本发明涉及精油提取技术领域，特别是涉及一种虎掌菌精油的提取方法及其应用。
背景技术：
虎掌菌，也称为翘鳞肉齿菌，属于菌物界，担子菌门，伞菌纲，革菌目，坂氏菌科。野生虎掌菌因其外观独特、无盖无柄、菌体表面有纤细的绒毛及黑色的花纹，酷似虎掌因而得名。虎掌菌大体可分为黑虎掌菌、黄鳞多孔菌(黄虎掌菌)、虎掌菌。在我国主要分布在四川、云南、甘肃等地。云南主要产地有楚雄、丽江等。因其采摘困难，且产量少，故较为珍贵。我国中医认为虎掌菌是一味很好的中药材，其性平味甘，有驱寒除湿、活血化瘀、益气养阴、润肠通便等功效。虎掌菌还可降低血液中胆固醇、防癌保健等。研究表明野生虎掌菌对小白鼠肉瘤180抑制率高达96.8％。同时现代医学认为它可以提高人体免疫功能，低脂肪、低胆固醇、低热值等优点使其成为天然减肥食品以及理想的保健食品之一。
精油，是从植物的花、叶、茎、根或果实中，通过水蒸气蒸馏法、挤压法、冷浸法或溶剂提取法提炼萃取的挥发性芳香物质。精油具有亲脂性，很容易溶在油脂中。精油由萜烯类、醛类、酯类、醇类等化学分子组成。
超临界流体萃取技术，是一项发展很快、应用很广的实用性新技术，尤其是从天然动植物中提取一些有价值的生物活性物质，显示出了巨大的优势。即易于和产物分离，安全无毒，操作温和不破坏有效成分。该技术现已成功用于啤酒花萃取，植物中香精油等风味物质的萃取，从动物油中萃取各种脂肪酸，从天然产物中萃取药用成分，从土壤里面提取总烃，从土壤里面提取有机物等等。用超临界流体萃取法萃取香料不仅可以有效地提取芳香组分，而且还可以提高产品纯度，能保持其天然香味，如从桂花、茉莉花、菊花、梅花、米兰花、玫瑰花中提取花香精，从胡椒、肉桂、薄荷中提取香辛料，从芹菜籽、生姜、莞姜籽、苗香、砂仁、八角、孜然等原料中提取精油，不仅可以用作调味香料，而且一些精油还具有较高的药用价值。
目前，国内外还没有公开任何关于利用虎掌菌进行精油提取的技术、以及开发一种具有抗氧化、清除亚硝、天然无污染的精油产品及应用的相关报道。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明提供一种风味独特、萃取得率高、纯度高无污染，而且具有抗氧化等功能的纯天然虎掌菌精油的提取方法及其应用。
一种虎掌菌精油的提取方法，包括以下步骤：
(1)原料的制备：挑选无霉烂的干虎掌菌，将虎掌菌中的灰尘及其他杂志颗粒除去，选用高速万能粉碎机进行粉碎，过40目筛，即得到虎掌菌粉，用电子天平进行称重，真空包装后备用；
(2)采用超临界流体萃取法对虎掌菌粉进行萃取：
(3)萃取产物的接收：用50ml的棕色取样品进行接收萃取产物，即得到虎掌菌精油，通过封口膜进行密封以防挥发。
优选的，步骤(2)中的萃取流程如下：
a、称取虎掌菌粉装入到设备的萃取釜中；
b、接通电源，依次设置萃取参数，萃取压力25-35mpa、萃取温度50-60℃、分离压力5-10mpa及分离温度20-30℃时，按照流程，打开萃取釜、各级分离器的加热开关，同时打开制冷开关，调节各自温控仪到指定值；
c、当冷冻机温度将至5-8℃，且萃取釜、各级分离器的温度接近设定值且稳定时，打开主泵，去除萃取分离系统内的空气然后升压至萃取压力，通过调节萃取釜和分离器的高压气体节流阀，使各个釜达到设定值压力且co2流量达接近设定值；
d、机器开始自动运行，一定时间后，得到萃取产物即虎掌菌精油；
e、关机，先将主泵关闭，再将萃取釜的进气阀关闭，同时关闭各种加热循环开关，再关闭总电源开关，待萃取釜内压力与各级分离器等压力平衡后，关闭分离器回路阀，打开放气阀进行放气卸压。
优选的，所述的虎掌菌精油可以应用于火腿或者风味丸子。
优选的，所述的虎掌菌精油应用于火腿的方法，包括以下步骤：虎掌菌精油浓度为6-8％，均匀涂抹于肉制品表面，使其充分吸收，然后进行腌制风干晾晒，即可。
优选的，所述的虎掌菌精油应用于风味丸子的方法，包括以下步骤：将猪肉切丁放入斩拌机中斩拌，在斩拌过程中加入含有虎掌菌精油的辅料和斩拌助剂，将原料混匀并静置后，放入模具定型，沸水中煮制，即可。
与现有技术相比本发明的有益效果为：本发明首次公开了一种食用菌即虎掌菌精油提取方法，包括原料的处理，采用超临界流体萃取法对虎掌菌粉进行萃取，以及萃取产物的接收，最终得到一种香气浓郁，颜色明亮，具有抗氧化和降低亚硝酸钠活性功能的虎掌菌风味的精油。通过超临界流体萃取技术得到的虎掌菌精油不同于传统方法如溶剂提取法提取的精油，不含溶剂残留，纯度较高且品质好，香气更加浓郁，可以作为新的防腐剂和天然调味剂，加入到肉制品或制成丸子，开发出新的产品。同时，因为虎掌菌具有抗氧化、提高免疫力等功效，虎掌菌精油也可作为保健品进行推广。符合现代人所追求的绿色健康食品观念，达到了有限资源高值利用。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
一种虎掌菌精油的提取方法，包括以下步骤：
(1)原料的制备：挑选无霉烂的干虎掌菌，将虎掌菌中的灰尘及其他杂志颗粒除去，选用高速万能粉碎机进行粉碎，过40目筛，即得到虎掌菌粉，用电子天平进行称重，真空包装后备用；
(2)超临界流体萃取机器的萃取：
a、称取800g的虎掌菌粉装入到设备的萃取釜中
b、接通电源，依次设置萃取参数，萃取压力30mpa、萃取温度55℃、分离压力8mpa及分离温度25℃时，按照流程，打开萃取釜、各级分离器的加热开关，同时打开制冷开关，调节各自温控仪到指定值。
c、当冷冻机温度将至6℃左右，且萃取釜、各级分离器的温度接近设定值且稳定时，打开主泵，去除萃取分离系统内的空气然后升压至萃取压力，通过调节萃取釜和分离器的高压气体节流阀，使各个釜达到设定值压力且co2流量达接近设定值。
d、机器开始自动运行，一定时间后，得到萃取产物即虎掌菌精油。
e、关机，先将主泵关闭，再将萃取釜的进气阀关闭，同时关闭各种加热循环开关，再关闭总电源开关，待萃取釜内压力与各级分离器等压力平衡后，关闭分离器回路阀，打开放气阀进行放气卸压。
(3)萃取产物的接收
用50ml的棕色取样品进行接收萃取产物，即虎掌菌精油。通过封口膜进行密封以防挥发。
实施例2
一种虎掌菌精油的提取方法，包括以下步骤：
(1)原料的制备：挑选无霉烂的干虎掌菌，将虎掌菌中的灰尘及其他杂志颗粒除去，选用高速万能粉碎机进行粉碎，过40目筛，即得到虎掌菌粉，用电子天平进行称重，真空包装后备用；
(2)超临界流体萃取机器的萃取：
a、称取800g的虎掌菌粉装入到设备的萃取釜中
b、接通电源，依次设置萃取参数，萃取压力35mpa、萃取温度50℃、分离压力10mpa及分离温度20℃时，按照流程，打开萃取釜、各级分离器的加热开关，同时打开制冷开关，调节各自温控仪到指定值。
c、当冷冻机温度将至8℃左右，且萃取釜、各级分离器的温度接近设定值且稳定时，打开主泵，去除萃取分离系统内的空气然后升压至萃取压力，通过调节萃取釜和分离器的高压气体节流阀，使各个釜达到设定值压力且co2流量达接近设定值。
d、机器开始自动运行，一定时间后，得到萃取产物即虎掌菌精油。
e、关机，先将主泵关闭，再将萃取釜的进气阀关闭，同时关闭各种加热循环开关，再关闭总电源开关，待萃取釜内压力与各级分离器等压力平衡后，关闭分离器回路阀，打开放气阀进行放气卸压。
(3)萃取产物的接收
用50ml的棕色取样品进行接收萃取产物，即虎掌菌精油。通过封口膜进行密封以防挥发。
实施例3
一种虎掌菌精油的提取方法，包括以下步骤：
(1)原料的制备：挑选无霉烂的干虎掌菌，将虎掌菌中的灰尘及其他杂志颗粒除去，选用高速万能粉碎机进行粉碎，过40目筛，即得到虎掌菌粉，用电子天平进行称重，真空包装后备用；
(2)超临界流体萃取机器的萃取：
a、称取800g的虎掌菌粉装入到设备的萃取釜中
b、接通电源，依次设置萃取参数，萃取压力25mpa、萃取温度60℃、分离压力6mpa及分离温度30℃时，按照流程，打开萃取釜、各级分离器的加热开关，同时打开制冷开关，调节各自温控仪到指定值。
c、当冷冻机温度将至5℃左右，且萃取釜、各级分离器的温度接近设定值且稳定时，打开主泵，去除萃取分离系统内的空气然后升压至萃取压力，通过调节萃取釜和分离器的高压气体节流阀，使各个釜达到设定值压力且co2流量达接近设定值。
d、机器开始自动运行，一定时间后，得到萃取产物即虎掌菌精油。
e、关机，先将主泵关闭，再将萃取釜的进气阀关闭，同时关闭各种加热循环开关，再关闭总电源开关，待萃取釜内压力与各级分离器等压力平衡后，关闭分离器回路阀，打开放气阀进行放气卸压。
(3)萃取产物的接收
用50ml的棕色取样品进行接收萃取产物，即虎掌菌精油。通过封口膜进行密封以防挥发。
以下对实施例1的样品进行检测：
1、虎掌菌精油理化性质的测定
(1)色泽：以肉眼进行的感官色泽描述；
(2)相对密度：参照gb/t5526-1985比重瓶法测定；
(3)折光指数：参照gb/t5527-2010测定；
(4)酸值：参照gb/t5509.229-2016测定；
(5)过氧化值：参照gb/t5534-2008测定；
(6)皂化值：参照gb/t5509.227-2016测定；
实验测得虎掌菌精油呈浅黄色，相对密度和折光指数均在国家食用油标准范围之内，酸值3.2mgkoh/g，过氧化值为0.25meq/kg，皂化值高达185.5mgkoh/g，表明超临界流体萃取条件适宜，各项理化指标均良好，得到的虎掌菌精油纯度较高、品质好。
2、抗氧化能力指标测定
(1)清除dpph自由基：用无水乙醇配制质量浓度分别为20、50、100、150、200μg/ml的虎掌菌精油溶液，配制同样质量浓度的vc溶液、bht溶液作为对照样品溶液。取2ml样品溶液和2ml浓度为0.2mmol/l的dpph溶液，混匀后室温暗反应30min，以95％乙醇调零，测定517nm波长处的吸光度a样品，同样测定2ml样品溶液与2ml95％乙醇混合后517nm波长处的吸光度a对照，再测定2mldpph溶液与2ml60％乙醇混合液在517nm波长处的吸光度a空白。
dpph清除率＝[1-(a样品-a对照)/a空白]×100％
虎掌菌精油对dpph自由基具有一定的清除能力，vc、bht和虎掌菌精油清除dpph自由基的ic50分别为36、52、47μg/ml，可见样品虎掌菌精油对dpph自由基清除能力总体强于bht，没有vc清楚能力强，当虎掌菌精油质量浓度为0.012g/ml时对dpph自由基清除率达到81.13％。
(2)清除羟基自由基：用无水乙醇配制质量浓度分别为20、50、100、150、200μg/ml的虎掌菌精油溶液，配制同样质量浓度的vc溶液、bht溶液作为对照样品溶液。取样品溶液2ml，依次加入1ml0.01mol/lfeso4、1.5ml10％h2o2溶液,混匀静置10min，再加入2ml0.01mol/l水杨酸溶液，混匀后37℃的恒温水浴锅中反应30min，510nm波长处测其吸光度。分别以1.5ml蒸馏水代替双氧水、2ml无水乙醇代替样品同法测得的吸光度(重复3次)。
清除率＝a0-(a样品-a1)/ao×100％
a0为空白对照液中的吸光度
a1为未加过氧化氢溶液样品的吸光度
虎掌菌精油、vc、bht对羟自由基的清除能力均呈现明显的量效关系，随着质量浓度的增加清除羟自由基的清除能力增大；vc、bht和虎掌菌精油清除羟自由基的ic50分别为54、82、71μg/ml，可见虎掌菌精油对羟自由基的清除效果要明显强于vc。当虎掌菌精油质量浓度为200μg/ml时对羟自由基的清除率达到了76％，要强于同质量浓度的bht，低于vc
(3)abts+清除能力测定：配制2mmol/labts溶液，吸取50mlabts溶液与200ml70mmol/lk2s2o8溶液混合，室温避光放置12-16h后得到abts+溶液。用磷酸缓冲液ph7.0-7.2将abts+溶液稀释至在734nm波长处吸光度为0.70±0.02。用无水乙醇配制质量浓度分别为20、50、100、150、200μg/ml的虎掌菌精油溶液，配制同样质量浓度的vc溶液、bht溶液作为对照样品溶液。取0.1ml样品溶液，加入1.9mlabts+溶液，在734nm测其吸光度(重复3次)。
清除率＝(a0-a)/a0×100％
式中：a0为abts+溶液的吸光度；a为加虎掌菌精油溶液后的吸光度。
虎掌菌精油对abts+的清除作用与其质量浓度呈正相关，当虎掌菌精油质量浓度为200μg/ml时清除率达到83％，高于同质量浓度的bht(66％)，低于同质量浓度的vc(91％)；虎掌菌精油、bht和vc清除abts+的ic50分别为61、72、49μg/ml，可见虎掌菌精油对abts+的清除作用要强于bht低于vc。
虎掌菌精油体外抗氧化活性实验表明虎掌菌精油对dpph自由基、abts+和羟自由基的ic50均高于bht低于vc，说明虎掌菌精油具有较强的体外抗氧化能力，虽然抗氧化作用效果不及vc，但可以添加到肉制品中在抗氧化的同时增加特殊的风味。
以下为应用实例：
应用例1
将本发明实施例1制备的虎掌菌精油加入到火腿中，其生产方法，按火腿重量计，用食盐3.5％-5％，虎掌菌精油浓度为6％-8％组成佐料，步骤如下：
(1)火腿的腌制：先将备好的虎掌菌精油和食盐按以上比例混合均匀成佐料，依据腌制的火腿重量取对应量的佐料，首先观察，肉质厚的火腿按重量的8％取佐料，肉质薄的火腿按重量的5.5％取佐料，肉质相对处于中等厚度的火腿按重量，在5.5％-8％之间的适合数据取佐料；
(2)上佐料方法：分3次涂抹配好的佐料，每次均匀涂在火腿表面，立即揉搓，至佐料浸入火腿肉质中，再二次上佐料揉搓，之后上三次佐料揉搓，至直火腿肉质中浸出的水溢出在表面；
(3)堆叠腌制：堆叠腌制至少30天，期间五天翻堆一次，将堆叠中的火腿按上面的火腿翻堆在下层，中部的逐次往上移，使其中的水分挤压外溢；
(4)吊挂风干：将堆叠30天以上的拆堆，逐只吊挂在通风的车间内风干，待风干至火腿,重量至少降低到鲜火腿重量的70％时，转入发酵车间；
(5)发酵：上述步骤得到的风干火腿在发酵车间，按常规的火腿腌制工艺，要求相对湿度不超过72％，温度13℃-16℃条件下发酵3个月后成为虎掌菌风味火腿。
将火腿与虎掌菌精油结合，利用虎掌菌特有的风味和防腐的功效，减少用盐量，同时可以改善火腿的口感问题，突破传统的火腿加工工艺，开发具有云南特色、野生菌和火腿相结合的产品，延长产业链条，促进火腿的发展。
应用例2
将本发明实施例1制备的虎掌菌精油应用于风味丸子，其加工方法，与实施例1基本相同，其区别在于：
(1)原料的选择：选择去除结缔组织的猪后腿瘦肉、肥肉切成2×2×2厘米的肉丁待用；
(2)辅料的制备：将虎掌菌精油8％、50ml，坏血酸钠0.2kg，甘草0.25kg，大蒜500g，料酒20g、五香粉20g、胡椒粉150g、盐500g、糖少量、耗油制成辅料混合；
(3)斩拌助剂的制备：淀粉10kg，单硬脂酸甘油酯40g、蔗糖脂酸酯120g、改性大豆磷脂200g、硬脂酰乳酸钠200g；
(4)将切好的瘦肉块放入斩拌机内进行剁制，斩碎、5min后边斩边加入肥肉丁和斩拌助剂，2min后加入辅料，总共斩拌10min左右，将各种原料混匀，在4℃下静置2h得到肉馅；
(5)模具上模：将斩拌后的肉泥放入丸子筛盘上，大小均匀一致，在沸水100℃时放入煮制，即可得到虎掌菌风味丸子。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。