猪源大肠杆菌氟苯尼考耐药基因SYBRGreenI荧光定量PCR诊断试剂盒的制作方法

本发明涉及试剂盒技术领域，尤其是猪源大肠杆菌氟苯尼考耐药基因sybrgreeni荧光定量pcr诊断试剂盒。

背景技术：

致病性大肠杆菌是危害养猪业的重要病原菌，容易引起人和动物不同病型疾病，广泛存在于生活环境中，不仅给养殖业带来巨大的经济损失，而且还严重威胁着人类健康。目前，治疗致病性大肠杆菌病菌，主要采用的是抗生素，抗生素的大量滥用，也使得大肠杆菌的耐药菌株逐渐增多。尤其是近年来氟苯尼考作为广谱抗菌药被大量滥用，大肠杆菌对氟苯尼考耐药性日益严重。

为此，也有研究者对大肠杆菌耐药性以及氟苯尼考耐药基因、机制以及同源性等进行了研究与分析，如李颖等《大肠杆菌耐药性及氟苯尼考耐药基因flor的研究》，曾芸等《大肠杆菌o157∶h7对氟苯尼考耐药机制的初步研究》，刘静等《保定地区不同动物源大肠杆菌氟苯尼考耐药基因flor的同源性分析》等等，但是，现有技术中，并未存在对大肠杆菌氟苯尼考耐药基因提供快速准确诊断的pcr诊断试剂盒，使得对大肠杆菌氟苯尼考耐药基因的诊断和检测依然存在着操作繁杂、敏感性低，费时费力等缺陷。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供猪源大肠杆菌氟苯尼考耐药基因sybrgreeni荧光定量pcr诊断试剂盒。

具体是通过以下技术方案得以实现的：

猪源大肠杆菌氟苯尼考耐药基因sybrgreeni荧光定量pcr诊断试剂盒，包括40μl混合引物、250μlpremixextaq、20μlroxreferencedye、100μldl2000、500μlrnasefreedh2o、20μl阳性对照、20μl阴性对照；其中，混合引物包括上游引物和下游引物，上游引物为5`-gctcaacgtgagttggatcata-3`，下游引物为5`-cactgctgctgatggctcctttc-3`。

所述的阴性对照为超纯水。

所述的阳性对照为pmd-18t-flor阳性质粒。

所述的试剂盒，在-20℃下保存≤12个月。

所述的混合引物，浓度为10μmol/l。

具体本发明创造在研究过程中，是通过如下试验进行的：

一、材料与方法

1、材料

1.1实验菌株

大肠杆菌氟苯尼考耐药菌株、大肠杆菌磺胺类耐药菌株、大肠杆菌β-内酰胺类耐药菌株、大肠杆菌大环内酯类耐药菌株；

以上菌株均由贵州省畜牧兽医研究所兽用中草药研究室保存。

1.2主要试剂以及仪器

2×taqpcrmastermix、goldview、1xtae、dl2000、dh5α、pmd-18t、细菌的dna快速提取试剂盒、琼脂糖凝胶dna回收试剂盒等购自天根生化科技(北京)有限公司；sybrgreeni荧光定量pcr酶(roxreferencedye)、rnasefreedh2o等购自宝生物(大连)工程有限公司；荧光定量pcr仪为eppendorfmastercyclereprealplex4实时荧光定量pcr仪。

2、实验方法

2.1引物设计

根据genbank中flor基因设计1对特异性引物，用于扩增目的的基因片段，引物序列为：上游引物：

5`-gctcaacgtgagttggatcata-3`，下游引物:5`-cactgctgctgatggctcctttc-3`，该引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

2.2dna提取

将大肠杆菌氟苯尼考耐药菌株、大肠杆菌磺胺类耐药菌株、大肠杆菌β-内酰胺类耐药菌株、大肠杆菌大环内酯类耐药菌株中的dna提取参照细菌dna快速提取试剂盒说明书进行，将提取的dna在-20℃保存。

2.3pmd-18t-flor阳性标准品的构建

2.3.1荧光定量pcr扩增

pcr扩增在25μl体系中进行，上下游引物各1μl(10μmol/l)、2×taqpcrmastermix12.5μl、roxreferencedye0.5μl、模板1μl，加rnasefreedh2o至25μl，反应条件为：94℃5min；94℃1min，55℃30s，72℃30s，30个循环；最后72℃延伸10min；取5μlpcr扩增产物于15g/l琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。

2.3.2pmd-18t-flor阳性标准品的构建

将扩增的pcr产物，与pmd-18-克隆载体连接，转化进感受态细胞dh5α，重组质粒命名为pmd-18t-flor，同时送上海英骏生物技术有限公司测序。将重组质粒的浓度和纯度进行测定后，作为阳性标准品进行10倍倍比稀释。

2.3.3荧光定量pcr扩增条件优化

荧光定量pcr条件，包括引物浓度(5、10、20μmol/l)，退火温度(50℃、55℃、60℃)，roxreferencedye的用量(0.5μl、1μl)进行优化以确定荧光定量pcr最佳条件，同时，以rnasefreedh2o作为空白对照，在25μl反应体系中进行。荧光定量pcr反应程序为：94℃10s；94℃5s、(50℃、55℃、60℃)退火10s、72℃10s，40个循环。取5μlpcr扩增产物于15g/l琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。

2.3.4荧光定量pcr标准曲线的建立

将重组质粒的浓度和纯度进行测定后，计算dna拷贝数，作为阳性标准品进行10倍倍比稀释。以优化好的的条件进行扩增，每个稀释倍数3个重复，以拷贝数为横坐标，以ct值为纵坐标建立标准曲线。

2.4荧光定量pcr敏感性试验

将重组质粒计算dna拷贝数后，10倍稀释后分别进行荧光定量pcr，每个稀释倍数3个重复，以确定荧光定量pcr敏感性。

2.5荧光定量pcr特异性试验

以大肠杆菌氟苯尼考耐药菌株、大肠杆菌磺胺类耐药菌株、大肠杆菌β-内酰胺类耐药菌株、大肠杆菌大环内酯类耐药菌株dna进行荧光定量pcr，每个样品3个重复，以确定荧光定量pcr特异性。

2.6荧光定量pcr重复性试验

应用建立的荧光定量pcr方法重复检测大肠杆菌氟苯尼考耐药菌株样品3次，以建立的荧光定量pcr重复的稳定性。

2.7试剂盒组装与保存期限检测

2.7.1试剂盒组成

应用建立的sybrgreeni荧光定量pcr方法组装成试剂盒，包括：dl2000、premixextaq、roxreferencedye、混合引物、rnasefreedh2o、阳性对照、阴性对照。

2.7.2保存期限检测

将试剂盒保存于4℃和-20℃，同时3个月、6个月、12个月，对阳性标准品进行检测，观察试剂盒的稳定性。

2.8荧光定量pcr试剂盒对临床样品进行相关性分析

对贵州省几个生猪养殖场分离得到的156株致病性大肠杆菌，采用传统的药敏试验和试剂盒进行氟苯尼考耐药性分析，分析大肠杆菌氟苯尼考耐药表型和耐药基因的相关性。

二、试验结果

1、荧光定量pcr扩增产物的鉴定

对大肠杆菌氟苯尼考耐药菌株dna进行pcr扩增，扩增出148bp目的片段，无非特异性扩增，见图1。将pcr产物测序结果与genbank中的flor基因序列比对，相似度为98.4％～100％。

2、荧光定量pcr条件

在25μl反应体系中(引物2μl、premixextaq12.5μl、roxreferencedye0.5μl、模板1μl，超纯水补齐25μl)最佳的荧光定量pcr条件为：引物浓度10μmol/l、退火温度55℃能出现最高的荧光值、最小的ct值，且熔解曲线分析中不出现非特异性扩增峰。

3、荧光定量pcr反应标准曲线的建立

以1.0×10⁴、1.0×10³、1.0×10²、1.0×10¹拷贝/μl，4种不同浓度重组质粒作为模板进行荧光定量pcr扩增反应，每个浓度重复3次，从而建立荧光定量pcr反应标准曲线，线性回归方程为ct＝-3.670×lgcopies+22.59(r2＝0.999)，见图2。

4.荧光定量pcr熔解曲线分析

在sybrgreeni荧光定量pcr反应程序完成后，对扩增产物进行熔解曲线分析扩增产物的溶解温度tm为88.8℃～89.2℃，没有引物二聚体和非特异性扩增峰出现，见图3。

5.荧光定量pcr敏感性试验

以1.0×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³、1.0×10²、1.0×10¹、1.0×10⁰拷贝/μl，6种不同浓度重组质粒作为模板进行荧光定量pcr扩增，每个浓度重复3次，结果其灵敏度为1.0×10¹拷贝/μl，见图4。

6.荧光定量pcr特异性试验

大肠杆菌氟苯尼考耐药菌株、大肠杆菌磺胺类耐药菌株、大肠杆菌β-内酰胺类耐药菌株、大肠杆菌大环内酯类耐药菌株dna进行荧光定量pcr，以研究建立的荧光定量pcr诊断方法的特异性，结果大肠杆菌氟苯尼考耐药菌株为阳性，而大肠杆菌磺胺类耐药菌株、大肠杆菌β-内酰胺类耐药菌株、大肠杆菌大环内酯类耐药菌株dna为阴性，见图5。

7.重复性试验

应用建立的方法重复检测大肠杆菌flor基因阳性菌株3次，结果扩增曲线重复性较好。

8.临床细菌的耐药性与耐药基因的检测

应用建立的方法，对2015年～2017年贵州省贵阳市、大方县、安顺市、瓮安县等生猪规模化养殖场分离鉴定的156株大肠杆菌进行传统的氟苯尼考药敏试验，同时应用试剂盒对156株大肠杆菌氟苯尼考耐药基因进行检测。传统的氟苯尼考药敏试验共检测出88株耐药表型菌株，试剂盒检测这88株表型耐药菌株有85株flor基因阳性，而药敏试验阴性的68株大肠杆菌，试剂盒检测有6株flor基因阳性。耐药表型和耐药基因检出率符合率为96.7％(88/91)。

9.试剂盒保存试验结果

将试剂盒保存在4℃、-20℃分别于3月、6月、12月，对大肠杆菌flor基因阳性菌株进行检测，4℃保存6月、12月标准阳性品拷贝数分别降低10倍、1000倍；-20℃保存3月、6月对标准阳性品拷贝数无影响，保存12月标准阳性品拷贝数降低10倍。

氟苯尼考是20世纪80年代研制兽医专用抗生素，具有抗菌谱广、吸收快等特点，可以广泛用于治疗畜禽养殖中的细菌性疾病，在生猪养殖场中广泛用于治疗仔猪腹泻、猪喘气病、传染性胸膜肺炎等，尤其是作为仔猪腹泻的预防保健药。本研究中分离的156株致病性大肠杆菌就有88株表型耐药，耐药率达到56.4％(88/156)，表明生猪养殖场中大肠杆菌对氟苯尼考耐药也越来越严重，可这能和养殖场使用氟苯尼考作为保健药，以及治疗中大量滥用有关。

flor基因作为大肠杆菌的外排泵基因，通过flor基因编码的外排泵蛋白将体内的氟苯尼考泵出体外，以降低细菌内氟苯尼考的浓度，从而抑制氟苯尼考抑菌的作用，同时flor基因是质粒介导的耐药基因可以在菌株间相互转移，可造成耐药性广泛传播。本研究根据genbank中猪源大肠杆菌氟苯尼考耐药的flor基因序列，建立猪源大肠杆菌氟苯尼考耐药基因荧光定量pcr诊断方法，以此研制成诊断试剂盒对大肠杆菌磺胺类耐药菌株，β-内酰胺类耐药菌株、大环内酯类耐药菌株均为阴性，灵敏度可达1.0×10¹拷贝/μl，和传统的药敏试验符合率达96.7％(88/91)，耐药表型与耐药基因型检出率呈正相关，表明试剂盒可用于大肠杆菌氟苯尼考耐药基因的调查。

本研究中试剂盒检测这88株表型耐药菌株只有85株flor基因阳性，这可能与大肠杆菌对氟苯尼考存在其他耐药机制有关。同时，药敏试验阴性的68株大肠杆菌，试剂盒检测有6株flor基因阳性，这可能与耐药基因本身出现个别基因变异或缺失引起外排泵功能减弱或丧失有关。

附图说明

图1为flor基因pcr扩增结果：

m：dl2000；1：flor基因pcr产物；2：阴性对照；

图2为sybrgreeni荧光定量pcr标准曲线；

图3为sybrgreeni荧光定量pcr熔解曲线；

图4为sybrgreeni荧光定量pcr敏感性试验中，荧光值与循环数的关系曲线；

1：重组质粒dna1.0×10⁵拷贝/μl稀释的sybrgreeni荧光定量pcr结果、2：重组质粒dna1.0×10⁴拷贝/μl稀释的sybrgreeni荧光定量pcr结果、3：重组质粒dna1.0×10³拷贝/μl稀释的sybrgreeni荧光定量pcr结果、4：重组质粒dna1.0×10²拷贝/μl稀释的sybrgreeni荧光定量pcr结果、5：重组质粒dna1.0×10¹拷贝/μl稀释的sybrgreeni荧光定量pcr结果、6：重组质粒dna1.0×10⁰拷贝/μl稀释的sybrgreeni荧光定量pcr结果。

图5为sybrgreeni荧光定量pcr特异性试验中，荧光值与循环数的关系曲线；

1：大肠杆菌氟苯尼考耐药菌株sybrgreeni荧光定量pcr结果；2：大肠杆菌磺胺类耐药菌株；3：大肠杆菌β-内酰胺类耐药菌株；4：大肠杆菌大环内酯类耐药菌株sybrgreeni荧光定量pcr结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。

实施例

猪源大肠杆菌氟苯尼考耐药基因sybrgreeni荧光定量pcr诊断试剂盒，包括40μl混合引物、250μlpremixextaq、20μlroxreferencedye、100μldl2000、500μlrnasefreedh2o、20μl阳性对照、20μl阴性对照；其中，混合引物包括上游引物和下游引物，上游引物为5`-gctcaacgtgagttggatcata-3`，下游引物为5`-cactgctgctgatggctcctttc-3`。

在某些实施例中，阴性对照为超纯水。阳性对照为pmd-18t-flor。

在某些实施例中，选取将本发明创造的试剂盒，在-20℃下保存≤6个月。

在某些实施例中，对于混合引物，浓度选取为10μmol/l。对于混合引物中，上游引物与下游引物的用量是相等的。