图4是本发明其中一个实施例中序列的测序深度分布图；图5是本发明其中一个实施例中序列的测序深度分布图；图6是本发明其中一个实施例中序列的测序深度分布图；图7是本发明其中一个实施例中序列的测序深度分布图；图8是本发明其中一个实施例中序列的测序深度分布图；图9是本发明其中一个实施例中序列的测序深度分布图；图10是本发明其中一个实施例中序列的测序深度分布图；图11是本发明其中一个实施例中序列的测序深度分布图；图12是本发明其中一个实施例中序列的测序深度分布图；图13是本发明的实施例中目标区域序列占比均值的柱状分布图。具体实施方式现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限值以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。本发明中，名词术语既包括单数形式，也包括复数形式，除非上下文另行明确指出。本发明中所述的“至少一种”不仅仅指包含“一个”或“一种”的情况，更重要的还包含“多个”或“多种”的情况。本发明中，术语“探针组合物”(本文有时简称“组合物”)是指多探针的组合形式，包括多探针的混合物，或者多探针中每种探针以单独独立的形式存在。在某些实施方案中，混合物包括但不限于多探针的溶液混合物，或多探针的粉末混合物。其中溶液的实例包括水溶液或有机物溶液(例如乙醇)或两者的组合。粉末混合物包括两种探针的固体混合/混匀物。在某些实施方案中，探针组合物以单独独立的形式存在。例如每种探针固定/结合于例如基材的特定区域(例如)，所述各特定区域规则地汇集于所述基材上从而构成阵列。在某些实施方案中，探针组合物中每种探针以单独存在于特定的容器(例如，小瓶)中的形式存在。在某些实施方案中，在组合物中至少包括针对每个目标基因的一条探针。组合物包括特异性结合至靶向治疗基因靶点、化疗治疗基因靶点、预后基因靶点和信号通路基因靶点的探针。优选地，在组合物中在至少包括针对每个目标基因的一条探针的基础上，在组合物中针对某个目标基因或某些目标基因存在多条探针，例如针对akt1基因，存在一条探针，针对braf基因，存在19个与其特异性结合的探针，针对cyp2c19基因，存在2条探针。本发明中，术语“严格条件”是指探针与针对其他序列相比，以比能够检测更大的程度(例如背景测定值的平均+背景测定值的标准误差×2以上的测定值)与其目标序列杂交的条件。严格条件是序列依赖性的，根据进行杂交的环境不同而不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定出对探针为100％互补性的目标序列。在某些实施方案中，严格条件是指5×ssc，50％甲酰胺和42℃下的核酸杂交条件。在某些实施方案中，严格条件是指高严格条件，即对于长度为至少100个核苷酸的探针，遵循标准dna印迹程序，在42℃下在5×ssc、0.3％sds、200微克/ml剪切并变性的鲑精dna和50％甲酷按中预杂交和杂交12至24/小时。材料最终使用0.2×ssc、0.2％sds，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。本发明中，术语“包括”是指探针组合物包括特异性结合至上述目标基因的探针，还指探针组合物由特异性结合至上述目标基因的探针组合。本发明中，术语“特异性结合”是指在严格条件下探针与目标基因而不与其他核苷酸序列杂交或者互补结合；每个探针与其相对应的目标基因或者目标基因的靶向区域通过核苷酸序列互补的方式结合。本发明中，靶向用药和/或化疗用药是指fda/cfda已批准用于单向癌种的药物。靶向用药的实例包括，但不限于曲妥珠单抗、西妥昔单抗、帕妥珠单抗、帕尼单抗、吉非替尼、克唑替尼、阿法替尼、卡博替尼、威罗非尼等；化疗药物的实例包括，但不限于铂类、蒽环类、氟尿嘧啶、依托泊苷、长春碱类、环磷酰胺、甲氨蝶呤、培美曲塞、来曲唑等。本发明中，与目标基因特异性结合的探针，其中所述目标基因具体是指与靶向用药和化疗用药相关的基因，具体地，是指与靶向用药和化疗用药相关的基因靶点，其中，靶向用药相关的基因的靶点存在点突变(含缺失和插入变异)、拷贝数变等类型，化疗用药相关的基因靶点存在单核苷酸多态性、dna片段长度多态性和dna重复序列多态性。在某些实施方案中，目标基因如下表所示。在某些实施方案中，本发明的目标基因和相关的靶点信息如下表所示：表1基因及相关靶点信息本发明所述的探针组合物为特异性结合至至少38个目标基因的探针的组合，其与全基因组dna杂交，捕获与探针特异性结合的dna片段，即38个目标基因的dna片段。在使用少量的样本得到多个基因片段，对于多个基因片段进行检测，基于目标基因区域捕获的dna二代测序法对靶向化疗用药相关基因设计专用捕获探针，通过高通量测序平台实现高深度测序，可以一次性平行检测化疗药物基因多态性及靶向用药相关基因中包括点突变，插入/缺失，dna拷贝数改变等多种变异形式，从而一次性检出所有与靶向化疗治疗相关的靶点基因变异。因此为临床医生提供真正意义上的“有选择”，一次检测即可获得更适用的治疗方案且更大程度上为患者节省了治疗费用。实施例在没有特别说明的情况下，本发明中使用的任何试剂均为市场购买的一般试剂。血液样本来自协和医院收集的样本。1.构建全基因组dna文库2.利用探针组合物捕获全基因组dna文库中的目标基因；2.1混合blockingoligos、cot-1及上述已经混合均匀的dna文库，体系见下表2：表22.2、将上述混合液震荡混匀并打开ep管盖，于60℃真空浓缩仪中浓缩蒸发至干粉状态。真空浓缩仪设置为60℃，15min。15min后查看混合物蒸干状态，若尚有未蒸干液体，继续进行60℃，15min蒸干，避免过分干燥。注：已蒸干成干粉状态的ep管可在室温过夜保存，注意封闭管盖，以防粉末飞出。2.3捕获试剂所需试剂准备a将所需试剂(按下表)从冷冻冰箱中找出室温解冻。b向上述已经蒸干的ep管中依次加入以下表3试剂：表3xgen2×hybridizationbuffer(蓝盖)8.5ulxgenhybridizationbufferenhancer(棕褐色)1.7ulnuclease-freewater1.8ul共计13ul室温孵育10min；c充分震荡混匀上述ep管中的液体，并转移至0.2mlpcr管中，并在proflexpcr仪中block1上设置并运行以下程序：“95℃，forever”。将pcr管置于block1中计时10min。(期间准备好捕获探针)d、c中10min过程未进行完毕时，proflexpcr仪block2设置并运行以下表4程序。c中过程计时结束，取下block1上pcr管并立即加入4ul探针组合物。充分混匀并离心，立即置于block2中：计时4h。表4程序pcr仪热盖状态65℃，foreverpcr仪热盖75℃闭盖2.4非特异片段洗脱与磁珠准备(杂交反应结束前1.5h开始准备试剂)：a从冰箱(冷冻)取出下表中的洗脱液解冻，并从4℃取出m270磁珠，充分震荡混匀；b按照表5配置1×洗脱工作液(洗脱液需现用现配，可杂交反应结束前2h前进行洗脱液准备)；注：若xgen10×washbuffer1在解冻后出现絮状沉淀，可用65℃金属浴加热至絮状沉淀消失。表5浓缩洗脱buffer浓缩buffer(ul)无核酸酶的水(ul)xgen2×beadwashbuffer250250xgen10×washbuffer130270xgen10×washbuffer220180xgen10×washbuffer320180xgen10×stringentwashbuffer40360c对于已经配置好的1×washbuffer1和stringentwashbuffer工作液，需按下表创建不同温度的工作液(即stringentwashbuffer工作液要65摄氏度金属浴预热0.5h，washbuffer1工作液分为65℃预热0.5h的工作液和常温工作液)。表6为1次捕获用量，请根据捕获次数适量配备。表6d再次充分震荡m270磁珠，并向1.5mlep管中加入100ulm270磁珠。并将ep管置于磁力架上。e2-5min后，待磁珠吸附到磁力架上，弃上清。并加入200ul1×beadwashbuffer，从磁力加上取下ep管，震荡混匀10s，再次将ep管置于磁力架上。f重复e一次(用200ul1×beadwashbuffer再次洗涤dynabeadsm270链霉亲和素磁珠)。g2-5min后，待磁珠吸附到磁力架上，弃上清。加入100ul1×beadwashbuffer，涡旋混匀，并转移至0.2mlpcr管中。h杂交完毕前5min将0.2mlpcr管置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上清。2.5m270磁珠吸附杂交目的片段：a杂交完成前1min，将h中准备好的m270磁珠置于block2中65℃孵育。b杂交完毕，从block2中取出杂交反应液并迅速转移至已预热的m270磁珠中，震荡混匀。c将b中的pcr管再次置于proflexpcr仪block2中，计时45min。d65℃孵育过程中，每8min震荡混匀一次，确保m270磁珠处于重悬状态。2.6洗涤m270磁珠，洗脱非杂交片段(使用1×洗涤buffer)：a65℃洗涤(快速操作，保证温度接近于65℃)：将3.3中孵育完毕的pcr管中液体立即转移至金属浴预热的1×washbuffer1中，涡旋混匀，简单离心，置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上清。b65℃洗涤(快速操作，保证温度接近于65℃)：向其中加入200ul预热的stringentwashbuffer工作液，涡旋混匀，简单离心并65℃孵育5min，置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上清。c重复b一次。d室温洗涤：向c中的beads中加入200ul室温的1×washbuffer1，涡旋混匀，简单离心，置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上清。e室温洗涤：向上述beads中加入200ul1×washbuffer2，涡旋混匀，简单离心，置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上清。f室温洗涤：向上述beads中加入200ul1×washbuffer3，涡旋混匀，简单离心，置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上清。g重悬beads：从磁力架上取下含beads的ep管，加入21.5ul无核酸酶的水。涡旋震荡混匀，加入到以下pcr反应液中(带磁珠进行pcr反应).3.捕获后pcr3.1捕获后pcr反应液配置，如表7表72×kapahifihotstartreadymix25ul10umilluminap5primer(illuminaprimera)1.25ul10umilluminap7primer(illuminaprimerb)1.25ul上述g中带磁珠的产物21.5ul共计50ul3.2震荡混匀后，进行如下程序pcr(proflexpcr仪)，具体程序如表8所示。表83.3捕获后pcr产物纯化：a向新的ep管中加入已在室温平衡0.5h的45ulxpbeads。b将pcr产物从pcr仪中取出混合均匀后加入到含45ulxpbeads的ep管中(0.9×)，震荡混合均匀，室温孵育5min。c孵育完将混合产物置于磁力架上，待上清与磁珠完全分离开，弃上清。d向管内加入200ul新鲜配置的80％的乙醇洗涤磁珠1min，弃上清(乙醇)。e重复步骤d一次。e室温或37℃干燥磁珠。f待磁珠干燥后加入23ul水，震荡混匀vortex，室温静置5min。g置于磁力架上，待磁珠与上清完全分离，吸取上清22ul于一新的ep管中，标明样本名称、文库类型、建库日期、index/barcode等信息。4.验证对本发明所述的探针组合物和芯片所对应的序列进行序列深度和目标区域序列占比检验，分别对本发明所述的探针组合物或芯片与样本1至样本11中的目标基因特异性结合，然后对目标基因对应序列进行高通量测序，并对测序结果进行测序深度分布检测，结果如图2至图12所示，样本1的序列深度约为1000x，样本2的序列深度约为200x，样本3的序列深度约为600x，样本4的序列深度约为400-700x，样本5的序列深度约为500x，样本6的序列深度约为400x，样本7的序列深度约为300x，样本8的序列深度约为600x，样本9的序列深度约为400x，样本10的序列深度约为800x，样本11的序列深度约为500x，说明本发明所述的探针组合物和芯片所对应的序列覆盖均一。同时，对测序结果的目标区域序列占比检测，结果如图12所示，从样品1至样品11中的目标区域序列占比均为至40％，证明本发明所述的探针组合物和芯片序列对目标基因序列的捕获效率高。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。sequencelisting<110>元码基因科技（北京）有限公司<120>探针组合物、基因捕获芯片、试剂盒及其应用<130>1700351cn<160>73<170>patentinversion3.3<210>1<211>120<212>dna<213>人工合成<400>1cgcttgctcccaatcacaggagaaggaggaggtggaggaggagggctgcttgaggaagta60taagaatgaagttgtgaagctgagattcccctccattgggaccggagaaaccaggggagc120<210>2<211>120<212>dna<213>人工合成<400>2cccacagtacccctgccctctgagactgatggctacgttgcccccctgacctgcagcccc60cagcctggtatggagtccagtctaagcagagagactgatgggcaggggaggtgggacctt120<210>3<211>120<212>dna<213>人工合成<400>3ggcacgccgcggcgccggggcctccgcagggcgatggagcccggtctgcaaggaaagtga60ggcgccgccgctgcgttctggaggaggggggcacaaggtctggagaccccgggtggcgga120<210>4<211>119<212>dna<213>人工合成<400>4cacaaggtctggagaccccgggtggcggacgggagccctccccccgccccgcctccgggg60caccagctccggctccattgttcccgcccgggctggaggcgccgagcaccgagcgccgc119<210>5<211>120<212>dna<213>人工合成<400>5ggaggcgatagtggatagtagaagagagcacacattgcctcactgaagtggctgcacgta60tctgagtcctgtagctactgttttatctctgtttcttaaaagtatgcttttaaaaagatt120<210>6<211>120<212>dna<213>人工合成<400>6aataaaacgtctctcttcccttctttcaggaatacttggacctcagccaacctctcgaac60agtattcacctagttaccctgacacaagaagttcttgttcttcaggagatgattctgttt120<210>7<211>120<212>dna<213>人工合成<400>7agggacctgccagcgacatgtctttccccacaatcatactgctgacatacagtcggaggt60tcactgcatattctccccacagatagaagagcccagccagtgtcctgactgtgtggtgag120<210>8<211>120<212>dna<213>人工合成<400>8caatccaaatattgccgtttcataaatgtaataagtaatactaattcacagagtattgta60aatggtggatgacaaaagaaaatctgctctgtggaaagaaagaactgtctctaccagggt120<210>9<211>120<212>dna<213>人工合成<400>9tgtgaccattccggtttggttctcccgagaggtaaagaacgaagacttcaaagacacttt60cttcactggtcagctcctccccccacatcttcagcagctcctccttgggggacttgctct120<210>10<211>120<212>dna<213>人工合成<400>10ccttcacaaagcggaagaatgtgtcagcctcaaagaaaagctgcgtgatgatgaaatcgg60ctcccgcagacaccttctccttcaagtgcttcaggtcagcctcaaagctccctgcttcgg120<210>11<211>120<212>dna<213>人工合成<400>11cctgcaccctgaagcctgagtgtgtccagcagctgctggtttgctcccaggaggccaaga60agtcagcctactgcccctacagtcactttcctgtgggggctgccctgctcacccaggagg120<210>12<211>120<212>dna<213>人工合成<400>12ggtagccagaatcattacaggtcatgtagcatttaccacagttgatacacatttcttcat60caatcatagccacaacttgctctacgttgctcaattcaccaaatgttccaaggtactgca120<210>13<211>120<212>dna<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