TSLP单克隆抗体及其制备方法和应用与流程

本申请总体涉及免疫学领域，具体而言，本申请涉及抗胸腺基质淋巴细胞生成素(tslp)的抗体或其抗原结合部分，编码所述抗体或其抗原结合部分的核酸，包含所述核酸的表达载体，包含所述表达载体的宿主细胞，包含所述抗体或其抗原结合部分的组合物、制备所述抗体或其抗原结合部分的方法，利用所述抗体或其抗原结合部分检测tslp的存在或含量的方法，包含所述抗体或其抗原结合部分的检测试剂盒以及所述抗体或其抗原结合部分、所述核酸、所述表达载体或所述组合物在制备用于免疫系统相关疾病或肿瘤疾病的诊断、治疗追踪和/或预后检查的试剂盒中的用途。

发明背景

tslp是一种诱导树突细胞介导的cd4+t细胞应答的免疫细胞因子，其中由tslp活化的前同种异体表型树突细胞(dc)在变应性炎性th2和肥大细胞应答的诱导和维持中起重要作用，这通过前变应原的细胞因子、趋化因子和共刺激分子的生成而实现，它们指导原初t细胞变成th2细胞，生成变应性炎症的il-4、il-5和il-13关键介质。tslp在特应性皮炎(atd)、内瑟顿综合征和哮喘中的过表达，指示该细胞因子在这些变应性炎性疾病的发病机制中的重要作用。这得到动物模型的支持，在所述动物模型中，tslp在皮肤或肺中的转基因过表达以及通过tslp的负调节子的基因靶效应的去除会导致与人特应性皮炎或哮喘非常类似的变应性炎性疾病。

因此，制备出能够特异性识别和结合tslp的单克隆抗体在对涉及tslp的疾病的诊断、治疗、预后等方面均有重要意义。

发明概述

本申请中提供了一种能够特异性识别和结合tslp的抗体或其抗原结合部分，编码所述抗体或其抗原结合部分的核酸，包含所述核酸的表达载体，包含所述表达载体的宿主细胞，包含所述抗体或其抗原结合部分的组合物、制备所述抗体或其抗原结合部分的方法，利用所述抗体或其抗原结合部分检测tslp的存在或含量的方法，包含所述抗体或其抗原结合部分的检测试剂盒以及所述抗体或其抗原结合部分、所述核酸、所述表达载体或所述组合物在制备用于免疫系统相关疾病或肿瘤疾病的诊断、治疗追踪和/或预后检查的试剂盒中的用途，具体内容如下。

第一方面，本申请提供了抗胸腺基质淋巴细胞生成素(tslp)的抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区，其中所述重链可变区包含seqidno：1所示的hcdr-1、seqidno：2所示的hcdr-2和seqidno：3所示的hcdr-3。

在一些实施方案中，抗tslp的抗体或其抗原结合部分还包含轻链可变区，所述轻链可变区包含seqidno：4所示的lcdr-1、seqidno：5所示的lcdr-2和seqidno：6所示的lcdr-3。

在一些实施方案中，抗tslp的抗体或其抗原结合部分包含seqidno：7所示的重链可变区。

在一些实施方案中，抗tslp的抗体或其抗原结合部分还包含seqidno：8所示的轻链可变区。

在一些实施方案中，抗原结合部分是fab片段、fab'片段、f(ab')2片段、fv片段、sc-fv和双体。

在一些实施方案中，重链可变区和轻链可变区均包含框架区，并且所述框架区是人源化的。

在一些实施方案中，抗tslp的抗体还包含恒定区，并且所述恒定区是人源化的。

在一些实施方案中，抗tslp的抗体或其抗原结合部分阻断tslp介导的活性。在优选的实施方案中，抗tslp的抗体或其抗原结合部分通过阻断tslp与tslpr的结合而阻断tslp介导的活性。

第二方面，本申请提供了分离的核酸，其编码第一方面所述的抗体或其抗原结合部分中的重链可变区。

第三方面，本申请提供了分离的核酸，其编码第一方面所述的抗体或其抗原结合部分中的轻链可变区。

第四方面，本申请提供了表达载体，其包含第二方面所述的分离的核酸和第三方面所述的分离的核酸。

第五方面，本申请提供了宿主细胞，其包含第四方面所述的表达载体。

第六方面，本申请提供了生产多肽的方法，其包括：在表达核酸序列的条件下，在培养基中培养第五方面所述的宿主细胞，从而生产包含轻链和重链可变区的多肽；和从所述宿主细胞或培养基回收所述多肽。

第七方面，本申请提供了组合物，其包含第一方面所述的抗体或其抗原结合部分以及药学上可接受的载体或赋形剂。

第八方面，本申请提供了检测受试者样品中tslp的存在或含量的方法，其包括提供第一方面所述的抗体或其抗原结合部分。

在一些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，优选人。

第九方面，本申请提供了检测受试者样品中的胸腺基质淋巴细胞生成素(tslp)的试剂盒，其包含第一方面所述的抗体或其抗原结合部分。

在一些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，优选人。

第十方面，本申请提供了第一方面所述的抗体或其抗原结合部分、第二方面或第三方面所述的分离的核酸、第四方面所述的表达载体、或第七方面所述的组合物在制备用于免疫系统相关疾病或肿瘤疾病的诊断、治疗追踪和/或预后检查的试剂盒中的用途。

在一些实施方案中，所述免疫系统相关疾病选自炎性和变应性炎症疾病。

在一些实施方案中，所述炎性和变应性炎症疾病选自过敏性哮喘、过敏性皮炎、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、特应性皮炎纤维变性和炎性肠病。

在一些实施方案中，所述肿瘤疾病选自霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤和肺癌。

附图简要说明

图1为构建的mbp-tslp-his表达载体的质粒图谱。

图2显示了mbp-tslp-his融合蛋白在宿主菌中小量诱导表达的情况。

图3显示了mbp-tslp-his融合蛋白在宿主菌中的表达形式。

图4显示了sds-page检测mbp-tslp-his融合蛋白的纯化结果。

图5显示了western印迹检测mbp-tslp-his融合蛋白的纯化结果。

图6显示了通过western印迹证实了免疫后的小鼠体内产生了tslp特异性的抗体。

图7显示了通过western印迹筛选到了分泌tslp单克隆抗体的杂交瘤细胞系。

图8显示了通过western印迹检测分泌tslp单克隆抗体的杂交瘤的三次亚克隆的结果。

图9显示了单克隆抗体类别检测的结果。

图10显示了杂交瘤上清和腹水效价的检测结果。

图11显示了通过sds-page和western印迹分析纯化抗体的结果。

图12显示了对分离的单克隆抗体h、k链可变区测序的结果(图12a为k链的测序结果，图12b为h链的测序结果)。

发明详述

本申请的发明人通过杂交瘤技术获得了一种高效价的抗tslp的单克隆抗体，这将会对涉及tslp的疾病的诊断、治疗和预后大有帮助。

除非另外指明，否则本发明的实施将采用本领域常规的分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学以及免疫学技术。

除非另外指明，否则本申请中所用的术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。

第一方面，本申请提供了抗胸腺基质淋巴细胞生成素(tslp)的抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区，其中所述重链可变区包含seqidno：1所示的hcdr-1、seqidno：2所示的hcdr-2和seqidno：3所示的hcdr-3。

在一些实施方案中，抗tslp的抗体或其抗原结合部分还包含轻链可变区，所述轻链可变区包含seqidno：4所示的lcdr-1、seqidno：5所示的lcdr-2和seqidno：6所示的lcdr-3。

在一些实施方案中，抗tslp的抗体或其抗原结合部分包含seqidno：7所示的重链可变区。

在一些实施方案中，抗tslp的抗体或其抗原结合部分还包含seqidno：8所示的轻链可变区。

在一些实施方案中，抗原结合部分是fab片段、fab’片段、f(ab’)2片段、fv片段、sc-fv和双体。

在一些实施方案中，重链可变区和轻链可变区均包含框架区，并且所述框架区是人源化的。

在一些实施方案中，抗tslp的抗体还包含恒定区，并且所述恒定区是人源化的。

本申请中所用的抗原为融合蛋白，其从n端至c端依次为麦芽糖结合蛋白(mbp)标签、tslp和组氨酸(6×his)标签的融合蛋白。

在为纯化目的大量表达蛋白时，由于很多目的蛋白通常以包涵体的形式表达，使得后期的纯化需要进一步的变性和复性，不仅影响纯化的蛋白的纯度，还可能影响得到的蛋白的生物学性质。因而需要尽量使目的蛋白以可溶的形式表达。尽管本领域已知可以通过选用特定的表达菌株、与分子伴侣共表达、降低目的蛋白诱导表达的温度、调整诱导剂浓度等一系列方法提高重组蛋白的可溶性，却并不总是有效。发明人发现，选择将目的蛋白与mbp标签连接构建融合蛋白，能够实现目的蛋白的可溶性表达。

mbp(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白大小为40kda，由大肠杆菌k12的male基因编码。mbp可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性。mbp标签融合蛋白可通过交联淀粉亲和层析一步纯化，结合的融合蛋白可用10mm麦芽糖在生理缓冲液中进行洗脱，对重组蛋白进行分离纯化。但是由于在蛋白表达过程中，mbp空标签蛋白的大量表达，使得利用交联淀粉亲和层析时纯化得到的是mbp蛋白和mbp与目的蛋白的融合蛋白的混合物，而难以将mbp蛋白和mbp蛋白与目的蛋白的融合蛋白分离，因此发明人进一步将mbp-目的蛋白的融合蛋白添加组氨酸标签以利于融合蛋白的纯化，所述融合蛋白中双标签与目的蛋白的排列顺序由n端至c端依次为mbp标签、目的蛋白和组氨酸标签，从而使得副产物mbp和mbp-目的蛋白均不与金属离子亲和层析树脂结合。

tslp(胸腺基质淋巴细胞生成素)是由上皮细胞衍生的细胞因子。其最初被鉴定为由胸腺基质分泌的分子，在t细胞和b细胞发育中发挥作用。而近年来tslp在胸腺外的一些作用也被鉴定出。已有研究证明tslp介导癌细胞和免疫系统之间的交叉对话。肿瘤细胞或癌症相关成纤维细胞产生了tslp，而tslp又促进了未成熟树突状细胞(idc)的成熟，并通过单核细胞来源的树突状细胞(modc)促进了ccl17、ccl22及ox40配体的产生。因此tslp在免疫调节中发挥重要作用，可将其用于tslp免疫系统相关疾病的诊断、治疗追踪和/或预后检查中。

本文所用的术语“抗体”是指能显示期望的生物活性的任何形式的抗体或其片段。因此，它以最广义的含义使用，具体覆盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们能显示期望的生物活性。

本文所用的术语“抗tslp抗体的抗原结合部分”或者“其抗原结合部分”包括抗体的基本上保留其抑制tslp活性的生物活性的片段或衍生物。因此，术语“其抗原结合部分”指全长抗体的一部分，通常是其抗原结合区或可变区。抗原结合部分的实例包括：fab片段、fab’片段、f(ab’)2片段、fv片段、双体、单链抗体分子如sc-fv以及从抗体片段形成的多特异性抗体。通常，抗原结合部分或衍生物保留其tslp抑制活性的至少10％。优选地，抗原结合部分或衍生物保留其tslp抑制活性的至少25％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％(或更多)。还认为，抗tslp抗体的抗原结合部分可包括不会实质上改变其生物活性的保守氨基酸置换。

“fab片段”包含一条轻链以及一条重链的ch1和可变区。fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。

“fab’片段”含有一条轻链以及一条重链的部分或片段，所述部分或片段含有vh结构域和ch1结构域以及在ch1和ch2结构域之间的区域，使得在2个fab’片段的两条重链之间可以形成链间二硫键，以形成f(ab’)2分子。

“f(ab’)2片段”含有两条轻链和两条重链，所述重链含有在ch1和ch2结构域之间的恒定区的一部分，使得在两条重链之间形成链间二硫键。f(ab’)2片段因而由两个fab’片段组成，而两个fab’片段通过两条重链之间的二硫键连接在一起。

“fv片段”包含来自重链和轻链的可变区，但是缺少恒定区。

“单链fv”或“scfv”，是指包含抗体的vh结构域和vl结构域的抗体片段，其中这些结构域以单一多肽链形式存在。通常，fv多肽还包含vh结构域和vl结构域之间的多肽接头，所述接头使scfv能够形成期望的结构以进行抗原结合。

“双体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段在同一多肽链中包含重链可变结构域(vh)和与之连接的轻链可变结构域(vl)(vh-vl或vl-vh)。通过使用短得不能让同一链上的两个结构域之间发生配对的接头，各结构域被迫与另一条链的互补结构域发生配对，从而产生两个抗原结合位点。

“人源化抗体”指含有非人(例如鼠)抗体的序列以及人抗体的序列的抗体形式。这种抗体含有最小限度的衍自非人免疫球蛋白的序列。一般来说，人源化抗体包含至少一个、通常两个可变结构域，其中超变区对应于非人免疫球蛋白，而fr区是人免疫球蛋白序列的。人源化抗体任选还会包含免疫球蛋白恒定区(fc)的至少一部分，所述恒定区通常是人免疫球蛋白的恒定区。啮齿动物抗体的人源化形式，通常会包含亲本啮齿动物抗体的cdr序列，不过可包括某些氨基酸置换，以提高亲和力或增加人源化抗体的稳定性。

“超变区”指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。超变区包含来自“互补决定区”或“cdr”的氨基酸残基(例如轻链可变结构域中的残基24-34(lcdr-1)、50-56(lcdr-2)和89-97(lcdr-3)和重链可变结构域中的残基31-35(hcdr-1)、50-65(hcdr-2)和95-102(hcdr-3)；kabat等人,(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版,publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.，和/或来自“超可变环”的氨基酸残基(即轻链可变结构域中的残基26-32(l1)、50-52(l2)和91-96(l3)和重链可变结构域中的残基26-32(h1)、53-55(h2)和96-101(h3)；chothia和lesk,(1987)j.mol.biol.196:901-917。“框架区”或“fr”残基，是指本文定义为cdr残基的超变区残基之外的那些可变结构域残基。

在一些实施方案中，抗tslp的抗体或其抗原结合部分会阻断tslp介导的活性。在优选的实施方案中，抗tslp的抗体或其抗原结合部分通过阻断tslp与tslpr的结合而阻断tslp介导的活性，

“tslpr”是胸腺基质淋巴细胞生成素受体的简称，其属于造血细胞因子受体家族，能够通过与tslp的相互作用介导tslp的活性。

第二方面，本申请提供了分离的核酸，其编码第一方面所述的抗体中的重链可变区。

第三方面，本申请提供了分离的核酸，其编码第一方面所述的抗体中的轻链可变区。

第四方面，本申请提供了表达载体，其包含第二方面所述的核酸和第三方面所述的核酸。

第五方面，本申请提供了宿主细胞，其包含第四方面所述的表达载体。

第六方面，本申请提供了生产多肽的方法，其包括：在表达核酸序列的条件下，在培养基中培养第五方面所述的宿主细胞，从而生产包含轻链和重链可变区的多肽；和从所述宿主细胞或培养基回收所述多肽。

为了重组生产本申请中的抗体，分离出分别编码重链和轻链的核酸，并插入一个或多个可复制的载体中，用于进一步克隆dna的扩增或表达。使用常规方案(例如通过使用能够与编码抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)易于分离并测序编码单克隆抗体的dna。许多载体是可用的。载体组分一般包括、但不限于信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。在一个实施方案中，本申请中的抗tslp的抗体的轻链和重链这两者由同一载体(例如质粒或腺病毒载体)表达。

本申请的抗体和其抗原结合片段可以通过本领域已知的任何方法生产。在一个实施方案中，抗体在培养的哺乳动物或昆虫细胞中表达，例如中国仓鼠卵巢(cho)细胞、人胚肾(hek)293细胞、小鼠骨髓瘤nso细胞、幼仓鼠肾(bhk)细胞。

第七方面，本申请提供了组合物，其包含第一方面所述的抗体或其抗原结合部分以及药学上可接受的载体或赋形剂。

第八方面，本申请提供了检测受试者的样品中胸腺基质淋巴细胞生成素(tslp)的存在或含量的方法，其包括提供第一方面所述的抗体或其抗原结合部分。

在一些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，优选人。

第九方面，本申请提供了检测受试者样品中的胸腺基质淋巴细胞生成素(tslp)的试剂盒，其包含第一方面所述的抗体或其抗原结合部分。

在一些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，优选人。

第十方面，本申请提供了第一方面所述的抗体或其抗原结合部分、第二方面或第三方面所述的分离的核酸、第四方面所述的表达载体、或第七方面所述的组合物在制备用于免疫系统相关疾病或肿瘤疾病的诊断、治疗追踪和/或预后检查的试剂盒中的用途。

在一些实施方案中，所述免疫系统相关疾病选自炎性和变应性炎症疾病。

在一些实施方案中，所述炎性和变应性炎症疾病选自过敏性哮喘、过敏性皮炎、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、特应性皮炎纤维变性和炎性肠病。

在一些实施方案中，所述肿瘤疾病选自霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤和肺癌。

实施例

提供以下实施例仅仅是对本申请的一些实施方案进行举例说明，没有任何限制的目的或性质。以下实施例中所用的实验方法，如果没有详细描述，均为本领域内常规的技术。

实施例1：tslp抗原的制备

mbp-tslp-his原核表达载体的构建和蛋白纯化

mbp-tslp-his原核表达载体的构建

利用如下扩增体系和pcr程序来扩增mbp-tslp-his片段。

pcr扩增体系：primerstar，25μl；mbp-tslp-his-f，1μl；mbp-tslp-his-r，1μl；pbmccdna，2μl；将扩增体系补足至50μl。其中pbmccdna由人外周血分离的pbmc提取的rna反转录获得，外周血样品由本公司健康志愿者提供。

pcr程序：98℃，5min；98℃，10s；55℃，5s；72℃，5s；共30个循环。之后72℃延伸10min。

所用的引物序列为：

mbp-tslp-his-f：5’-cgcggatccatgtacgacttcactaac-3’

(bamhi酶切位点)(seqidno：15)

mbp-tslp-his-r：5’-cgaagcttttagtggtggtggtggtggtgctgttgtttcagtaaaggtcg-3’(hindiii酶切位点)(seqidno：16)

将得到的pcr产物凝胶电泳回收。然后采用下述酶切体系将pcr产物和表达载体pmal-c2x(本载体由本实验室保存)酶切过夜：smartcut缓冲液，5μl；bamhi-hf，1μl；hindiii-hf，1μl；pcr产物/pmal-c2x，25μl；ddh2o，18μl。凝胶电泳回收酶切后的pcr产物和表达载体。随后按下述连接体系将pcr产物与表达载体16℃连接3h：t4dna连接酶缓冲液，2μl；t4dna连接酶，1μl；pcr酶切产物，12μl；pmal-c2x酶切产物，5μl。

将连接产物转化dh5α宿主菌(本菌株由本实验室保存)。

将获得的重组克隆进行pcr验证和酶切验证。

挑取平板上的单菌落于lb(amp50mg/l)液体培养基中过夜摇瓶培养(转速200rpm，温度37℃)。取培养后的菌液进行pcr验证。pcr体系为：primerstar，10μl；mbp-tslp-his-f，1μl；mbp-tslp-his-r，1μl；菌液，1μl；将反应体系补足至20μl。采用的pcr程序为：98℃，5min；98℃，10s；55℃，5s；72℃，5s，共30个循环。之后72℃延伸10min。将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，利用阳性pcr条带确定阳性克隆。

将得到的菌液提取重组质粒，并利用下述体系将重组质粒酶切过夜：smartcut缓冲液，5μl；bamhi-hf，1μl；hindiii-hf，1μl；质粒，8μl；ddh2o，35μl。将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，利用阳性pcr条带确定阳性克隆。

获得的阳性克隆的质粒图谱如图1所示。

mbp-tslp-his融合蛋白的纯化

mbp-tslp-his融合蛋白的小量诱导表达：

将构建好的载体转化原核表达菌株dh5α，挑取划线平板上的单菌落于lb(100mg/l，amp)液体培养基中，过夜摇菌。取过夜菌液按1:100的比例接种于新的20ml液体lb(100mg/l，amp)中。待菌液od600达到0.6时，加入100μl葡萄糖(40％)和6μl1miptg(iptg终浓度为0.3mm)进行诱导，诱导条件为37℃，250rpm，诱导3h。取1ml菌液样品。将菌液样品13000rpm离心1min以收集菌体，弃上清后加入100ml1×上样缓冲液。剧烈震荡重悬菌体后，沸水10min，冰浴5min，4℃13000rpm离心1min，取未诱导的对照和诱导后的菌体电泳检测是否表达目的蛋白。结果如图2所示，结果显示加入终浓度为0.3mm的iptg后能够诱导目的蛋白mbp-tslp-his的表达。

mbp-tslp-his融合蛋白的大量诱导表达

将鉴定好的菌株划线于lb(100mg/l，amp)平板上，挑取单克隆于10mllb(100mg/l，amp)液体培养基中过夜培养，第二天以1:100的比例转接至330ml新的lb(100mg/l，amp)培养基中，培养至od600nm为0.6时，加入1.65ml葡萄糖(40％)和99μl(终浓度0.3mm)1miptg，16℃诱导20h。每330ml菌液收集为1管，4℃，4700rpm离心8min收集菌体，-80℃冻存。

用50mlmcac-0缓冲液(tris·hcl(ph8.0)，20mm；nacl，500mm；甘油10％(v/v))充分悬浮，依次加入1/100体积的10％tritonx-100和0.1mpmsf，超声5s，间隔5s，共超声20min，直至液体澄清。20,000g，4℃离心20min后取上清，用0.45μm滤膜过滤除菌作为样品。将离心后的上清和沉淀进行电泳，检测mbp-tslp-his融合蛋白的表达情况。结果如图3所示，结果显示mbp-tslp-his融合蛋白主要以可溶的形式表达。

mbp-tslp-his蛋白纯化

用50mlmcac-0缓冲液(tris·hcl(ph8.0)，20mm；nacl，500mm；甘油10％(v/v))充分悬浮菌体，依次加入1/100体积的10％tritonx-100和0.1mpmsf，超声5s，间隔5s，共超声20min，直至液体澄清。20,000g，4℃离心20min后取上清用0.45μm滤膜过滤除菌作为样品。

按下述方法对层析柱进行使用前处理：用10x柱床体积的去离子水清洗ni²⁺亲和层析柱；用4x柱床体积的0.1mniso4过柱；用10x柱床体积的去离子水清洗；用10x柱床体积的mcac-0缓冲液平衡柱子。以10～15ml/h流速将样品上柱，持续约2.5～3h。mcac-50缓冲液清洗柱子，mcac-250缓冲液洗脱目的蛋白，对收集的目的蛋白等进行sds-page和western印迹检测。

sds-page和western印迹检测步骤如下：

取50μl样品加入2×上样缓冲液，充分振荡混匀后，沸水中煮沸变性10min，冰浴5min。12,000rpm，4℃离心1min，准备上样。

灌制分离胶(制胶装备安装方法见《miniproteanⅲ电泳槽安装使用指南》)，根据目标蛋白的大小配制分离胶的浓度:

配制10mlsds-page分离胶所需各成分的体积(ml/10ml)

灌胶完毕后，在上层覆盖一层ddh2o，静置30min至分离胶与水层出现明显界限，尽可能用吸水纸吸尽残留液体。在已聚合的分离胶上直接灌注5％浓缩胶，立即插入梳子。

配制5ml和10ml5％sds-page浓缩胶所需各成分的体积(ml)

待胶凝固后，装配好胶槽，加入电泳缓冲液，取适量处理好的样品上样。80v电压至溴酚蓝前沿跑入分离胶中，再以120v电压至溴酚蓝前沿刚刚跑出胶下沿。

电转移：将sds-page凝胶切去多余胶边，放在转移缓冲液中，剪4张与胶相同大小whatman3m滤纸和1张相同大小硝酸纤维素膜。将剪好的滤纸、硝酸纤维素膜、海绵在电转缓冲液中浸泡。将塑料支架平放，在黑色塑料板(阴极)上放一块海绵。将2张滤纸对齐放在海绵上，依次放置凝胶、纤维素膜、2张滤纸、海绵。在放置每一层时，均要去除它们之间的气泡。最后用塑料支架夹紧上述各层，放入电转移槽内，注意纤维素膜一侧靠阳极(红色)，胶一侧靠阴极(黑色)。接通电源，200ma恒流转移2h，转移结束后，取出塑料支架，依次去掉各层，膜正面(接触凝胶面)朝上放置在适当的容器中。

封闭：转移完毕的nc膜在tbst缓冲液中漂洗1次，转入10ml封闭液中，37℃封闭1h。

一抗反应：封闭完成后，换新封闭液，并按1:3000稀释倍数加入鼠源his单克隆抗体，室温震荡1.5h。tbst洗膜3次，每次10min。

二抗反应：加入用封闭液1:3000稀释的羊抗鼠hrp标记的igg二抗，反应1h。再用tbst洗膜3次，每次10min。

显色：避光条件下，将nc膜置于显色液中显色，至条带清晰，用蒸馏水冲洗以终止反应。

如图4和5所示，通过ni²⁺亲和层析柱可以获得纯度和浓度比较高的mbp-tslp-his融合蛋白。

将上述纯化的抗原中的抗原缓冲液采用10kd超滤管更换为pbs，并浓缩到1μg/μl。

实施例2：tslp抗体的制备

1.免疫小鼠

免疫小鼠的品系为balb/c，雌鼠或者雄鼠都可以，小鼠鼠龄为4-6周，一般20g左右，健康无病，每种抗原平行免疫3只小鼠。将抗原与免疫佐剂(quickantibody-mouse5w，博奥龙，kx0210041，水溶性的新型佐剂)按体积比1:1混合，采用背部和腹部皮下多点注射方式，每个点不要超过50μl。第一次免疫两周后进行第二次免疫，第二次免疫三周后进行加强免疫，此时不加佐剂只用抗原进行腹腔免疫，加强免疫3天后即可进行细胞融合。每次免疫中所采用的抗原的类型、剂量以及免疫小鼠的数量如表1所示。

表1

2.elisa法检测抗体效价

第二次免疫两周后通过眼眶内眦静脉窦采血进行elisa检测抗体效价。

样品信息：

对照小鼠1只(免疫的生理盐水)，免疫80μgmbp-tslp-his抗原的小鼠2只(分别命名为抗原80-1和抗原80-2)，免疫40μgmbp-tslp-his抗原的小鼠2只(分别命名为抗原40-1和抗原40-2)，通过眼眶内眦静脉窦采血，将血样于4℃放置3h以上，3000rpm离心5min收集血清，采用pbs缓冲液(0.2m，ph＝7.4)对收集的血清按照1:10、1:100、1:1000、1:10000、1:100000、1:1000000、1:10000000的比例进行稀释。

实验试剂:

包被液：取0.2mol/lna2co38ml，0.2mol/lnahco317ml混合，再加75ml蒸馏水，调ph至9.6；

pbs缓冲液：kh2po40.2g，kcl0.2g，na2hpo4.12h2o2.93g，nacl8.0g，加蒸馏水至1l，调ph至7.4；

洗涤液(pbst)：pbs缓冲液中加入0.5％吐温-20；

封闭液：10％bsa，pbs缓冲液溶解；

单组份tmb显色液：购于索莱宝生物科技有限公司；

终止液：1mh2so4。

elisa方法的步骤

a.纯化抗原mbp-tslp-his用包被液稀释，每孔包被0.1μg抗原。每个样品平行做三份，pbs作为阴性对照；

b.以100μl/孔的量加入酶标板孔中，置4℃过夜或37℃吸附2h；

c.弃去孔内的液体，同时用洗涤液200μl洗2次，每次5min，拍干；

d.每孔加200μl封闭液4℃过夜或37℃封闭2h；

e.洗涤液200μl洗2次，每次5min，拍干；

f.每孔加100μl如上待检测稀释过的一抗，37℃孵育30min；洗涤液200μl洗4次，拍干；

g.加羊抗鼠hrp标记的igg二抗(1:10000稀释)，每孔100μl，37℃孵育30min，洗涤液200ul洗4次，拍干；

h.加tmb显色液100μl，37℃20min；

i.每孔加入1mh2so450μl终止反应，在酶联免疫阅读仪上于450nm波长下读取od值。

第二次免疫两周后小鼠体内抗体的效价结果参见表2

表2

注：有阴影的数据为pbs作为阴性对照的数据

由此表可以看出，抗原mbp-tslp-his在80μg剂量时免疫产生的抗体效价最高，抗体效价为10⁵。

抗体效价达到10⁴以上方可进行细胞融合，所以选择抗原为mbp-tslp-his-80μg免疫后的小鼠进行细胞融合。

3.western印迹检测抗体特异性

抗原信息：

对照抗原为gp96-gst(本公司其他人员纯化的蛋白，见gp96蛋白纯化专利，cn106279393a)，实验抗原为纯化的mbp-tslp-his。

一抗信息：

对照小鼠(免疫的生理盐水)、免疫80μgmbp-tslp-his抗原的小鼠、免疫40μgmbp-tslp-his抗原的小鼠进行1:10000稀释的血清。

二抗信息：

羊抗鼠hrp标记的igg二抗，按照1:3000稀释。

sds-page和western印迹检测步骤如实施例1所述。

从图6的western印迹检测结果可以看出，免疫后小鼠体内产生了tslp的特异性抗体。

4.细胞融合及筛选

采用peg方法进行细胞融合，hat培养基筛选7-14天后取细胞上清进行western印迹检测筛选阳性孔。

所用试剂：

hat培养基：完全rpmi-1640培养基，20％fbs(hyclone)，双抗(100×)5ml，ht贮存液(100×)5ml，a贮存液(100×)5ml，定容至500ml。

氨基喋呤(a)贮存液(100×，4×10^-5mol/l):称取1.76mg氨基喋呤(aminopterin,mw＝440.4)，溶于100ml超纯水中，过滤除菌，分装小瓶，-20℃保存。

次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷(ht)贮存液(100×,h:10^-2mol/l，t：1.6×10^-3mol/l):称取136.1mg次黄嘌呤(hypoxanthine,mw＝136.1)和38.8mg胸腺嘧啶核苷(thymidine,mw＝242.2)，滴加1mol/lnaoh使完全溶解，加超纯水至100ml，过滤除菌，分装小瓶，-20℃冻存。

青、链霉素(双抗)溶液(100×):取青霉素g(钠盐)100万单位和链霉素(硫酸盐)1g，溶于100ml灭菌超纯水中，分装小瓶(5ml/瓶)，-20℃冻存。

方法步骤：

a.将1×10⁸脾细胞与3×10⁷-5×10⁷骨髓瘤细胞sp2/0-ag14(比例为5:1-2:1)混合于一支50ml融合管中，补加完全rpmi-1640培养基至30ml，充分混匀；

b.1000r/min离心5min，将上清尽量吸净；

c.在手掌上轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀，置40℃水浴中预热；

d.用1ml吸管在1min左右加预热至40℃的50％peg1450(ph8.0)1ml，边加边轻轻搅拌，严格控制滴加的速度，先慢后快，控制滴加时间在1min内；

e.然后迅速在1min内滴加1ml1640不完全培养基(预热过的)，在2min滴加2ml，在第5min时滴加至10ml，补加至40ml。严格控制滴加的速度，先慢后快，边加边轻轻搅拌，室温静置5min；

f.1000r/min离心5min，弃去上清；

g.加入5mlhat培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加hat培养基至160ml，一般分装至8个96孔板，每孔0.2ml，置37℃，5％co2培养箱内培养；

h.每隔3天用hat培养基进行半换液；

i.经常观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测。一般5天就可看到几个细胞的细胞团，10天可见明显细胞团。一般10-14天即可进行抗体检测。

western印迹检测杂交瘤细胞系，其具体步骤如实施例1所述，其中抗原为纯化的mbp-tslp-his；一抗为杂交瘤细胞上清，每孔为一个细胞系，进行编号；二抗为羊抗鼠hrp标记的igg二抗，按照1:3000稀释。

结果参见图7。从图7可以看出，通过western印迹检测到第42号杂交瘤细胞系为tslp特异性的细胞系。

5.42号杂交瘤细胞系亚克隆

通过有限稀释法进行亚克隆

a.制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，用含20％胎牛血清的hat培养基稀释至每个孔0.5-1个细胞分装到96孔板中。

b.37℃、5％co2湿润培养7-10天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测。

c.取抗体检测阳性孔的细胞扩大培养，并冻存。

通过杂交瘤技术获得鼠源tslp单克隆抗体，目前已经进行了3次亚克隆，三次亚克隆分别命名为42-75、42-24和42-38，已经将细胞系保存于液氮中。

western印迹检测：

对三次亚克隆后的细胞系进行western印迹检测，具体步骤如实施例1所述。western印迹检测的抗原蛋白为tslp-gst(为本公司之前通过原核表达获得的一种抗原)。一抗为42-75、42-24和42-38杂交瘤细胞上清原液，二抗为羊抗鼠hrp标记的igg二抗，按照1:3000稀释。。

检测结果如图8所示。从图8可以看出，3次亚克隆均获得了特异性的细胞系。

6.单克隆抗体的大规模制备

采用动物体内生产单抗的方法进行抗体的大规模制备

a、材料：

成年balb/c小鼠，液体石蜡，处于对数生长期的杂交瘤细胞。

b、方法：

a.腹腔接种降植烷或液体石蜡，每只小鼠0.2ml。

b.7-10天后腹腔接种用pbs或无血清培养基稀释的杂交瘤细胞，每只小鼠5×10⁵/0.2ml。

c.间隔5天后，每天观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可用16号针头采集腹水，一般可连续采2-3次，通常每只小鼠可采5-10ml腹水；

d.将腹水以2000r/min离心5min，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清，测定抗体效价(方法同上)，分装，-70℃冻存备用，或冻干保存。

通过动物体内生产单克隆抗体的方法获得7ml腹水，保存于-80℃。

7.单克隆抗体免疫球蛋白的类别和亚类鉴定

购买小鼠单克隆抗体igg亚类检测卡(博奥龙，bf06038)。

结果如图9所示，42号细胞株分泌的单克隆抗体为igg2a亚类。

8.单克隆抗体效价检测

采用western印迹检测单克隆抗体效价，抗原为tslp-gst，一抗为10倍系列稀释的小鼠腹水和42号细胞系的细胞上清，二抗为羊抗鼠hrp标记的igg二抗，按照1:3000稀释，具体步骤如实施例1所述。

结果显示在图10中，从图10可以看出，腹水效价为10⁵，细胞上清效价为10²。

9.单克隆抗体纯化

(1)预处理-二氧化硅吸附法

将冻存的腹水以2000r/min离心15min，除去细胞成分(或冻存过程中形成的固体物质)等；取上层清亮的腹水，等量加入pbs(ph＝7.4)稀释；然后每10ml稀释腹水中加150mg二氧化硅粉末，混匀，于室温孵育30min，不时摇动；2000g离心20min，脂质等通过该法除去，即可得澄清的腹水。

(2)单抗的粗提-硫酸铵沉淀法

a.饱和硫酸铵溶液的配制：500g硫酸铵加入500ml蒸馏水中，加热至完全溶解，室温过夜，析出的结晶任其留在瓶中。临用前取所需的量，用2mol/lnaoh调ph至7.8。

b.盐析：吸取10ml处理好的腹水移入小烧杯中，在搅拌下，滴加饱和硫酸铵溶液5.0ml；继续缓慢搅拌30min；10000r/min离心15min；弃去上清液，沉淀物用1/3饱和度硫酸铵悬浮，搅拌作用30min，同法离心；重复前一步1-2次；沉淀物溶于1.5mlpbs(0.1mol/l，ph＝7.4)中。

c.脱盐：将盐析样品装入slide-a-lyzercassette10kmwco透析盒中，用50-100倍体积的pbs缓冲液透析(4℃)12-24小时，其间更换5次透析液。

(3)单抗的纯化-proteing亲和层析法

a.将样品溶液从slide-a-lyzercassette10kmwco透析盒中取出，加入结合缓冲液(20mm磷酸盐，150mmnacl缓冲液(ph＝7.2))定容到50ml；

b.层析柱的使用前处理：取2mlproteing填料加入柱管中，用10×柱床体积的去离子水清洗，用10×柱床体积结合缓冲液平衡柱子；

c.上样：连接akata仪器，上样流速为1min/ml，约50min；

d.清洗：结合缓冲液清洗20ml；

e.洗脱：洗脱缓冲液(0.1m甘氨酸缓冲液(ph＝2.75))洗脱目的蛋白，收集洗脱蛋白，每管2ml；

f.sds-page和western印迹检测单克隆抗体纯化结果，具体步骤参见实施例1。

结果如图11所示。sds-page和western印迹结果显示，tslp单克隆抗体纯度比较高，浓缩和置换缓冲液后可以用于后续实验。

10.单克隆抗体序列确定

提取rna，设计小鼠重链和轻链引物，通过测序确定单克隆抗体序列。

(1)rna提取-trizol法

a.将培养的42号细胞系以1200g离心5min，收集细胞沉淀，每10⁷细胞加入1mltrizol缓冲液，立即在振荡器上剧烈震荡1min，冰上静置5min；

b.加入200μl三氯甲烷，剧烈震荡30s，冰上静置3min；

c.4℃12,000rpm离心15min，转上清到另一个1.5ml的管中，加入等体积的异丙醇，混匀，室温放置沉淀10min；

d.4℃12,000rpm离心15min，弃上清，留沉淀，用70％乙醇洗涤一次，4℃8,000rpm离心5min回收沉淀，室温15～20min干燥沉淀；

e.用50μlrnase-free水(天根生化)溶解沉淀，加入4μldnasei，37℃反应半小时；

f.加入1/10体积3mnaac(ph5.2)，混匀，再加入2.5倍体积的无水乙醇，混匀后放置-20℃沉淀30min；

g.4℃12,000rpm离心15min，弃上清，留沉淀，用70％乙醇洗涤一次，4℃8000rpm离心5min回收沉淀；

h.吸水纸吸干水，再于室温下敞口放置10～20min左右使乙醇挥发干净，用30μlrnase-free水溶解沉淀，并取2μl检测结果；

i.rna电泳检测：取2μlrnase-free水溶解的rna，1％琼脂糖凝胶电泳检测。待两条指示剂分开1cm后将凝胶放在凝胶成像系统下观察，如果离点样孔较近的28srrna的主带的宽度和亮度是另一条18srrna的二倍，则表明rna未降解。

(2)rna的反转录

反转录体系：rna2μg，oligodt18(takara)2μl，rnasefree水补足至15μl，短暂离心，70℃，5min，立即置于冰上5min。加入以下成分：5×mlvbuffer(promega)5μl，dntpmix(takara，各2.5mm)1.5μl，rnainhibitor(takara)0.5μl，mlv反转录酶(promega)1μl，rnasefree水补足至25μl，将上述反应混合物混合均匀，立即短暂离心，42℃1h，70℃15min。

(3)42号细胞系h、k链可变区的扩增与分析

k链扩增所用引物：

mkf：5’-ggcggaggtggctctggcggtggcggatcggacattgtgctcacccagtctcca-3’(seqidno：11)

mkr：5’-gagtcattctgcggccgcccgtttgatttcctgcttggtgcc-3’(seqidno：12)

h链扩增所用引物：

mhf：5’-gtcctcgcaactgcggcccagccggccatggccgaggtgaagcttctcgagtctgg-3’(seqidno：13)

mhr：5’-agagccacctccgcctgaaccgcctccacctgaggagacggtgaccatggtccc-3’(seqidno：14)

利用如下扩增体系和pcr程序来扩增42号细胞系h、k链的可变区片段。

pcr扩增体系：primerstar(takara)，25μl；mhf，1μl；mhr，1μl，42号细胞系cdna2μl；加入灭菌双蒸水将扩增体系补足至50μl。

pcr程序：98℃，5min；98℃，10s；55℃，5s；72℃，5s；共30个循环。之后72℃延伸10min。

将得到的pcr产物凝胶电泳回收，随后按下述连接体系将pcr产物与克隆载体连接：pcr产物5μl，克隆载体1μl(simplecloningvector，全式金)，16℃过夜连接。

将连接产物转化trans-t1感受态细胞(购买自全式金生物公司)：将连接产物加至100μltrans-t1感受态细胞中，轻轻混匀，将混合物冰上放置30min。将混合物置于42℃水浴中热激90s；迅速置于冰浴，持续3min。在超净工作台中向混合物加入600μllb培养液，37℃150rpm振荡培养45min。5,000g离心4min，收集菌体。弃掉500μl上清液，用移液器将剩余约200μl液体吹打均匀以悬浮菌体。将受体菌涂于lb(含50μg/mlamp)固体培养基表面，于37℃烘箱中培养12～16h。

将获得的重组克隆进行pcr验证。

挑取平板上的单菌落于lb(amp50mg/l)液体培养基中过夜摇瓶培养(转速200rpm,温度37℃)。取培养后的菌液进行pcr验证。pcr体系为：primerstar，10μl；mhf，1μl；mhr，1μl；菌液2μl；加入灭菌双蒸水将扩增体系补足到20μl。采用的pcr程序为：98℃，5min；98℃，10s；55℃，5s；72℃，5s；共30个循环，之后72℃延伸10min。将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，利用阳性pcr条带确定阳性克隆。

将阳性pcr条带的菌株送去测序，进行序列比对，最终确定42号细胞系h链可变区序列。

采用与上述h链完全一致的方案进行k链的克隆和测序，区别仅在于将其中的引物换成k链的引物，经过序列比对，最终确定42号细胞系k链可变区序列。

42号细胞系h链可变区氨基酸序列为

核苷酸序列为

gaggtccagctgaaggagtcaggggctgaactggcaaaacctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggctacacctttactagctactggatgcactgggtaaaacagaggcctggacagggtctggaatggattggatacattaatcctagcactggttatactgagtacaatcagaagttcaaggacaaggccacattgactgcagacaaatcctccagcacagcctacatgcaactgagcagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagatcgcgggggattacgacggggtttgcttactggggccaagggaccatggtcaccgtctcctca(seqidno：9)

42号细胞系k链可变区氨基酸序列为

核苷酸序列为

gacattgtgctcacccagtctccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtca

gagcattgtacatagtaatggaaacacctatttagaatggtacctgcagaaaccaggccagtctccaaagctcctgatct

acaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatc

agcagagtggaggctgaggatctgggagtttattactgctttcaaggttcacatgttccgtggacgttcggtggaggcac

caagcaggaaatcaaacgg(seqidno：10)

测序结果如图12a和12b所示。

从测序结果可以看出，42号细胞系k链cdr序列为：lcdr1：24-32asgytftsy(seqidno：4)；lcdr2：73-78dkssst(seqidno：5)；lcdr3：99-108srgittgfay(seqidno：6)。42号细胞系h链cdr序列为：hcdr1：25-36ssqsivhsngnt(seqidno：1)；hcdr2：51-55lliyk(seqidno：2)；hcdr3：96-102gshvpwt(seqidno：3)。

其中k链可变区序列与mouseigkappa-chain(genbank:m34588.1)相同。

在不偏离本申请公开的实质和范围的情况下，可对本申请公开的各实施方案进行多种改变和使用等同替换。除非上下文中另有说明，否则本公开的实施方案的任何特征、步骤或实施方案都可以与任何其他特征、步骤或实施方案组合使用。

序列表

<110>拜西欧斯（北京）生物技术有限公司

<120>tslp单克隆抗体及其制备方法和应用

<130>17c10871cn

<160>16

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>12

<212>prt

<213>小鼠

<400>1

serserglnserilevalhisserasnglyasnthr

1510

<210>2

<211>5

<212>prt

<213>小鼠

<400>2

leuleuiletyrlys

15

<210>3

<211>7

<212>prt

<213>小鼠

<400>3

glyserhisvalprotrpthr

15

<210>4

<211>9

<212>prt

<213>小鼠

<400>4

alaserglytyrthrphethrsertyr

15

<210>5

<211>6

<212>prt

<213>小鼠

<400>5

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15

<210>6

<211>10

<212>prt

<213>小鼠

<400>6

serargglyilethrthrglyphealatyr

1510

<210>7

<211>119

<212>prt

<213>小鼠

<400>7

gluvalglnleulysgluserglyalagluleualalysproglyala

151015

servallysmetsercyslysalaserglytyrthrphethrsertyr

202530

trpmethistrpvallysglnargproglyglnglyleuglutrpile

354045

glytyrileasnproserthrglytyrthrglutyrasnglnlysphe

505560

lysasplysalathrleuthralaasplysserserserthralatyr

65707580

metglnleuserserleuthrsergluaspseralavaltyrtyrcys

859095

alaargserargglyilethrthrglyphealatyrtrpglyglngly

100105110

thrmetvalthrvalserser

115

<210>8

<211>113

<212>prt

<213>小鼠

<400>8

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151015

aspglnalaserilesercysargserserglnserilevalhisser

202530

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354045

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505560

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65707580

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859095

serhisvalprotrpthrpheglyglyglythrlysglngluilelys

100105110

arg

<210>9

<211>357

<212>dna

<213>小鼠

<400>9

gaggtccagctgaaggagtcaggggctgaactggcaaaacctggggcctcagtgaagatg60

tcctgcaaggcttctggctacacctttactagctactggatgcactgggtaaaacagagg120

cctggacagggtctggaatggattggatacattaatcctagcactggttatactgagtac180

aatcagaagttcaaggacaaggccacattgactgcagacaaatcctccagcacagcctac240

atgcaactgagcagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagatcgcgg300

gggattacgacggggtttgcttactggggccaagggaccatggtcaccgtctcctca357

<210>10

<211>339

<212>dna

<213>小鼠

<400>10

gacattgtgctcacccagtctccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctcc60

atctcttgcagatctagtcagagcattgtacatagtaatggaaacacctatttagaatgg120

tacctgcagaaaccaggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccgattt180

tctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatc240

agcagagtggaggctgaggatctgggagtttattactgctttcaaggttcacatgttccg300

tggacgttcggtggaggcaccaagcaggaaatcaaacgg339

<210>11

<211>54

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

ggcggaggtggctctggcggtggcggatcggacattgtgctcacccagtctcca54

<210>12

<211>42

<212>dna

<213>人工序列

<400>12

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<210>13

<211>56

<212>dna

<213>人工序列

<400>13

gtcctcgcaactgcggcccagccggccatggccgaggtgaagcttctcgagtctgg56

<210>14

<211>54

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<213>人工序列

<400>14

agagccacctccgcctgaaccgcctccacctgaggagacggtgaccatggtccc54

<210>15

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<400>15

cgcggatccatgtacgacttcactaac27

<210>16

<211>50

<212>dna

<213>人工序列

<400>16

cgaagcttttagtggtggtggtggtggtgctgttgtttcagtaaaggtcg50