本发明涉及一种装载白藜芦醇的聚乙二醇-b-聚(3-羟基丁酸酯-3-羟基戊酸酯)聚合物胶束的制备方法，属于生物医学领域，应用于食品科学、药物释放或医疗器械领域。
背景技术：
聚合物胶束是近几年发展起来的一种新型药物释放系统，是两亲性共聚物在水溶液中通过自组装形成的具有典型壳-核结构的纳米粒子，其中疏水性药物可通过疏水相互作用进入胶束内核，有效改善其水中溶解度，而亲水嵌段则在胶束内核的周围构成胶束的外壳，用来稳定胶束。
聚(3-羟基丁酸酯-3-羟基戊酸酯)(phbv)是微生物在碳源过量，氮源、磷源缺乏时，积累在其体内作为营养和能量储存物质参与细胞代谢的热塑性脂肪族聚酯。其优异的生物相容性、缓慢的降解速率和无酸性降解产物以及对细胞的医疗或营养价值，被广泛用作控释和缓释载体，提供活性物质持续可控释放。然而，phbv韧性和亲水性较差，是限制其应用的最具有挑战性的关键科学问题和瓶颈难点。聚乙二醇(peg)是一种水溶性高分子，毒性低、免疫原性及抗原性低，被广泛用作两亲性聚合物纳米粒亲水链段，生物降解生物相容性好，可以作为聚合物亲水段，形成胶束壳层，使胶束自带有稳定性，延长胶束的循环时间。
白藜芦醇(resveratrol，res)又称芪三酚，是一种天然的二苯乙烯类多酚物质，主要存在于虎杖、藜芦、葡萄、花生、桑葚等植物中。这种多羟基芪物质是植物在外来病菌侵入、紫外线照射等不利因素影响下产生的一种植物抗毒素，对植物本身起保护作用。作为一种有芪类结构的天然非黄酮活性化合物，res不仅有抗炎、抗血栓等功效，而且具有良好的防治心血管疾病、强抗氧化性和清除自由基功效，被美国《抗衰老圣典》列为100种最有效的抗衰老物质之一，在食品、营养增补品、化妆品、医药等行业有着广阔的应用前景和开发利用价值。目前国际上对白藜芦醇的研究开发十分广泛，富含白藜芦醇的保健品、药品和酒类的相关产品很多，白藜芦醇的生物活性在全球范围内已经得到基本的认可。
但是，作为一种天然的食品活性成分，白藜芦醇具有活泼的酚羟基结构，晶型过大，水溶性较低(仅为2.68mg·l-1)、在体内不易被吸收，稳定性较差、半衰期短(8～14min)、代谢和排泄过于迅速，生物利用度低，使其抗氧化性和去除自由基功效大大降低，严重影响了其生理活性的发挥。因此，探究提高白藜芦醇的水溶性、促进其吸收以及提高其生物利用度的方法，是目前食品营养领域研究的热点和难题。
本发明针对目前白藜芦醇水溶性差，体内代谢速度快且稳定性差的缺点，利用二异氰酸酯为偶联剂，采用不同分子量的peg与phbv进行偶联反应，制备peg-b-phbv嵌段共聚物。乳化-溶剂蒸发法构建不同peg分子量的白藜芦醇嵌段聚合物胶束。这种方法将生物相容生物降解且无酸性代谢物的phbv和peg的功能特征应用于白藜芦醇的装载和稳定化，开发长效稳定的白藜芦醇-peg-b-phbv嵌段缓释胶囊，提高白藜芦醇的生物利用度。
技术实现要素：
本发明基于peg/phbv开发一种可装载白藜芦醇的生物降解生物相容、可控缓释的胶束结构，phbv在体内逐渐分解成羟基丁酸，最终代谢产物为水和二氧化碳，是可用作医用手术缝合线、注射用微胶囊和微球等注射制剂的辅料；peg是经fda批准的极少数能作为体内注射用的聚合物之一，peg-b-phbv作为聚合物胶束载体安全性极好。
本发明以具有良好生物相容性和生物降解性的phbv和peg为基体，利用六亚甲基二异氰酸酯(hdi)为偶联剂，有机锡为催化剂，利用phbv链末端带有端羟基，而peg分子也有端羟基，通过-nco基团易于与羟基反应，生成-nh-co-，将peg和phbv偶联起来，在t-12催化下制备不同分子量(400，2000，4000，8000，20000)的peg-b-phbv嵌段共聚物。乳化-溶剂蒸发法构建不同peg分子量的白藜芦醇嵌段共聚胶束，在水溶液中，phbv链段聚集组成胶束的疏水内核，包裹白藜芦醇进入微球，peg则形成胶束的外壳，其亲水性能够减少网状内皮系统对于微球的摄取从而使微球在体内循环时间大大延长，更容易达到病灶组织发挥药效，可以达到在水溶液中自组装制备载体的目的。同时药物被高分子材料负载成为载药纳米粒子具有裸药所不能比拟的低毒性，这为在以后的使用中增加药物的使用剂量而不引起毒性反应提供了依据。脂肪族hdi同芳香族甲苯二异氰酸酯(tdi)相比，分子链柔顺，不会增加产物的刚性，在降解过程中不会产生对人体有害的产物-芳香胺。因此，该制备方法可有效地提高白藜芦醇的生物活性和水溶性，制备工艺简单，反应条件温和，可为发展新一代智能、高效的载药系统提供有益的技术和理论参考。
本发明的目的由以下技术配方实现：
一种通过偶联法构建peg-b-phbv的嵌段共聚物，以所述体系的总质量为100％计，其中各组分及质量百分数如下：聚(3-羟基丁酸酯-3-羟基戊酸酯)(phbv)42～45％；聚乙二醇(peg)42～45％；六亚甲基二异氰酸酯(hdi)10～15％；二月桂酸二丁基锡(t-12)0.10～0.15％。
本发明所述白藜芦醇嵌段共聚胶束的制备方法如下：
a)将不同分子量的peg溶于三氯甲烷中配成溶液；同时配制phbv的三氯甲烷溶液；
b)向peg溶液中依次加入hdi和t-12；
c)反应0.5h后把phbv溶液加到peg溶液中，搅拌反应4～5h，反应温度控制在45～60℃；
d)反应结束后倒出反应液，室温下干燥48h以彻底除去溶剂；
e)将所得产物在索氏抽提器内用水抽提24h，除去未与phbv反应的peg，得到的粉末冷冻干燥，即为嵌段共聚物。
f)采用乳化-溶剂挥发法。精确称量30～150mg嵌段共聚物和5～15mg白藜芦醇样品，加入适量三氯甲烷溶解，逐滴匀速加入到60ml0.5～2.0％聚乙烯醇(pva)水溶液中，于室温下磁力搅拌过夜。蒸发溶剂，12000r/min离心10min，去离子水洗2次，冷冻干燥得胶束粉末。
本发明方法所使用的原材料简单易得，phbv及peg是目前市场上常见的全生物降解塑料，很容易买到。phbv由杭州天安生物股份有限公司提供，peg由天津大茂化学试剂厂购买。白藜芦醇，98％，由索莱宝生物科技有限公司提供；聚乙烯醇(pva)，87-89％水解度，由sigma-aldrich公司购买。hdi，t-12，均属于阿拉丁试剂。
与国内外现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)应用peg-b-phbv共聚物制备res胶束给药系统，国内外尚未见文献报道，技术绿色环保，且方法简单容易实现，有利于医学应用。
(2)采用peg-b-phbv包裹疏水性药物，制备的胶束粒子由疏水性的聚羟基丁酸酯-羟基戊酸酯组成内核，亲水性的聚乙二醇为外壳，对于疏水性药物具有较高的包载率。白藜芦醇属于水难溶性药物。嵌段共聚物在水性介质中可自组装形成核壳结构的胶束。
(3)通过安全无毒亲水的peg-b-phbv嵌段共聚胶束装载白藜芦醇，解决了白藜芦醇作为健康食品原料进食后快速释放和降解，降低活性并影响保健效果的科学难题，为拓宽白藜芦醇活性因子在食品科学领域中的实际应用提供了潜在的应用前景。
独特之处在于：
选择安全性极好的peg-b-phbv作为聚合物胶束的载体，通过典型壳-核结构的形成，对白藜芦醇进行装载，这是将聚酯基生物高分子嫁接于膳食功能因子的保护和传递的又一重要补充和发展。通过安全无毒亲水的peg-b-phbv嵌段共聚胶束装载白藜芦醇，解决了白藜芦醇作为健康食品原料进食后快速释放和降解，降低活性并影响保健效果的科学难题，为拓宽白藜芦醇活性因子在食品科学领域中的实际应用提供了潜在的应用前景。对于补充超分子体系理论，填补国内外在peg-b-phbv嵌段传递载体领域的空白，改善难溶性药物口服生物利用度，降低体内因反复用药引起血液中的低毒反应提供了新思路和新方法，具有很大的现实意义。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步说明，但实施例仅用于说明，并不限制发明的范围。
实施例1：
将2.0gpeg2000溶于20ml三氯甲烷中配成溶液，将2.0gphbv溶于20ml三氯甲烷中配成溶液。向peg溶液中依次加入600μlhdi和6μlt-12，反应0.5h后把phbv溶液加到peg溶液中，搅拌反应4h，整个反应过程温度控制在50℃。反应结束后倒出反应液，室温下干燥48h以彻底除去溶剂。将所得产物在索氏抽提器内用水抽提24h，除去未与phbv反应的peg，得到的粉末即为嵌段共聚物，提取率64.4％。
采用乳化-溶剂挥发法精确称量150mg共聚物和5mg白藜芦醇，加入20ml三氯甲烷溶解，逐滴匀速加入到60ml1％pva水溶液中，于室温下磁力搅拌过夜。蒸发溶剂，12000r/min离心10min，去离子水洗2次，冷冻干燥，得固体粉末。扫描电镜观察到白藜芦醇本身呈棒状结构，而在白藜芦醇嵌段胶束中呈球形，有微孔，表明嵌段胶束对白藜芦醇的包裹成功构建。体外缓释实验发现，胶束在初期释放白藜芦醇较快，此后释放平稳，白藜芦醇被载入胶束后，可以达到一个长时释放的效果。
实施例2：
将2.0gpeg4000溶于20ml三氯甲烷中配成溶液，将2.0gphbv溶于20ml三氯甲烷中配成溶液。向peg溶液中依次加入600μlhdi和6μlt-12；反应0.5h后把phbv溶液加到peg溶液中，搅拌反应4h，整个反应过程温度控制在50℃。反应结束后倒出反应液，室温下干燥48h以彻底除去溶剂，提取率73.4％。将所得产物在索氏抽提器内用水抽提24h，除去未与phbv反应的peg，最后得到的粉末即为嵌段共聚物。
采用乳化-溶剂挥发法制备白藜芦醇嵌段共聚胶束。精确称量100mg共聚物和5mg白藜芦醇，加入20ml三氯甲烷溶解，逐滴匀速加入到60ml1％pva水溶液中，于室温下磁力搅拌过夜。蒸发溶剂，12000r/min离心10min，去离子水洗2次，冷冻干燥，得固体粉末。扫描电镜观察到白藜芦醇本身呈棒状结构，而在白藜芦醇嵌段胶束中呈球形，表明嵌段胶束对白藜芦醇的包裹成功构建。体外缓释实验发现，胶束在初期释放白藜芦醇较快，此后释放平稳，在15天内共释放了约87％的白藜芦醇，证实白藜芦醇被载入胶束后，可以达到一个长时释放的效果。
实施例3：
将2.0gpeg8000溶于20ml三氯甲烷中配成溶液，将2.0gphbv溶于20ml三氯甲烷中配成溶液。向peg溶液中依次加入600μlhdi和6μlt-12；反应0.5h后把phbv溶液加到peg溶液中，搅拌反应4h，整个反应过程温度控制在50℃。反应结束后倒出反应液，室温下干燥48h以彻底除去溶剂。将所得产物在索氏抽提器内用水提抽24h，除去未与phbv反应的peg，最后得到的粉末即为嵌段共聚物，提取率73.4％。
采用乳化-溶剂挥发法制备白藜芦醇嵌段共聚胶束。精确称量50mg共聚物和5mg白藜芦醇，加入20ml三氯甲烷溶解，逐滴匀速加入到60ml1％pva水溶液中，于室温下磁力搅拌过夜。蒸发溶剂，12000r/min离心10min，去离子水洗2次，冷冻干燥，得固体粉末。扫描电镜观察到白藜芦醇本身呈棒状结构，而在白藜芦醇嵌段胶束中呈球形，表明嵌段胶束对白藜芦醇的包裹成功构建。体外缓释实验发现，胶束在初期释放白藜芦醇较快，此后释放平稳，白藜芦醇被载入胶束后，可以达到一个长时释放的效果。
实施例4：
将2.0gpeg400溶于20ml三氯甲烷中配成溶液，将2.0gphbv溶于20ml三氯甲烷中配成溶液。向peg溶液中依次加入600μlhdi和6μlt-12；反应0.5h后把phbv溶液加到peg溶液中，搅拌反应4h，整个反应过程温度控制在50℃。反应结束后倒出反应液，室温下干燥48h以彻底除去溶剂。将所得产物在索氏抽提器内用水提抽24h，除去未与phbv反应的peg，得到的粉末即为嵌段共聚物，提取率77.0％。
采用乳化-溶剂挥发法制备白藜芦醇嵌段共聚胶束。精确称量30mg共聚物和5mg白藜芦醇，加入20ml三氯甲烷溶解，逐滴匀速加入到60ml1％pva水溶液中，于室温下磁力搅拌过夜。蒸发溶剂，12000r/min离心10min，去离子水洗2次，冷冻干燥，得固体粉末。扫描电镜观察到白藜芦醇本身呈棒状结构，而在白藜芦醇嵌段胶束中呈球形，表明嵌段胶束对白藜芦醇的包裹成功构建。体外缓释实验发现，白藜芦醇被载入胶束后，胶束在初期释放白藜芦醇较快，此后释放平稳，可以达到一个长时释放的效果。