本发明涉及一类fxr拮抗剂，具体而言，涉及一类五环三萜类化合物，及其制备方法，以及包含所述化合物的药物组合物，在制备fxr拮抗剂中的用途，以及在制备治疗胆汁淤积、高血脂、糖尿病药物方面的用途。
背景技术：
：法尼酯衍生物x受体(thefarnesoidxreceptor,fxr)属于核受体超家族成员，高表达于肝脏、肠道、肾脏、肾上腺以及脂肪组织中。作为内源性胆汁酸的主要调节器，fxr受体在胆汁酸合成及其肝肠循环过程中发挥着关键作用。fxr可以通过肝肠代谢轴的复杂调控网络，调节体内甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白以及血糖的水平，此外fxr还参与到肝脏损伤和炎症、肝癌以及调节肠道菌群等过程中。因fxr参与到众多代谢类疾病，如胆汁酸代谢紊乱，脂代谢紊乱和糖代谢异常等过程中，fxr调节剂有望开发成为治疗胆汁淤积、高血脂、糖尿病等一系列代谢性疾病的药物。比如fxr强效激动剂奥贝胆酸(j.med.chem,2002,45,3569-3572)，其在治疗原发性胆汁性肝硬化的三期临床获得成功，已被批准上市。此外，奥贝胆酸在糖尿病并伴随非酒精性肝(nash)适应症方面正在开展临床研究。目前也有众多fxr拮抗剂的报道，而且部分化合物在体内药效学实验中表现出一定的降血脂、降血糖或者改善胆汁酸淤积的作用。有研究表明，肠道特异性fxr基因敲除小鼠不易患肥胖和胰岛素抵抗，并且该课题组发现一个可拮抗fxr受体的胆酸衍生物t-β-mca，它与一系列代谢功能改善具有相关性，但是该化合物可被肠道细菌分泌的胆酸盐水解酶bsh快速降解(naturecommunications,2013,4,3384)。最近文献又报道了一种胆汁酸衍生物gly-mca，它可以选择性关闭肠道内的fxr受体，能防止和逆转小鼠的脂肪肝，增加高脂饮食喂养小鼠对胰岛素和血糖的敏感度，并且不会被bsh降解(naturecommunications,2015,6,10166)。可见，开发fxr拮抗剂可能为治疗某些代谢性疾病，如肥胖、高血脂、ii型糖尿病和脂肪肝等提供了新的思路。现阶段报道的fxr拮抗剂主要包括两大类，天然产物类拮抗剂和合成类小分子拮抗剂。天然产物没药甾酮(gs)是首个被报道的fxr拮抗剂，但其选择性较差，对多种核受体均有作用。2007年carter等发现的植物甾醇stigmasterolacetate以及choi在2011年报道的一系列海洋天然产物tuberatolides都可以拮抗fxr，但因化合物天然来源有限且全合成难度较大，因此针对此类化合物的结构优化未见报道。首个非甾体类fxr小分子结抗剂由kainuma小组在2007年报道，由fxr激动剂gw4064改造而来。另一类代表性小分子拮抗剂是2012年李剑课题组发现的吡唑酮类化合物，该化合物在胆固醇喂养小鼠的体内药效学实验中可以剂量依赖地降低甘油三酯和总胆固醇的水平。无论是天然产物类还是合成类小分子fxr拮抗剂，普遍存在活性较弱的缺陷，且种类较少。它们大部分都是天然产物，结构复杂，不利于后续开发。目前，五环三萜类化合物用作fxr拮抗剂鲜有报道，首个被报道的五环三萜类fxr拮抗剂为桔梗皂苷d(eur.j.pharma,2006,537,166–173)，随后发现齐墩果酸也具有微弱的fxr拮抗活性(phytother.res.2010,24,369-373)。最近方唯硕课题组以齐墩果酸为改造起点，合成了一类3-beta-齐墩果酸衍生物(molecules，2017,22,690)，fxr拮抗活性有所提升，而至今尚未见白桦脂酸衍生物用于fxr拮抗剂的报道。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种用作法尼酯衍生物x受体(fxr)拮抗剂的五环三萜类化合物。本发明的第一方面，提供一种通式i所示的化合物或其药学上可接受的盐：r1为氢、羟基、卤素或c1-c6烷基；r2为氢、羟基、卤素、c1-c6烷氧基、3至10元环烷氧基、＝o、＝n-oh、r-c(＝o)-o-；其中r为取代或未取代的以下基团：c1-c8烷基、c3-c10环烷基、c6-c10芳基、5-7元杂芳基、ranh-或rao-；其中，各ra独立选自：c1-c8烷基、c3-c10环烷基、c6-c10芳基、5-7元杂芳基；r3和r4各自独立地为未取代或取代的c1-c6烷基；r5选自氢、羟基、羟甲基、甲酰基、其中，x为nh、o或s，rb为氢、未取代或取代的c1-c6烷基；r6、r7、r8和r9各自独立地为氢、羟基或c1-c6烷基；z为-(ch2)-n，n为1、2或3；表示单键或双键；各*独立地表示r构型、s构型或消旋；所述取代是指被基团上的氢被选自下组的一个或多个取代基取代：羟基、卤素、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、羧基(-cooh)、磺酸基(-so2oh)。在另一优选例中，r1为氢或羟基。在另一优选例中，r1为氢。在另一优选例中，r2为羟基、r-c(＝o)-o-；其中r为取代或未取代的以下基团：c1-c6烷基、c3-c8环烷基、c6-c10芳基、5-7元杂芳基、ranh-或rao-；其中，各ra独立为c1-c6烷基；所述取代是指被基团上的氢被选自下组的一个或多个取代基取代：卤素、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基。在另一优选例中，r2以α构型与环连接。在另一优选例中，r3和r4各自独立地为c1-c4烷基。在另一优选例中，r3和r4同时为甲基。在另一优选例中，r5选自羟甲基、甲酰基、其中，x为nh或o，rb为氢、未取代或取代的c1-c4烷基；所述取代是指被基团上的氢被选自下组的一个或多个取代基取代：c1-c4烷基、羧基(-cooh)、磺酸基(-so2oh)。在另一优选例中，r5为在另一优选例中，r6和r7各自独立地为氢、甲基或乙基；r8和r9各自独立地为氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基或异丁基。在另一优选例中，所述化合物为：本发明的第二方面，提供一种第一方面所述的化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，所述方法以为原料，通过在3位羟基引入酯基，再氢化脱去17位羧基上的苄基保护基，然后在羧基上引入氨基酸基团获得第一方面所述的化合物，各取代基的定义如第一方面所述。在一优选实施方式中，所述化合物或其药学上可接受的盐通过以下路线制备：式h1化合物与酰氯、酸酐、氯甲酸酯或异氰酸酯反应得到式h2化合物；式h2化合物脱去苄基保护基得到式h3化合物；式h3化合物与氨基酸或氯甲酸酯反应得到式h4化合物，其中r10为取代或未取代的以下基团：c1-c8烷基、c3-c10环烷基、c6-c10芳基、5-7元杂芳基、ranh-或rao-；其中，各ra独立选自：c1-c8烷基、c3-c10环烷基、c6-c10芳基、5-7元杂芳基；r11选自氢、未取代或取代的c1-c6烷基。取代的定义同前。本发明的第三方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物包含第一方面所述的化合物或其药学上可接受的盐；和药学上可接受的载体。本发明的第四方面，提供10、权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，或权利要求9所述的药物组合物的用途，其特征在于，(i)用于制备法尼酯衍生物x受体(fxr)拮抗剂；或(ii)用于制备治疗代谢性疾病的药物。在另一优选例中，所述代谢性疾病选自：高血脂、胆汁酸淤积、糖尿病、肥胖、非酒精性脂肪肝、胆汁性肝硬化。一种治疗高血脂的方法，其特征在于，所述方法包括向有需要的对象施用权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，或权利要求9所述的药物组合物本发明新型的五环三萜类化合物，能有效拮抗fxr受体，可在微摩尔浓度下拮抗fxr受体，且对tgr5受体无激动作用，与现有的一些天然来源的fxr拮抗剂相比，具有更丰富的天然来源和更简便的合成方法。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。限于篇幅，在此不再一一累述。具体实施方式本申请的发明人经过广泛而深入地研究，首次研发出一类五环三萜类化合物，其主要特点是3位羟基反转并通过在其17位羧基处引入甘氨酸或牛磺酸等基团，fxr拮抗活性明显增加。发明人首次研发这一结构对活性的影响规律，并得到一系列性能优异的化合物，与已有的一些天然来源的fxr拮抗剂相比，不仅来源更加丰富，而且合成简便，有望成为作用于该靶点的治疗代谢性疾病的新型药物。在此基础上，完成了本发明。术语在本文中，所述的烷基优选为脂肪族烷基，可以是直链烷基或支链烷基，非限制性地包括：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基等；形如“c1-c8”的表述意在包括具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个碳原子的相应基团，例如，“c1-c8烷基”指具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个碳原子的烷基，“c2-c10烯基”指具有2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个碳原子的烯基。在本文中，所述烯基优选为乙烯基、丙烯基、丁烯基、苯乙烯基、苯丙烯基，或类似基团。本文中，卤素优选是指氟、氯、溴或碘。本文中，烷氧基是指-o-(烷基)，其中烷基的定义如上所述。“c1-6烷氧基”指含1-6个碳的烷基氧基，非限制性实施例包含甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基等。在本文中，所述环烷基可以为饱和或者部分不饱和单环或多环环状烃取代基，其中包括3至20个碳原子，优选包括3至12个碳原子，更优选环烷基包含3至10个碳原子。单环环烷基非限制实施例包含环丙基、环丁基、环戊烯基、环己基、环辛基等；多环环烷基包括螺环、稠环和桥环的环烷基。本文中，环烷氧基是指-o-(环烷基)，其中环烷基的定义如上所述。所述芳基指6至10元全碳单环或稠合多环(也就是共享毗邻碳原子对的环)基团，且所述的基团具有共轭的π电子体系，例如苯基和萘基。所述芳基环可以与杂环基、杂芳基或环烷基环稠合，非限制性实施例含苯并咪唑、苯并噻唑、苯并恶唑、苯并异恶唑、苯并吡唑、喹啉、苯并吲哚、苯并二氢呋喃。所述杂芳基指包含1至4个杂原子，5至14个环原子的杂芳族体系，其中杂原子包括氧、硫和氮。杂芳基优选为是5元或6元，例如呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、n-烷基吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基、四唑基等。所述的杂芳基可以稠合于芳基、杂环基或者环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为杂芳基环。在本发明中除非另外指出，表示连接位点。除非特别说明，本发明所描述的结构式意在包括所有的互变异构、光学异构和立体异构形式(如对映异构体、非对映异构体，几何异构体或构象异构体)：例如含有不对称中心的r、s构型，双键的(z)、(e)异构体和(z)、(e)的构象异构体。因此本发明的化合物的单个立体化学异构体、互变异构体或其对映异构体、非对映异构体或几何异构体或构象异构体或互变异构体的混合物都属于本发明的范围。术语“互变异构体”表示具有不同能量的结构同分异构体可以超过低能垒，从而互相转化。比如，质子互变异构体(即质子移变)包括通过质子迁移进行互变，如1h-吲唑与2h-吲唑、1h-苯并[d]咪唑与3h-苯并[d]咪唑，化合价互变异构体包括通过一些成键电子重组而进行互变。在本文中，所述的药学上可接受的盐没有特别的限制，优选包括：无机酸盐、有机酸盐、烷基磺酸盐和芳基磺酸盐；所述无机酸盐包括盐酸盐、氢溴酸盐、硝酸盐、硫酸盐、磷酸盐等；所述有机酸盐包括甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、苯甲酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐等；所述烷基磺酸盐包括甲基磺酸盐、乙基磺酸盐等；所述芳基磺酸盐包括苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐等。制备方法本发明的五环三萜类化合物，能够采用以下路线进行制备。路线一：路线二：路线三：路线四：下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件(如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件)或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。下述制备实施例中，nmr用varian生产的mercury-vx300m仪器测定，nmr定标：δh7.26ppm(cdcl3)，2.50ppm(dmso-d6)；质谱用agilent1200quadrupolelc/ms液质联用仪或shimadzugcms-qp5050a测定；试剂主要由上海化学试剂公司提供；tlc薄层层析硅胶板由山东烟台会友硅胶开发有限公司生产，型号hsgf254；化合物纯化使用的正相柱层析硅胶为山东青岛海洋化工厂分厂生产，型号zcx-11，200-300目。本文缩写所对应的的中文如下：dmap:4-二甲氨基吡啶；dcm:二氯甲烷；dmf：n,n-二甲基甲酰胺；tfa：三氟乙酸。实施例1(1)室温下将原料白桦脂酸s1(1.2g,2.63mmol)溶于甲醇(50ml)中，换氮气后，迅速加入10％的pd/c，再换氮气后换氢气，室温下搅拌。24小时后tlc检测反应完全。换氮气后滤去pd/c，反应液旋干后用石油醚/乙酸乙酯为10:1的洗脱剂体系进行柱层析分离，得到化合物s21.04g(2.27mmol)，为白色固体，摩尔收率：86％。1hnmr(300mhz,cdcl3)δ3.13(t,1h,j＝9.0,6.9hz),2.28–2.16(m,2h),1.98–1.78(m,4h),1.64–0.96(m,其它脂肪环质子),0.96(s,3h),0.93(s,3h),0.92(s,3h),0.90(s,3h),0.89(s,3h),0.87(s,3h),0.78(s,3h).(2)室温下将上步产物s2(1.04g,2.27mmol)溶解在dmf(20ml)中，加入无水碳酸钾(0.626g,4.54mmol)，搅拌下慢慢滴加氯化苄(0.313ml,2.72mmol)。滴加完毕后将反应液移至50℃搅拌3h，tlc监测显示反应进行完全。将混合物冷却至室温，加入去离子水50ml稀释，用乙酸乙酯(2×50ml)萃取，将合并的有机层分别用去离子水和饱和食盐水洗涤，经硫酸钠干燥后并减压蒸馏得到所需白色固体化合物s31.21g(2.20mmol)，直接用于下一步反应，摩尔收率：97％。(3)冰水浴下将s3(1.21g，2.20mmol)溶于二氯甲烷(30ml)，分批加入dess-martin氧化剂(1.87g,4.40mmol)，慢慢升至室温并搅拌1小时。将反应混合物过滤后旋干，用石油醚/乙酸乙酯为10:1的洗脱剂体系进行柱层析分离，得到化合物s40.983g(1.80mmol)，为白色固体，摩尔收率：82％。1hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.38-7.30(m,5h),5.16-5.05(m,2h),2.55-2.34(m,2h),2.31–2.18(m,3h),1.95–1.12(m,其它脂肪环质子),1.06(s,3h),1.01(s,3h),0.93(s,3h),0.91(s,3h),0.86(d,3h,j＝6.9hz),0.79-0.73(m,6h).(4)上步产物s4(0.983g,1.80mmol)和s-(-)-2-甲基恶唑硼烷(100mg,0.36mmol)与100ml烘干的圆底烧瓶，加入新鲜钠丝处理过的thf(70ml)。室温下慢慢滴加10m的硼烷-四氢呋喃溶液(0.32ml)，控制滴加速度在十分钟内加完，室温下搅拌十分钟，tlc监测显示反应已经进行完。将反应瓶移至冰水浴，慢慢滴加甲醇淬灭反应，待不再有气泡生成后旋干溶剂，用石油醚/乙酸乙酯为10:1的洗脱剂体系进行柱层析分离，得到化合物s5827mg(1.51mmol)，为白色固体，摩尔收率：84％。1hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.37-7.30(m,5h),5.15-5.06(m,2h),3.38(t,1h,j＝3.0hz),2.55-2.34(m,2h),2.31–2.18(m,3h),1.95–1.12(m,其它脂肪环质子),0.94(s,3h),0.93(s,3h),0.91(s,3h),0.85-0.82(m,9h),0.75-0.73(m,6h).(5)化合物s5(110mg，0.20mmol)和催化量的dmap(2.4mg,0.02mmol)溶于二氯甲烷(5ml)中，加入三乙胺(83μl，0.60mmol)，冰水浴下滴入丁酸酐(98μl，0.60mmol)，室温反应12小时，tlc显示反应完成。浓缩除去溶剂后，加乙酸乙酯稀释，分别用水和饱和氯化钠水溶液洗涤有机相，无水硫酸钠干燥浓缩，用石油醚/乙酸乙酯为10:1的洗脱剂体系进行柱层析分离，得产物s9111mg(0.18mmol)，摩尔收率：90％。1hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.38-7.30(m,5h),5.15-5.06(m,2h),4.62(t,1h,j＝3.0hz),2.34-2.16(m,4h),1.93-1.04(m,其它脂肪环质子),0.97(t,6h,j＝7.2hz),0.87-0.86(m,3h),0.84-0.82(m,6h),0.76-0.73(m,6h).(6)将上步产物s9(111mg,0.18mmol)溶于甲醇(10ml)和少量乙酸乙酯中，换氮气后，迅速加入10％的pd/c，再换氮气后换氢气，室温下搅拌。1小时后tlc检测反应完全。换氮气后滤去pd/c，反应液旋干后用石油醚/乙酸乙酯为9:1的洗脱剂体系进行柱层析分离，得到化合物s1079mg(0.15mmol)，为白色固体，摩尔收率：83％。1hnmr(300mhz,cdcl3)δ4.61(s,1h),2.30(t,2h,j＝7.5hz),2.28-2.15(m,4h),1.98-1.15(m,其它脂肪环质子),0.94(s,3h),0.91(s,3h),0.90(t,3h,j＝6.0hz),0.85(s,3h),0.83(s,3h),0.82(s,3h),0.75(s,3h),0.73(s,3h).(7)将上步产物s10(79mg,0.15mmol)和催化量dmf(2μl,0.02mmol)溶于2ml干燥的二氯甲烷中，0℃下加入草酰氯(125μl,1.5mmol)，10分钟后回至室温搅拌3小时。直接旋出二氯甲烷并用油泵抽干后，用于下一步反应。将甘氨酸叔丁酯盐酸盐(51mg,0.30mmol)，催化量的dmap(3.7mg,0.03mmol)溶于1ml二氯甲烷中，0℃下滴加三乙胺(103μl,0.75mmol)，然后滴加现制酰氯的二氯甲烷溶液1ml，10分钟后回至室温，室温反应12小时，tlc显示反应完成。浓缩除去溶剂后，加乙酸乙酯稀释，分别用水和饱和氯化钠水溶液洗涤有机相，无水硫酸钠干燥浓缩，用石油醚/乙酸乙酯为8:1的洗脱剂体系进行柱层析分离，得产物83mg(0.13mmol)，摩尔收率：87％。1hnmr(300mhz,cdcl3)δ6.02(t,1h,j＝5.1hz),4.62(t,1h,j＝3.0hz),3.91-3.88(m,2h),2.48-2.38(m,1h),2.31(t,2h,j＝7.5hz),2.04-2.00(m,1h),1.91-1.04(m,其它脂肪环质子),1.47(s,9h),1.04-0.95(m,6h),0.92(s,3h),0.86-0.82(m,12h),0.74(d,3h,j＝6.6hz).(8)将上步产物83mg(0.13mmol)溶于3ml二氯甲烷中，加入0.2mltfa，室温下搅拌1小时，tlc显示反应完成。直接旋干溶剂，用二氯甲烷/甲醇为20:1的洗脱剂体系进行柱层析分离，得产物c4(59mg,0.10mmol)，摩尔收率：77％.1hnmr(300mhz,cdcl3)δ6.16(s,1h),4.63(t,1h,j＝2.7hz),4.07(s,2h),2.41-2.21(m,4h),2.05-1.04(m,其它脂肪环质子),1.00-0.95(m,6h),0.92(s,3h),0.87-0.83(m,12h),0.75(d,3h,j＝6.9hz).用实施例一中同样的方法不同的酸酐或酰氯合成以下化合物实施例2将化合物c4(42mg,0.07mmol)溶于甲醇和水(4:1)的混合溶剂中，0℃下加入氢氧化钠(28mg,0.7mmol)，10分钟后回至室温，搅拌12小时。tlc显示反应完成。旋出甲醇，加稀盐酸调节ph值至中性，加乙酸乙酯稀释，分别用水和饱和氯化钠水溶液洗涤有机相，无水硫酸钠干燥浓缩，用二氯甲烷/甲醇为10:1的洗脱剂体系进行柱层析分离，得产物c121mg(0.04mmol)，摩尔收率：57％.1hnmr(300mhz,cdcl3)δ6.13-6.10(m,1h),4.04(d,2h,j＝4.8hz),3.40(t,1h,j＝3.0hz),2.43-1.12(m,其它脂肪环质子),0.97(s,3h),0.93(s,3h),0.92(s,3h),0.87-0.82(m,9h),0.75(d,3h,j＝6.9hz).实施例3(1)化合物s3(148mg，0.27mmol)和催化量的dmap(3.7mg,0.03mmol)溶于二氯甲烷(5ml)中，加入三乙胺(112μl，0.81mmol)，冰水浴下滴入丁酸酐(132μl，0.81mmol)，室温反应12小时，tlc显示反应完成。浓缩除去溶剂后，加乙酸乙酯稀释，分别用水和饱和氯化钠水溶液洗涤有机相，无水硫酸钠干燥浓缩，用石油醚/乙酸乙酯为10:1的洗脱剂体系进行柱层析分离，得产物s6142mg(0.23mmol)，摩尔收率：85％。1hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.37-7.30(m,5h),5.15-5.05(m,2h),4.50-4.45(m,1h),2.34-2.14(m,4h),1.86-1.09(m,其它脂肪环质子),0.99-0.92(m,6h),0.85-0.79(m,9h),0.75-0.73(m,6h).(2)将上步产物s6(142mg,0.23mmol)溶于甲醇(15ml)和少量乙酸乙酯中，换氮气后，迅速加入10％的pd/c,再换氮气后换氢气，室温下搅拌。1小时后tlc检测反应完全。换氮气后滤去pd/c，反应液旋干后用石油醚/乙酸乙酯为8:1的洗脱剂体系进行柱层析分离，得到化合物s7101mg(0.19mmol)，为白色固体，摩尔收率：83％。1hnmr(300mhz,cdcl3)δ4.48(t,1h,j＝7.5hz),2.28(t,2h,j＝7.5hz),2.30-2.15(m,4h),1.90-1.07(m,otheraliphaticringprotons),0.94(s,3h),0.91(s,3h),0.90(t,3h,j＝6.0hz),0.85(s,3h),0.83(s,3h),0.82(s,3h),0.75(s,3h),0.73(s,3h).(3)将上步产物s7(101mg,0.19mmol)和催化量dmf(2μl,0.02mmol)溶于2ml干燥的二氯甲烷中，0℃下加入草酰氯(158μl,1.9mmol),10分钟后回至室温搅拌3小时。直接旋出二氯甲烷并用油泵抽干后，用于下一步反应。将甘氨酸叔丁酯盐酸盐(65mg,0.38mmol),催化量的dmap(3.7mg,0.03mmol)溶于1ml二氯甲烷中，0℃下滴加三乙胺(130μl,0.95mmol),然后滴加现制酰氯的二氯甲烷溶液1ml，10分钟后回至室温,室温反应12小时，tlc显示反应完成。浓缩除去溶剂后，加乙酸乙酯稀释，分别用水和饱和氯化钠水溶液洗涤有机相，无水硫酸钠干燥浓缩，用石油醚/乙酸乙酯为8:1的洗脱剂体系进行柱层析分离，得产物s8105mg(0.17mmol)，摩尔收率：89％.1hnmr(300mhz,cdcl3)δ6.01(t,1h,j＝5.1hz),4.51-4.45(m,1h),3.91-3.88(m,2h),2.48-2.38(m,1h),2.30-2.25(m,3h),2.03-2.00(m,1h),1.81-1.11(m,其它脂肪环质子),1.47(s,9h),0.97-0.91(m,9h),0.86-0.83(m,12h),0.74(d,3h,j＝6.6hz).(4)将上步产物s8105mg(0.17mmol)溶于5ml二氯甲烷中，加入0.2mltfa，室温下搅拌1小时，tlc显示反应完成。直接旋干溶剂，用二氯甲烷/甲醇为20:1的洗脱剂体系进行柱层析分离，得产物c12(82mg,0.14mmol)，摩尔收率：82％.1hnmr(300mhz,cdcl3)δ6.15-6.11(m,1h),4.51-4.45(m,1h),4.05(t,1h,j＝4.8hz),2.38-2.25(m,4h),2.02-1.12(m,其它脂肪环质子),0.97-0.90(m,9h),0.86-0.83(m,12h),0.75(d,3h,j＝6.6hz).实施例4(1)将上步产物s10(50mg,0.095mmol)和催化量dmf(1μl,0.01mmol)溶于1ml干燥的二氯甲烷中，0℃下加入草酰氯(125μl,0.95mmol),10分钟后回至室温搅拌3小时。直接旋出二氯甲烷并用油泵抽干后，用于下一步反应。将甘氨酸叔丁酯盐酸盐(36mg,0.19mmol),催化量的dmap(2.4mg,0.02mmol)溶于1ml二氯甲烷中，0℃下滴加三乙胺(67μl,0.48mmol),然后滴加现制酰氯的二氯甲烷溶液1ml，10分钟后回至室温,室温反应12小时，tlc显示反应完成。浓缩除去溶剂后，加乙酸乙酯稀释，分别用水和饱和氯化钠水溶液洗涤有机相，无水硫酸钠干燥浓缩，用石油醚/乙酸乙酯为15:1的洗脱剂体系进行柱层析分离，得产物47mg(0.072mmol)，摩尔收率：76％.1hnmr(300mhz,cdcl3)δ6.18(d,1h,j＝7.2hz),4.62(t,1h,j＝3.0hz),4.48-4.38(m,1h),2.44-2.27(m,4h),2.01-1.03(m,其它脂肪环质子),0.99-0.92(m,9h),0.86-0.82(m,12h),0.74(d,3h,j＝6.6hz).(2)将上步产物47mg(0.072mmol)溶于2ml二氯甲烷中，加入0.2mltfa，室温下搅拌1小时，tlc显示反应完成。直接旋干溶剂，用二氯甲烷/甲醇为20:1的洗脱剂体系进行柱层析分离，得产物c18(36mg,0.060mmol)，摩尔收率：83％.1hnmr(300mhz,cdcl3)δ6.06(d,1h,j＝6.6hz),4.63(s,1h),4.59-4.49(m,1h),2.41-2.28(m,4h),2.00-1.08(m,其它脂肪环质子),1.00-0.93(m,9h),0.88-0.83(m,12h),0.75(d,3h,j＝6.6hz).用实施例4中同样的方法采用d-丙氨酸盐酸盐合成化合物c19。1hnmr(300mhz,cdcl3)δ6.06(d,1h,j＝6.3hz),4.63(t,1h,j＝3.0hz),4.55-4.46(m,1h),2.43-2.24(m,4h),2.03-1.05(m,其它脂肪环质子),1.00-0.92(m,9h),0.87-0.83(m,12h),0.75(d,3h,j＝6.6hz).实施例5将化合物s10(50mg,0.095mmol)和催化量dmf(1μl,0.01mmol)溶于2ml干燥的二氯甲烷中，0℃下加入草酰氯(80μl,0.95mmol),10分钟后回至室温搅拌3小时。直接旋出二氯甲烷并用油泵抽干后，用于下一步反应。将现制酰氯和三乙胺(263μl,1.9mmol)溶于二氧六环(3ml)，然后在0℃下滴加牛磺酸(36mg,0.285mmol)和三乙胺(263μl,1.9mmol)水溶液1ml,10分钟后回至室温,室温反应3小时，tlc显示反应完成。加稀盐酸调节ph值至酸性，加乙酸乙酯稀释，分别用水和饱和氯化钠水溶液洗涤有机相，无水硫酸钠干燥浓缩，用二氯甲烷/甲醇为10:1的洗脱剂体系进行柱层析分离，得产物c2016mg(0.025mmol)，摩尔收率：27％.1hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.09(brs,1h),4.61(s,1h),3.20-3.03(m,4h),2.33-2.28(m,2h),1.72-1.60(m,4h),1.44-1.07(m,其它脂肪环质子),0.99-0.89(m,9h),0.87-0.81(m,12h),0.73-0.72(m,3h).实施例6(1)将化合物s10(100mg,0.189mmol)溶于超干dmf(3ml)，加入无水碳酸钾(65.3mg,0.473mmol)，搅拌下慢慢滴加溴乙酸苄酯(0.148ml,0.945mmol)，滴加完毕后室温搅拌3h，tlc监测显示反应进行完全。加入去离子水30ml稀释，用乙酸乙酯(2×30ml)萃取，将合并的有机层分别用去离子水和饱和食盐水洗涤，经硫酸钠干燥浓缩，用石油醚/乙酸乙酯为30:1的洗脱剂体系进行柱层析分离，得产物s13124mg(0.183mmol)，摩尔收率：97％。1hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.38-7.34(m,5h),5.24-5.13(m,2h),4.63-4.62(m,3h),2.32(t,2h,j＝7.5hz),2.28-2.20(m,2h),1.96-1.77(m,3h),1.71-1.64(m,2h),1.61-1.04(m,其它脂肪环质子),1.00-0.92(m,9h),0.87-0.83(m,9h),0.75(d,3h,j＝6.9hz).(2)将上步产物s13(124mg,0.183mmol)溶于甲醇(15ml)和少量乙酸乙酯中，换氮气后，迅速加入10％的pd/c,再换氮气后换氢气，室温下搅拌。1小时后tlc检测反应完全。换氮气后滤去pd/c，反应液旋干后用二氯甲烷/甲醇为20:1的洗脱剂体系进行柱层析分离，得到化合物c2180mg(0.137mmol)，为白色固体，摩尔收率：75％。1hnmr(300mhz,cdcl3)δ4.66-4.58(m,3h),2.32(t,2h,j＝7.5hz),2.24-2.17(m,3h),1.94-1.77(m,4h),1.71-1.64(m,2h),1.61-1.04(m,其它脂肪环质子),1.00-0.92(m,9h),0.87-0.82(m,9h),0.75(d,3h,j＝6.6hz).实施例7(1)将化合物s5(100mg,0.182mmol),异氰酸乙酯(150μl,1.82mmol),三乙胺(505μl,3.64mmol)以及dmap(1.22mg,0.01mmol)溶于3ml甲苯中，120℃封管反应两天，tlc监测显示反应进行完全。加入去离子水30ml稀释，用乙酸乙酯(2×30ml)萃取，将合并的有机层分别用去离子水和饱和食盐水洗涤，经硫酸钠干燥浓缩，用石油醚/乙酸乙酯为15:1的洗脱剂体系进行柱层析分离，得产物s1485mg(0.137mmol)，摩尔收率：75％。1hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.37-7.26(m,5h),5.15-5.06(m,2h),4.64(brs,1h),4.49(s,1h),3.24-3.20(m,2h),2.31-2.15(m,4h),1.85-1.77(m,4h),1.68-1.01(m,其它脂肪环质子),0.96(s,3h),0.86-0.82(m,12h),0.75-0.73(m,6h).(2)将上步产物s14(85mg,0.137mmol)溶于甲醇(15ml)和少量乙酸乙酯中，换氮气后，迅速加入10％的pd(oh)2/c,再换氮气后换氢气，室温下搅拌。1小时后tlc检测反应完全。换氮气后滤去pd(oh)2/c，反应液旋干后用石油醚/乙酸乙酯为8:1的洗脱剂体系进行柱层析分离，得到化合物s1561mg(0.115mmol)，为白色固体，摩尔收率：84％。1hnmr(300mhz,cdcl3)δ4.67(brs,1h),4.50(s,1h),3.27-3.17(m,2h),2.29-2.16(m,4h),1.91-1.78(m,4h),1.68-1.06(m,其它脂肪环质子),0.99(s,3h),0.93(s,3h),0.86-0.85(m,12h),0.75(d,3h,j＝6.9hz).(3)将上步产物s15(61mg,0.115mmol)和催化量dmf(1μl,0.01mmol)溶于2ml干燥的二氯甲烷中，0℃下加入草酰氯(96μl,1.15mmol),10分钟后回至室温搅拌3小时。直接旋出二氯甲烷并用油泵抽干后，用于下一步反应。将甘氨酸叔苄酯盐酸盐(47mg,0.23mmol),催化量的dmap(2.4mg,0.02mmol)溶于1ml二氯甲烷中，0℃下滴加三乙胺(80μl,0.58mmol),然后滴加现制酰氯的二氯甲烷溶液1ml，10分钟后回至室温,室温反应12小时，tlc显示反应完成。浓缩除去溶剂后，加乙酸乙酯稀释，分别用水和饱和氯化钠水溶液洗涤有机相，无水硫酸钠干燥浓缩，用石油醚/乙酸乙酯为8:1的洗脱剂体系进行柱层析分离，得产物s1652mg(0.077mmol)，摩尔收率：67％.1hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.37-7.34(m,5h),6.07(t,1h,j＝5.4hz),5.22-5.13(m,2h),4.65(brs,1h),4.49(s,1h),4.08-3.97(m,2h),3.26-3.17(m,2h),2.46-2.23(m,3h),2.03-1.04(m,其它脂肪环质子),0.97(s,3h),0.90(s,1h),0.85-0.83(m,9h),0.74(d,3h,j＝6.9hz)(4)将上步产物s1652mg(0.077mmol)溶于甲醇(10ml)和少量乙酸乙酯中，换氮气后，迅速加入10％的pd/c,再换氮气后换氢气，室温下搅拌。1小时后tlc检测反应完全。换氮气后滤去pd/c，反应液旋干后用二氯甲烷/甲醇为20:1的洗脱剂体系进行柱层析分离，得到化合物c22(38mg,0.065mmol)，摩尔收率：84％.1hnmr(300mhz,cdcl3)δ6.17(s,1h),4.66(brs,1h),4.50(s,1h),4.04-3.97(m,2h),3.28-3.20(m,2h),2.44-2.27(m,3h),2.04-1.05(m,其它脂肪环质子),0.98(s,3h),0.92(s,3h),0.86-0.84(m,9h),0.74(d,3h,j＝6.6hz)实施例8(1)将化合物s5(130mg,0.237mmol)溶于3ml吡啶中，-20℃下加入氯甲酸乙酯(113μl,1.19mmol)，10分钟后回至室温搅拌，2小时后tlc检测反应完全。加入去离子水30ml稀释，用乙酸乙酯(2×30ml)萃取，将合并的有机层分别用稀盐酸，去离子水和饱和食盐水洗涤，经硫酸钠干燥浓缩，用石油醚/乙酸乙酯为10:1的洗脱剂体系进行柱层析分离，得产物s1797mg(0.156mmol)，摩尔收率：66％。1hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.38-7.30(m,5h),5.15-5.06(m,2h),4.46(t,1h,j＝2.7hz),4.19(q,2h,j＝7.2hz),2.30-2.14(m,4h),1.96-1.02(m,其它脂肪环质子),0.95(s,3h),0.90-0.83(m,15h),0.75-0.73(m,6h).(2)将化合物s17(97mg,0.156mmol)溶于甲醇(20ml)和少量乙酸乙酯中，换氮气后，迅速加入10％的pd(oh)2/c,再换氮气后换氢气，室温下搅拌。1小时后tlc检测反应完全。换氮气后滤去pd(oh)2/c，反应液旋干后用石油醚/乙酸乙酯为8:1的洗脱剂体系进行柱层析分离，得到化合物s1848mg(0.091mmol)，为白色固体，摩尔收率：58％。1hnmr(300mhz,cdcl3)δ4.47(t,1h,j＝2.7hz),4.20(q,2h,j＝7.2hz),2.28-2.14(m,4h),1.91-1.14(m,其它脂肪环质子),0.98(s,3h),0.93(s,3h),0.90(s,3h),0.88-0.84(m,9h),0.75(d,3h,j＝6.9hz).(3)将上步产物s18(48mg,0.091mmol)和催化量dmf(1μl,0.01mmol)溶于2ml干燥的二氯甲烷中，0℃下加入草酰氯(76μl,0.91mmol),10分钟后回至室温搅拌3小时。直接旋出二氯甲烷并用油泵抽干后，用于下一步反应。将甘氨酸叔苄酯盐酸盐(37mg,0.18mmol),催化量的dmap(2.4mg,0.02mmol)溶于1ml二氯甲烷中，0℃下滴加三乙胺(64μl,0.46mmol),然后滴加现制酰氯的二氯甲烷溶液1ml，10分钟后回至室温,室温反应12小时，tlc显示反应完成。浓缩除去溶剂后，加乙酸乙酯稀释，分别用水和饱和氯化钠水溶液洗涤有机相，无水硫酸钠干燥浓缩，用石油醚/乙酸乙酯为8:1的洗脱剂体系进行柱层析分离，得产物s1949mg(0.072mmol)，摩尔收率：79％.1hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.37-7.35(m,5h),6.04(t,1h,j＝5.4hz),5.22-5.14(m,2h),4.47(t,1h,j＝2.7hz),4.19(q,2h,j＝7.2hz),4.05(d,2h,j＝5.4hz),2.46-2.37(m,1h),2.31-2.23(m,1h),2.02-1.10(m,其它脂肪环质子),0.97(s,3h),0.90-0.83(m,15h),0.74(d,3h,j＝6.9hz).(4)将上步产物s1949mg(0.072mmol)溶于甲醇(10ml)和少量乙酸乙酯中，换氮气后，迅速加入10％的pd/c,再换氮气后换氢气，室温下搅拌。1小时后tlc检测反应完全。换氮气后滤去pd/c，反应液旋干后用二氯甲烷/甲醇为20:1的洗脱剂体系进行柱层析分离，得到化合物c23(35mg,0.060mmol)，摩尔收率：83％.1hnmr(300mhz,cdcl3)δ6.15(t,1h,j＝5.4hz),4.46(t,1h,j＝2.7hz),4.19(q,2h,j＝7.2hz),4.05-4.03(m,2h),2.42-2.32(m,1h),2.29-2.21(m,1h),2.02-1.12(m,其它脂肪环质子),0.97(s,3h),0.91-0.84(m,12h),0.74(d,3h,j＝6.9hz).实施例9fxr拮抗剂试验1.实验目的用报告基因实验检测化合物对fxr的拮抗活性。2.实验原理fxr是一种由胆汁酸激活的核受体，对体内糖代谢和脂代谢等有调控作用。fxr激活后，可以启动一系列基因的表达，对外界刺激产生应答。luciferase报告基因系统是检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告体系。荧光素酶可以催化荧光底物luciferin氧化，同时发出生物荧光，通过检测荧光强度推断荧光素酶表达量。本实验中，待测化合物可能以fxr为靶点，而gw4064则是已知的fxr激动剂，与fxr配体结合域结合后启动一系列基因的表达。因此，运用报告基因实验，在hek293细胞中共转lbd(hfxr)-pbind及pgl4.31-luc两种质粒，使细胞表达fxr配体结合域。分别给予两种待测化合物并设置空白对照组，再加入激动剂，若化合物对fxr有亲和力，则会与激动剂竞争结合fxr配体结合域，影响pgl4.31-luc中荧光素酶的表达。利用envision2101多功能微孔板酶标仪检测化学发光计数值，根据荧光强度判断待测化合物对fxr活性的影响。3.实验样品试验前将化合物溶于dmso，配制母液，使用时用培养液稀释至所需浓度。4.实验方法将2μg嵌合质粒lbd(hfxr)-pbind与2μgluciferase报告质粒共同转染2×106hek293细胞，种入白色不透明96孔板中；24h后弃掉培养液，加待测化合物(用无血清培液稀释，含1％dmso)孵育1h，然后加入fxr激动剂gw4064(300nm)刺激6h，最后加荧光素酶底物振荡裂解，并且在envision2104多功能微孔板酶标仪检测发光数值。5.实验结果：(以c1等六个化合物为例，但不局限于这些化合物)表1化合物fxr拮抗活性测试结果化合物编号fxr(ic50/μm)c113.95c26.31c33.89c42.05c128.27c165.67注：ic50为样品药物对fxr拮抗活性的评价，半数50％有效浓度。6、结果与讨论：这些化合物在表达fxr配体结合域的hek293细胞中能够与fxr激动剂gw4064进行竞争，并拮抗gw4064对fxr的激活作用，其活性呈剂量依赖关系，ic50值见表1。结果说明这些化合物是fxr受体的拮抗剂。实施例10tgr5激动试验实施例1.实验目的利用瞬转tgr5的hek293细胞用化合物进行刺激，然后用均相时间分辨荧光(homogeneoustime-resolvedfluorescence,htrf)检测这些化合物是否可以激动tgr5。2.实验原理tgr5是胆汁酸膜受体，也是gpcr家族的一员，对胆汁酸、脂类及糖类的代谢具有调控作用。tgr5与gs蛋白偶联，活化后进一步激活腺苷酸环化酶，产生第二信使camp。htrf是一种检测camp含量的方法，它结合了荧光共振能量转移(fret,fluorescenceresonanceenergytransfer)和时间分辨荧光(trf,timeresolvedfluorescence)两种技术。含eu的穴状化合物作为荧光供体，其发射光谱与荧光受体激发光谱有一定重叠，通过fret诱导受体产生荧光，而eu的荧光寿命长，通过trf可以从荧光背景中区分受体发出的荧光信号。将荧光供体与camp特异性抗体结合，同时以荧光受体标记camp，二者通过抗原抗体特异性识别反应相互靠近，产生fret，而细胞产生的camp与标记的camp竞争抗体结合位点，导致荧光强度降低。本实验以tgr5激动剂int777为阳性对照，探究化合物对tgr5的作用。3.实验样品试验前将化合物溶于dmso，配制母液，使用时用培养液稀释至所需浓度。4.实验方法4.1、将待测化合物用1xpbs配成终浓度的2倍.其中终浓度为100μm、10μm、1μm、100nm、10nm、1nm、0.1nm、dmso(每个孔都含有1％的dmso)。4.2、细胞处理:4.2.1、用胰酶消化细胞，然后用无血清培液悬浮。4.2.2、定细胞密度.并同时在无血清培液中加ibmx(终浓度为500μm)，细胞数为2000/5μl/孔。4.2.3、加入5μl待测化合物&5μl含ibmx的细胞悬液混合，锡箔纸将384孔板封闭好，室温避光反应不超过30分钟。4.3.检测底物配置4.3.1、1μlcamp-d2用camp&cgmpconjugates&lysisbuffer稀释到20μl4.3.2、1μlanti-camp-cryptate用camp&cgmpconjugates&lysisbuffer稀释至20μl4.3.3、30分钟后，加入5μl(1.3.1)+5μl(1.3.2)，锡箔纸将384孔板封闭好，室温避光反应分钟。4.4、60分钟后，envision2101多功能微孔板酶标仪(perkinelmer)读数。5.实验结果(以c1等六个化合物为例，但不局限于这些化合物)表2化合物tgr5激动活性测试结果注：ic50为样品药物对fxr拮抗活性的评价，半数50％有效浓度。nr表示在100μm的浓度下没有活性。6、结果与讨论：这些化合物在表达tgr5的hek293细胞中不能够提高细胞内的camp累积，见表2，说明化合物对fxr的拮抗作用具有选择性。实施例11cck-8试验实施例1.实验目的用cck-8实验评判化合物的细胞毒性。2.实验原理cck-8是一种氧化还原反应的指示剂，在电子载体1-methoxypms存在的条件下，利用活细胞中的脱氢酶催化四唑盐wst-8生成甲臜染料，而且甲臜染料的生成量与活细胞的数量成线性关系，用酶标仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。因此这种方法用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。本次实验用来评判化合物的细胞毒性。3.实验样品试验前将化合物溶于dmso，配制母液，使用时用培养液稀释至所需浓度。4.实验方法首先将2μg嵌合质粒lbd(hfxr)-pbind与2μgluciferase报告质粒共同转染2×106hek293细胞，种入透明96孔板中；24h后弃掉培养液，加待测化合物(用无血清培液稀释，含1％dmso)孵育1h，然后加入fxr激动剂gw4064(300nm)刺激4h；每孔中加入检测10μlcck-8检测试剂；2h后用flextation仪器检测450nm及650nm(作为参比波长)吸光度。5.实验结果：(以c1等六个化合物为例，但不局限于这些化合物)表3化合物cck-8测试结果6、结果与讨论表3实验结果表明，这些化合物在30μm和100μm浓度下对hek293细胞均无明显的毒性。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。当前第1页12