用于指导盐酸右美托咪定用药相关基因多态性检测的引物组、试剂盒及方法与流程

本发明涉及体外诊断技术领域，特别的，涉及一种用于指导盐酸右美托咪定用药相关基因多态性检测的引物组、试剂盒及方法。

背景技术：

盐酸右美托咪定是一种相对选择性α2受体激动药，有镇静、抗焦虑、催眠、镇痛和交感神经阻滞作用。右美托咪定几乎完全被生物转化，极少以原形从尿和粪便中排出。生物转化包括直接葡萄苷酸化和细胞色素p450介导的代谢。右美托咪定的主要代谢途径是：直接n-葡萄苷酸化成非活性代谢产物；脂肪羟基化作用(主要由cyp2a6介导)产生3-羟基右美托咪定、3-羟基右美托咪定葡糖苷酸和3-羧基右美托咪定；右美托咪定n-甲基化产生3-羟基n-甲基右美托咪定、3-羧基n-甲基右美托咪定和n-甲基o-葡糖苷酸右美托咪定。

关于cyp2a6的研究发现，cyp2a6基因全长近6kb，包括9个外显子，位于19q12-19q13.2之间，它和cyp2a7、cyp2a13以及两个cyp2a7假基因一起位于一个350kb的基因簇内。在cyp2a6的多个等位基因中，具有正常酶活性的等位基因是cyp2a6*1，而cyp2a6*4等位基因编码的酶缺乏活性。cyp2a6*4等位基因是cyp2a6基因的整体缺失，该缺失位点源于高度相似的cyp2a6和cyp2a7基因的3’端区域的不等交换，造成一个等位基因缺失，其交换区域位于第8内含子或第9外显子上。

cyp2a6*4基因是高度多态性的，大约有40个等位基因变体。这些等位基因是纯合子的cyp2a6缺乏活性。cyp2a6*4等位基因频率在中国人群为15％，芬兰人为1.0％，西班牙为0.5％，cyp2a6*4等位基因是促成亚洲人群pm表型(cyp2a6基因部分缺失或全部缺失促成pm表型)的主要等位基因。因此在给药时，应给予含有cyp2a6*4等位基因的患者留有足够的注意力，以防不良反应的发生。

目前常用的检测基因多态性的方法有dna直接测序法、限制性片段长度多态性分析法(pcr－pflp)、高分辨率溶解曲线(hrm)、基因芯片、液相芯片法、荧光定量pcr法等。测序技术是公认的检测基因突变的金标准，但其设备成本高、检测周期长、检测通量低、检测灵敏度低、对实验人员的技术操作要求高、结果判定步骤繁琐等原因，较难形成商业化的诊断产品；限制性片段长度多态性分析法检测灵敏度同样不高、操作步骤繁琐，检测的结果仍需要进行一代测序法的再次验证，尤其当样本量多时极易造成pcr产物的交叉污染容易出现酶切不充分或酶切过度而出现假阴性或假阳性结果，因此也无法应用到临床上。芯片检测因其检测结果的准确性和重复性较差，实验周期长等缺点，也不适于开发临床检测试剂盒。荧光定量pcr的检测方法拥有成本低、灵敏度高、特异性好，结果的重复性好等优点。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种指导盐酸右美托咪定用药相关基因多态性检测的引物组、试剂盒及方法，具有操作简单、检测快速、准确性高及特异性好等优点。

本发明提供一种用于指导盐酸右美托咪定用药相关基因多态性检测的引物组，所述引物组包括特异性引物及探针，如下：

cyp2a6*1正向引物：

5’-aaaatgggcatgaacgccc-3’；

cyp2a6*1反向引物：

5’-gaggggcgcagctaagac-3’；

cyp2a6*4反向引物：

5’-cggaagaggcgggtataagaa-3’；

cyp2a6*1检测探针：

5’fam-ctttccgccatcct-3’；

cyp2a6*4检测探针：

5’vic-ctttcccgcatctt-3’。

本发明还提供一种用于指导盐酸右美托咪定用药相关基因多态性检测的试剂盒，包括含有如上文所述的特异性引物及探针的pcr反应液，所述pcr反应液包括cyp2a6*1正向引物、cyp2a6*1反向引物、cyp2a6*4反向引物、cyp2a6*1检测探针、cyp2a6*4检测探针、10×pcrbuffer，dntps、hs-taq酶及无核酸酶水。

在本发明提供的所述试剂盒一较佳实施例中，所述pcr反应液的成分终浓度为：1×pcrbuffer，0.1～0.3μmcyp2a6*1正向引物、0.1～0.3μmcyp2a6*1反向引物、0.1～0.3μmcyp2a6*4反向引物、0.1～0.3μmcyp2a6*1检测探针、0.1～0.3μmcyp2a6*4检测探针，0.2～0.3mm的dntps，1u的hs-taq酶。

在本发明提供的所述试剂盒一较佳实施例中，还包括阳性对照品一、阳性对照品二及阳性对照品三；

所述阳性对照品一为30ng/ul的cyp2a6*4基因位点野生型质粒；

所述阳性对照品二为30ng/ul的cyp2a6*4基因位点野生型与突变型按1：1数量比杂合的质粒；

所述阳性对照品三为30ng/ul的cyp2a6*4基因位点突变型质粒。

在本发明提供的所述试剂盒一较佳实施例中，还包括空白对照品，所述空白对照品为无核酸酶水。

本发明还提供一种指导盐酸右美托咪定用药相关基因多态性检测多态性的方法，包括如下步骤：

步骤一：取待检测样本抽提的dna，作为pcr模板；

步骤二：提供如上文所述的试剂盒，取出适量pcr反应液，将所述pcr反应液与适量所述pcr模板混匀；

步骤三：进行pcr扩增反应：25℃ung酶处理10min；95℃变性5min；40cycles，95℃15sec，60℃30sec；

步骤四：pcr结果判定：在所述试剂盒的阳性对照品和空白对照品符合规定的情况下，根据荧光扩增曲线得到ct值进行结果判定，得到待测样本的基因型。

相较于现有技术，本发明提供的用于指导盐酸右美托咪定用药相关基因多态性检测的引物组、试剂盒及方法的有益效果在于：通过设计特异性高的引物及taqman-mgb荧光检测探针并通过检测荧光的释放和强度来检测基因多态性，得到cyp2a6*4的基因型，在给药时，给予含有cyp2a6*4等位基因的患者更多的注意力，以防不良反应的发生；此外再配置成使用方便且检测结果可靠的试剂盒，设计出科学合理的pcr反应体系，使得本发明具有操作简单、检测快速、准确性高及特异性好的特点。

附图说明

图1为临床样本cyp2a6*4野生型的pcr扩增曲线图；

图2为临床样本cyp2a6*4杂合型的pcr扩增曲线图；

图3为临床样本cyp2a6*4突变型的pcr扩增曲线图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：试剂盒的制备

一、引物和探针的设计与合成

针对人基因组中cyp2a6*4基因位点(序列参见ncbi数据库公开的人类全基因组序列)，使用primerpremier3.0及methylprimerexpressv1.0软件，分别设计特异性引物及mgb标记的探针。

特异性引物及探针序列，如表一所示：

表一、特异性引物及探针序列

二、对照品选择

阳性对照品一为30ng/ul的cyp2a6*4基因位点野生型质粒；

阳性对照品二为30ng/ul的cyp2a6*4基因位点野生型与突变型按1：1数量比杂合的质粒；

阳性对照品三为30ng/ul的cyp2a6*4基因位点突变型质粒；

空白对照品为无核酸酶水。

三、pcr反应液组成

所述pcr反应液包括cyp2a6*1正向引物、cyp2a6*1反向引物、cyp2a6*4反向引物、cyp2a6*1检测探针、cyp2a6*4检测探针、10×pcrbuffer，dntps、hs-taq酶及无核酸酶水。

其中，所述10×pcrbuffer、dntp及无核酸酶水均购自大连宝生物(宝生物(大连)工程有限公司)；所述无核酸酶水为(nuclease-freewater)用depc(diethylpyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压灭菌的超纯水；hs-taq酶(takarataqhotstartversion，购自大连宝生物)是针对普通taqdna聚合酶灵敏度高，易产生非特异性条带的情况，专门研制的高特异性嗜热dna聚合酶产品。

所述pcr反应液成分的终浓度为：1×pcrbuffer，0.1～0.3μmcyp2a6*1正向引物、0.1～0.3μmcyp2a6*1反向引物、0.1～0.3μmcyp2a6*4反向引物、0.1～0.3μmcyp2a6*1检测探针、0.1～0.3μmcyp2a6*4检测探针，0.2～0.3mm的dntps，1u的hs-taq酶，无核酸酶水适量(将体系补充至18.5ul)。

实施例2：利用上述试剂盒检测cyp2a6*4基因多态性的方法

一、生物样本

本发明所采用的生物材料均来自湘雅医学检验所。为2016年6-12月期间在湘雅医学检验所检测的500例剩余人群抗凝血。

二、取待检测样本抽提的dna，作为pcr模板：

dna提取试剂盒为自主研发的提取试剂盒《核酸提取或纯化试剂》进行提取(备案号：湘长械备20150166)。

1)取无菌的1.5mlep管，加入250ul全血；

2)加750ul细胞裂解液，颠倒混匀5-6次，室温静置10min；

3)12000rpm离心1.5min；倒掉上部废液，收集管底沉淀；

4)依次加入20ul蛋白酶k、250ul裂解液abl，涡旋振荡10s，65℃水浴15min，期间振荡混匀2-3次；

5)取出，加入250ul无水乙醇，涡旋振荡10s，短暂离心5s；

6)将吸附柱插入收集管中，将上一步所得混合液转移至吸附柱中；10,000rpm离心1min；

7)弃收集管中废液，将吸附柱重新放入收集管；加入500ul洗液i，10,000rpm，1min离心；

8)弃收集管中废液，加入700ul洗液ii，10,000rpm，1min，离心。弃废液；(洗液ii使用前需加入无水乙醇至80％)

9)重复步骤8一次；

10)弃流出液，将吸附柱插回收集管，空转离心，13,000rpm，2min；

11)将吸附柱插入到新的ep管中；加入30-100uldna溶解液(65℃预热可提高dna获得率)，室温静置5min；

12)10,000rpm，1min，离心，弃吸附柱，ep管内液体即为dna溶液。2-8℃保存，若需长期保存请置于-20℃或更低温度。

三、提供所述试剂盒，取出适量pcr反应液，将所述pcr反应液与适量所述pcr模板混匀：

从试剂盒中取出所需数量pcr反应液连管(每检测位点的pcr管数＝样本数+1个空白对照+3个阳性对照)；

pcr反应液室温融解后，瞬时离心，揭开管盖；

从待检样本dna(或对照品)中取1.5μl加至pcr反应液中；

振荡混匀后，瞬时离心10s，将其移至扩增区。

四、进行pcr扩增反应：25℃ung酶处理10min；95℃变性5min；40cycles，95℃15sec，60℃30sec。

使用的pcr仪器为abi7500或杭州博日fqd-96a荧光定量聚合酶链式反应(pcr)检测系统，反应体系为20ul；

pcr反应条件如表二所示：

表二、pcr扩增反应条件

五、pcr结果判定：在所述试剂盒的阳性对照品和空白对照品符合规定的情况下，根据荧光扩增曲线得到ct值进行结果判定，得到cyp2a6*4的基因型。

结果有效性判定，如表三所示：

表三

空白对照结果为阴性(noct或ct值≥38)。

pcr结果判定，如表四所示：

表四

基于本发明的临床样本各基因位点检测结果，参见图1-图3，其中图1为临床样本cyp2a6*4野生型的pcr扩增曲线图，图2为临床样本cyp2a6*4杂合型的pcr扩增曲线图，图3为临床样本cyp2a6*4突变型的pcr扩增曲线图。

实施例3：cyp2a6*4的基因型用药指导

cyp2a6*4通过影响cyp2a6酶含量的表达而改变酶活性或直接导致酶活性的丧失。因此在给药时，应结合临床给予含有cyp2a6*4等位基因的患者留有足够的注意力，以防不良反应的发生。由荧光定量pcr中的结果判定(表四)得出cyp2a6*4的基因型。医生根据cyp2a6基因型和表型对应得的关系，详见表五，结合患者的病理生理特征、合并用药、临床表现等其他因素进行综合判断以确定最终用药方案。

表五

本发明提供的用于指导盐酸右美托咪定用药相关基因多态性检测的引物组、试剂盒及方法的有益效果在于：通过设计特异性高的引物及taqman-mgb荧光检测探针并通过检测荧光的释放和强度来检测基因多态性，得到cyp2a6*4的基因型，在给药时，给予含有cyp2a6*4等位基因的患者更多的注意力，以防不良反应的发生；此外再配置成使用方便且检测结果可靠的试剂盒，设计出科学合理的pcr反应体系，使得本发明具有操作简单、检测快速、准确性高及特异性好的特点。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

sequencelisting

<110>韩林志

<120>用于指导盐酸右美托咪定用药相关基因多态性检测的引物组、试剂盒及方法

<130>2017

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<170>patentinversion3.5

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<213>人工序列（artificialsequence）

<400>1

aaaatgggcatgaacgccc19

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<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>2

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