抗金黄色葡萄球菌富丝氨酸重复蛋白SraP的抗体IgG及应用的制作方法

本发明涉及金黄色葡萄球菌富丝氨酸重复蛋白srap基因克隆、鼠源单抗制备技术，以及所述单抗在金黄色葡萄球菌感染治疗、预防性药物中的应用。

背景技术：

富丝氨酸重复蛋白（serine-richrepeatproteins,srrps）自从1998年在副血链球菌（streptococcusparasanguinisfw213）中首次被发现以来，srrps又在其它链球菌、金黄色葡萄球菌（staphylococcusaureus）、表皮葡萄球菌(staphylococcusepidermidis)等中被发现。目前已知，srrps是一类位于革兰氏阳性菌细胞表面，能够介导细菌与细菌之间或者宿主细胞间粘附的糖蛋白。srrps不仅能够介导细菌种内的粘附，还可以介导种间的粘附，通过形成生物膜使细菌能够在宿主细胞上定植，进而发展成感染，如亚急性细菌性心内膜炎、口腔感染，肺炎及脑膜炎等。因此，srrps可以作为药物干预或者新型保护性抗原靶标。

金黄色葡萄球菌（s.aureus）是危害人类健康的重要病原菌之一，广泛存在于人的呼吸道和皮肤上，能够引起黏膜、皮肤感染、感染性心内膜炎或全身严重性感染如败血症等。srap（serine-richadhesionforplatelets）是金葡菌中的srr蛋白，srap不仅可以和野生型的细菌结合而且可以和缺失型的细菌结合，不仅参与金葡菌生物膜的形成，还可以介导细菌种间的粘附。srap非重复区可以与血小板结合，能够与唾液凝集素蛋白gp340结合，gp340作为一种糖蛋白，在唾液、小肠及肺中表达。srap主要是与gp340的三糖组份neuacα(2-3)galβ(1-4)glcnac结合。晶体结构显示，srap的配体结合区主要是由β-片组成，可以分成四个亚结构域：l-lectin模块，β-gf以及cdhl-1和cdhl-2模块，srapbr与a549细胞的粘附主要是通过其l-lectin模序与neu5ac结合介导金葡菌对上皮细胞的粘附和侵入。由此说明srapbr中l-lectin模序在与底物结合的过程中起着主要作用，l-lectin、cdhl-1和cdhl-2模块均含有钙离子，主要是起着稳定蛋白整体结构的作用。srapbr通过l-lectin模序与宿主细胞（如血小板）表面的neu5ac结合，可能是引起金葡菌内腔感染的主要原因。因此srap的l-lectin模序作为金葡菌的一个重要的毒力因子可以作为防控金葡菌感染的潜在药物或疫苗开发靶点。

目前对于金葡菌感染的治疗仍然是通过静脉长期大量的抗生素治疗以降低感染，然而效果并不理想，并且随着抗生素的滥用导致金葡菌产生严重的耐药性，在医院中出现mrsa、vrsa等超级细菌，因此，开发抗细菌感染的替代疗法，例如基于抗体的治疗，成为目前的迫切需要。金葡菌能够通过各种复杂的机制建立感染，如通过其产生的细胞膜相关蛋白、糖聚合物以及一系列毒素介导细菌的粘附，促使宿主细胞裂解，干扰抗体功能，抑制补体激活通路并侵染吞噬细胞。因此针对各种毒力相关分子的抗体和疫苗正在积极开发中。与传统抗生素相比，抗体具备一些独特优势，比如特异性高、半衰期长、介导细胞吞噬杀伤作用等。现在已经有多家公司或研究结构开展了金葡菌单克隆抗体的研究，并取得了一些令人振奋的结果，很多抗体已经进入到临床研究阶段，但是有些效果并不理想，如针对细菌荚膜多糖血清5/8型、针对脂磷壁酸（lipoteichoicacid,lta）、atp匣式转运系统（atp-bindingcassette,abc）转运蛋白等进行到临床三期实验均宣告失败。从靶点选择的角度看，目前抗细菌感染抗体的开发仍面临诸多局限，因此开辟新的有价值靶点仍是一个重要研究方向，中国专利中关于金黄色葡萄球菌抗体新靶点的选择还有很大的提升空间。

技术实现要素：

解决的技术问题：本发明提供一种抗金黄色葡萄球菌富丝氨酸重复蛋白srap的抗体igg及应用，通过单克隆抗体制备技术筛选到了对srap的l-lectin模序的重组蛋白具有高亲和力的单克隆抗体，细胞和动物实验表明，该单克隆抗体能够显著降低金黄色葡萄球菌对宿主细胞的粘附和侵入以及良好的动物保护功能。

技术方案：抗金黄色葡萄球菌富丝氨酸重复蛋白srap的抗体igg，包括轻链l和重链h，所述轻链l可变区的氨基酸序列如seqidno.1所示，重链h的可变区氨基酸序列如seqidno.2所示。

编码上述抗金黄色葡萄球菌富丝氨酸重复蛋白srap的抗体igg的核酸序列，编码轻链l可变区的核酸序列如seqidno.3所示，编码重链h可变区的核酸序列如seqidno.4所示。

上述抗金黄色葡萄球菌富丝氨酸重复蛋白srap的抗体igg，轻链l恒定区的氨基酸序列如seqidno.5所示，重链h的恒定区氨基酸序列如seqidno.6所示。

编码上述抗金黄色葡萄球菌富丝氨酸重复蛋白srap的抗体igg的核酸序列，编码轻链l恒定区的核酸序列如seqidno.7所示，编码重链h恒定区的核酸序列如seqidno.8所示。

上述抗金黄色葡萄球菌富丝氨酸重复蛋白srap的抗体igg在制备治疗金葡菌感染药物中的应用

有益效果：本发明提供了一种具有高保护性、高特异性、高亲和力抗srap的单克隆抗体igg。srap是金葡菌中的富丝氨酸重复蛋白，能够通过其l-lectin模序与宿主细胞表面的neu5ac结合介导细菌对宿主细胞的粘附和侵入。因此本发明的抗srap单克隆抗体igg可应用于有关金葡菌感染的治疗、预防研究中。

本发明以srap的l-lectin模序重组蛋白为抗原，筛选鼠源抗srap单克隆抗体细胞株srap-001。对制备的鼠源单抗igg进行功能鉴定。免疫学检测显示，该鼠源单抗能够与不同截短的srap重组蛋白（含l-lectin模序）特异性结合，细胞实验表明，抗srap鼠源单抗igg能够显著降低金葡菌粘附和进入上皮细胞的数量。抗srap鼠源单抗igg注射后小鼠，能够保护小鼠降低金葡菌在血液中的数量。

附图说明

图1为srap配体结合区不同截短类型重组蛋白的sds-page检测结果图，其中m，marker；1，srapbr-his-pet28a诱导后全菌蛋白；2-3，纯化的srapbr-his重组蛋白；4，srapl-lectin-his-pet28a诱导后全菌蛋白；5-6，纯化的srapl-lectin-his重组蛋白；7，srapl-lectin&β-gf-his-pet28a诱导后全菌蛋白；8，纯化的srapl-lectin&β-gf-his重组蛋白。

图2为纯化igg抗体的sds-page检测结果图，m，marker；1，igg抗体；

图3为igg单克隆抗体的酶联免疫吸附试验检测结果图；

图4为igg单克隆抗体与srap配体结合区不同截短类型重组蛋白的免疫印迹鉴定结果图，m，marker；

图5利用同源重组的方法敲除usa300菌株srapl-lectin基因构建缺失突变菌株图；

图6细胞实验为igg单克隆抗体对金葡菌感染粘附和侵入的影响图，结果可见当抗体终浓度达到100ng/ml时，能显著降低细菌对细胞的粘附和侵入，效果与敲除菌株相当；其中a为细胞表面粘附细菌相对百分比，b为细胞内侵入细菌相对百分比，-表示无唾液酸酶，+表示加入唾液酸酶去除细胞表面的neuac;c为细胞表面粘附细菌相对百分比，d为细胞内侵入细菌相对百分比。

图7动物实验为igg单克隆抗体动物体内试验的结果图，该抗体在每只小鼠给予100ug抗体时，能够显著降低小鼠血液中细菌的数量。

具体实施方式

实施例1鼠源单抗igg的制备及筛选检测

1）应用杂交瘤技术制备抗srap单克隆抗体，具体步骤如下：

一、制备抗原（srapl-lectin重组蛋白）

构建srapl-lectin表达质粒：提取金黄色葡萄球菌usa300基因组，按照细菌dna提取试剂盒方法进行，按如下引物pcr扩增srapl-lectin模序基因片段，

f(5’-3’)：ccggatcctttgcgtcagcagcgacg；

r(5’-3’)：cacaagctttatattcgaatgttccaaattgtac；

在其两端添加bamhⅰ和hindⅲ限制性内切酶位点。将基因片段克隆进pet28a表达载体中，构建pet28a-srapl-lectin重组质粒。重组质粒经双酶切和dna测序鉴定构建成功。

将上述质粒转化大肠杆菌bl-21感受态细胞，筛选阳性转化子进行原核表达，对表达产物进行sds-page检测，获得了30kda的重组蛋白，与srapl-lectin蛋白的分子量大小相符，用his亲和层析柱（美国amersham公司）对目的蛋白进行纯化，获取带有his标签的srapl-lectin重组蛋白，命名为srapl-lectin蛋白。见图1；

构建srap配体结合区及其不同截短类型（srapbr、srapl-lectin&β-gf、srap90-723aa）表达质粒；，方法如上所述，引物序列如下：

srapbr-f(5’-3’)：ccggatcctttgcgtcagcagcgacg；

srapbr-r(5’-3’)：cacaagcttttaatttcttgttacttcatattta；

srapl-lectin&β-gf-f(5’-3’)：ccggatcctttgcgtcagcagcgacg；

srapl-lectin&β-gf-r(5’-3’)：cacaagcttttacatcagtaaaataatatg；

srap90-723aa-f(5’-3’)：ccggatccgcttctgatgcaccatta；

srap90-723aa-r(5’-3’)：cacaagcttttaaatgtttgttggtgtacc；

重组质粒经双酶切和dna测序鉴定构建成功。

将上述质粒转化大肠杆菌bl-21感受态细胞，筛选阳性转化子进行原核表达，对表达产物进行sds-page检测，分别获得了的55kda、40kda、72kda重组蛋白，与预期蛋白的分子量大小相符，用his亲和层析柱（美国amersham公司）对目的蛋白进行纯化，获取带有his标签的srapbr、srapl-lectin&β-gf和srap90-723aa的重组蛋白，命名为srapbr、srapl-lectin&β-gf和srap90-723aa蛋白。见图2；

二、制备抗srapl-lectin的杂交瘤细胞株（所有的供杂交瘤技术用的小鼠骨髓瘤sp2/0细胞系均来源于纯系balb/c小鼠）：

用srapl-lectin重组蛋白作为免疫原在小鼠腹部皮下注射进行免疫接种，每次100μg/ml，共五次，在最后一次免疫接种前三天进行腹腔内加强免疫。融合当天取小鼠脾脏，用rpmi-1640不完全培养基（美国gibco公司）制备成单细胞悬液，在50%peg（ph8.0）存在下，将脾细胞和sp2/0小鼠骨髓瘤细胞进行融合，用hat选择性培养基（rpmi-1640培养基98ml，ht贮存液1ml，a贮存液1ml）培养7天，换用ht培养基（rpmi-1640培养基99ml，ht1ml）培养。

三、抗srapl-lectin阳性单克隆抗体的筛选

根据杂交瘤细胞生长情况行常规elisa检测筛选，取检测阳性孔的细胞再次克隆化，经过5次克隆化，待所有的孔内单克隆细胞检测都为抗srapl-lectin阳性后，取数孔扩大培养并部分冻存。最终选取1株稳定分泌抗srap抗体的杂交瘤细胞，分别命名为srap-001。

四、单克隆抗体的亚型鉴定

用美国sigma公司的单克隆抗体亚型鉴定试剂盒(iso-2kt)进行抗体的亚型，结果显示抗srapl-lectin抗体srap-001的亚型为igg1。

五、单抗的大量培养并纯化

用杂交瘤专用无血清培养基（hybridoma，gibico）大量培养杂交瘤细胞株。5天后收集培养上清，用proteing亲和层析柱（美国amersham公司）纯化抗体，测定浓度后分装，-70℃冻存。纯化结果见图3所示抗体纯度达到95%以上。

2）抗srap单克隆抗体igg的功能活性鉴定

一、elisa

用酶联免疫吸附试验对igg和srapl-lectin蛋白的结合进行鉴定。具体方法为：用包被液（0.1m碳酸盐缓冲液，ph9.6）稀释srapl-lectin蛋白至2µg/ml包被elisa96孔板，每孔加入100µl，4℃过夜；pbst（pbs含0.5%tween20）5%脱脂牛奶-洗涤缓冲液封闭，37℃孵育2h；pbst洗涤5次后，每个孔中加入100µligg（2µg/ml起始浓度，15个浓度梯度稀释）4℃过夜；以1：4000稀释的羊抗鼠二抗（北京中杉公司）100µl/孔加入到孔内，37℃孵育1h；过氧化物酶底物显色液100µl/孔，室温下15分钟后用2m硫酸中止反应，上机检测比色采用双波长450nm/690nm。结果见图4显示：该纯化的单克隆抗体具有较高的抗体效价。

二、wb

对srapl-lectin进行免疫印迹鉴定。具体方法为：以表达其他蛋白的大肠杆菌株为阴性对照，分别将srapl-lectin、srapbr、srapl-lectin&β-gf和srap90-723aa重组蛋白表达细菌裂解上清进行10%sds-page电泳并电转到硝酸纤维膜上，将此膜与2μg/mlsrapl-lectin室温孵育1h，1：2000稀释的羊抗鼠igg二抗（北京中杉公司）和ecl发光试剂盒（美国pierce公司）曝光于凝胶成像系统（bio-rad公司）。结果如图5所示：igg抗体与含有l-lectin模序的不同截短类型的srap重组蛋白有特异性结合。

三、细胞试验

将被试细胞(a549)培养在含有10%小牛血清（fbs）和1%抗生素（p/s）的dmem(dulbecco’smodifiedeaglemedium)培养基中，37℃5%二氧化碳条件下培养。a549细胞5×10⁴/孔接种于24孔板中，于37℃℃培养至a549细胞铺满孔底，pbs洗涤细胞3次；加入终浓度为100ng/ml、50ng/ml的纯化的抗srap抗体igg于37℃提前孵育2h，将金葡菌usa300培养至对数生长期，约1×109cfu/ml，用dmem培养液稀释细菌每孔加入2×10⁷个细胞，于37℃共孵育1hr。去除培养基后再用pbs洗涤5次以去除未粘附的细菌。用200μl胰蛋白酶(2.5mg/ml)消化细胞5min至细胞全部消化下来，再加400μl裂解液(pbst)裂解细胞，最后加入pbst补齐至lml。稀释一定倍数涂tsa平板计数。

对于侵入实验：细菌在37℃孵育1hr后，用dmem新鲜配置的庆大霉素(14μg/ml)继续孵育1hr以杀死细胞外的细菌。去除培养基后再用pbs洗涤5次以去除未粘附的细菌。用200μl胰蛋白酶(2.5mg/ml)消化细胞5min至细胞全部消化下来，再加400μl裂解液(pbst)裂解细胞，最后补齐至lml。稀释一定倍数涂tsa平板计数。实验重复三次，每孔至少重复三次以上。结果见图6所示：终浓度50ng/ml的抗srap单克隆抗体igg孵育细胞，细菌对宿主细胞的粘附和侵入能力下降40%左右，终浓度100ng/mlanti-srapl-lectin单克隆抗体孵育细胞，细菌对宿主的粘附和侵入能力下降50%以上。

四、动物被动免疫实验

实验前一天，4~5周龄balb/c小鼠（100μg/只）腹腔注射igg单克隆抗体，对照组注射等体积的pbs。第二天将金葡菌usa300培养至对数生长期，约1×10⁹cfu/ml，用无菌pbs洗涤3遍，稀释10倍，每只小鼠腹腔注射100μl。两天后，摘眼球取血，涂板计数血液和肾脏中金葡菌克隆数。每组4~6只小鼠，重复2次。结果见图7，igg单克隆抗体能够保护动物减少血液中金葡菌的感染数量。

该实验显示本发明提供的igg单克隆抗体具有良好的控制细菌感染的功能，可以应用于制备抗细菌感染治疗药物。

序列表

<110>中国人民解放军南京军区军事医学研究所

<120>抗金黄色葡萄球菌富丝氨酸重复蛋白srap的抗体igg及应用

<160>16

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>111

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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151015

aspargvalserilethrcyslysalaserglnserthraspvalala

202530

valalatrphisglnglnlysproglyglnserprolysproleuile

354045

tyrseralasertyrglntyrthrglyvalproaspargphethrgly

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cgcttcactggcagtggatctgggacggatttcactttcaccatcagcagtgtgcaggct240

gaagacctggcagtttattactgtcagcaacatactgattacagtattccggtggcttgg300

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