PU.1抑制剂及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，尤其是tim3、pu.1等基因或其编码的蛋白在t-all(t细胞急性淋巴性白血病)的分子分型、细胞筛分、预后判断等方面的应用，以及tim3抑制剂、pu.1抑制剂在制备治疗t-all等疾病的药物中的用途，及其在治疗时和其他药物的联用。

背景技术：

肿瘤是一个异质性的组织，基础医学研究认为肿瘤的生长是肿瘤组织中一小部分具有干细胞性质的肿瘤细胞增殖分化的结果，由此提出了“肿瘤干细胞假说”：肿瘤干细胞(cancerstemcell，csc)增殖过程中发生不均一分裂，一个csc分裂形成一个新的csc和另一个可最终分化成包括肿瘤细胞在内的各种细胞的子细胞，其结果是维持csc数目稳定并最终分化为肿瘤细胞。csc数目极其稀少，其成瘤能力较普通肿瘤细胞高数百倍，是肿瘤发生、发展与维持的基础。

目前研究认为csc与成体干细胞相似，两者都具有分化和自我复制能力。但与成体干细胞不同的是，csc的自我复制能力是一种不受限的自我生长。肿瘤抑制因子pten失活以及下游调控的pi3k/akt信号通路的异常在许多类型的肿瘤中均有发现，比如t-all。

传统的化疗药物的开发主要是依赖于肿瘤细胞处于无限增殖状态。肿瘤干细胞理论认为，虽然根除非肿瘤干细胞可达到暂时治疗肿瘤的目的，但只要存在csc，肿瘤就仍可复发，最终导致病人的死亡，所以肿瘤治疗的焦点是杀伤csc。但是csc通常处于静止状态，只是在增殖时才开始快速分裂产生子细胞。所以按照传统方法筛选出来的肿瘤治疗药物与杀灭csc的要求差异巨大。

通过分析csc与相应正常干细胞基因表达特征的不同，利用这种差异，可能会出现既直接针对csc，又能不影响正常干细胞的治疗手段。

急性淋巴细胞白血病(all)是儿童常见的恶性肿瘤，是一种起源于淋巴细胞的b系或t系细胞的恶性肿瘤性疾病。根据all的免疫表型分为b细胞型、t细胞型及t/b混合型，其中t细胞型(t-all)占all的15-25％。随着白血病发病机制、化疗方案、特异靶向治疗和造血干细胞移植等研究的不断深入，all的治愈率显著提高，长期无病存活率已达70-80％，但仍有20-30％的患儿由于复发导致治疗失败。其中，t-all发病时年龄偏大，初诊白细胞数常大于50×10⁹/l，肿瘤负荷较高，病情进展迅速，且易发生纵膈及中枢神经系统浸润，具有不同于b-all的独特的临床、免疫学、细胞遗传学和分子生物学特点：细胞突变快，细胞凋亡率低，残留白血病克隆多，决定了它易复发(高达30％以上)且复发早，预后不良，与b-all相比总体预后较差。

虽然现今绝大多数all患者可检出染色体或基因水平的异常，部分遗传学改变已成为t-all诊断和预后判断的重要依据，但迄今为止，不像b-all已经发现许多基因标记，目前发现的t-all中异常染色体改变与现代治疗方案疗效之间尚无相关性，t-all中所发现的大多数遗传学异常的临床意义尚不明确。对t-all细胞的分子分型做进一步研究和完善，对t-all患者的靶向治疗有重要意义(儿童t系急性淋巴细胞白血病的临床特点及预后分析，张艳兰等，中国实验血液学杂志，2011，19(6):1496-1500)。

在本申请的发明人前期研究中，通过在胎肝水平特异性地在小鼠造血干细胞中敲除pten建立了t-all小鼠模型，进一步结合cd3和c-kit等表面分子标志在ptennull的t-all小鼠模型中确定出一群具有自我更新和耐药的细胞群体，将其定义为t-all白血病起始细胞(lics)，但是在主要分子事件上白血病起始细胞和白血病细胞具有相同的特点，即都有pten的缺失，信号通路β-catenin的激活，c-myc与tcr之间发生的重排导致c-myc的异常高表达(guow,laskyjl,changcj,etal.multi-geneticeventscollaborativelycontributetopten-nullleukaemiastem-cellformation[j].nature,2008,453(7194):529-533)。

技术实现要素：

本申请通过进一步研究前期获得的白血病起始细胞(lscs)和白血病细胞(blast细胞)(guow,laskyjl,changcj,etal.multi-geneticeventscollaborativelycontributetopten-nullleukaemiastem-cellformation[j].nature,2008,453(7194):529-533)之间的区别，发现在t-all小鼠模型中，lics特异表达的基因大部分都是膜蛋白，例如tim-3和cd11c，并且tim-3和cd11c在细胞表达量上有很高的相关性，依据tim-3表达量的高低将lics群体进一步细分为三个亚群：tim-3high，tim-3middle，tim-3low。在不同的小鼠中，tim-3high细胞亚群均与其他细胞亚群区分明显。依赖于单细胞转录组学测序数据的谱系追踪分析发现，t-all的肿瘤细胞发育路径是由tim-3high开始，经过tim-3middle，tim-3low最终成为末端分化的blast细胞。

对tim-3high细胞亚群进行进一步分析发现，其干细胞相关信号通路nf-κb，erk1/2和β-canteninc等均处于激活状态，而分化增值相关基因c-myc在基因和蛋白水平均低于blast细胞，且在t-all的诞生器官—胸腺—有较高的比例，处于g0/1期的细胞比例也远远高于blast细胞。

利用经典的细胞稀释移植方法鉴定表明，tim-3high细胞亚群具有较强的成瘤性和小鼠死亡时间上显著性的提前，施用tim3抗体后，小鼠t-all被极大延缓。由此证明，lics中tim-3high细胞亚群更具有肿瘤干细胞的特质。

对人类t-all细胞进行研究，获得了与小鼠类似的结果(图25)。

在此基础上，tim-3可以作为t-all和t/b混合型all诊断和治疗的生物学靶标。由于遗传背景的差异，对不同物种而言，表达了tim-3的t-all或t/b混合型all的细胞或者高表达tim-3的t-all或t/b混合型all的细胞，更具有肿瘤干细胞的特质，即，处于静息状态，具有异质性分裂能力，对作用于分裂和增殖状态的肿瘤细胞的抗肿瘤药物耐药等。通过检测t-all或t/b混合型all的组织或细胞中tim-3表达水平，可以用来进行t-all或t/b混合型all的分子分型、预后判断、耐药性判断、治疗效果检测、用药方案规划等。而通过给予tim3抑制，可以治疗t-all或t/b混合型all，尤其是耐药性t-all或t/b混合型all。

进一步，本申请的发明人研究发现ptennullt-all的lics主要定位于t细胞发育的早期。通过寻找lics的核心转录因子发现，pu.1调控了lics中tim-3high细胞亚群特异表达的基因中的约50％左右的基因的表达情况，并且pu.1特异性地在lics的tim3high细胞亚群中表达，表达上与tim-3和cd11c具有很强的正相关性，和c-myc具有负相关。

利用过表达pu.1的blast细胞进行研究发现，过表达pu.1能导致tim-3，cd11c和lmo2表达升高，c-myc表达下降。利用sirna敲低pu.1的表达可以得到相反的结果。该现象在人类样本的测序结果中得到验证，即，t-all病人中pu.1与tim-3，cd11c和lmo2具有很强的正相关，与c-myc负相关。

本申请的发明人采用遗传学方法进一步研究和验证了pu.1在功能上对于t-all的影响。将pu.1条件性敲除小鼠和ptennullt-all小鼠进行交配，在t-all小鼠模型中敲除pu.1发现：敲除一半pu.1的染色体就能很好的延长小鼠寿命和减轻小鼠白血病的负荷。完全敲除pu.1则能在三个月内完全阻止白血病的发生。并且利用流式细胞分析发现3个月内几乎检测不到tim-3high细胞亚群体和blast细胞群体。同时相对白血病小鼠各个器官肿瘤的浸润，pu.1敲除小鼠具有很好的器官形态。

本申请的发明人进一步以lics中的tim-3high细胞亚群为靶向细胞，研究了靶向tim-3high细胞亚群特异表达的pu.1，对t-all的作用。利用pu.1的小分子抑制剂db1976在细胞水平进行检测，发现db1976可以很好的抑制tim-3high细胞亚群的tim-3，cd11c和lmo2等基因的表达，同时上调c-myc基因的表达。

基于上述结果，将db1976用于t-all小鼠tim-3high细胞亚群的靶向治疗。将db1976和blast细胞敏感的抑制剂雷帕霉素(rapamycin)进行单独和联合使用发现，单独使用任何一个抑制剂都会导致小鼠的死亡，单用rapamycin组的死亡是由于rapamycin只能杀死blast细胞，对lics的tim-3high细胞亚群不具杀伤性，最后由于肿瘤耐药导致小鼠死亡；而db1976靶向lics的tim-3high细胞亚群，但对blast细胞不具杀伤性，最终小鼠由于blast细胞大量扩增而死亡。只有靶向blast细胞和lics的tim-3high细胞亚群，才能有效延长小鼠的生存期。各组织器官中细胞的绝对计数结果也证明了上述现象及其原因。依赖于肿瘤细胞中laz的成像实验也表明白血病细胞在联合给药后明显地减轻。小鼠各器官在联合给药后也能恢复到良好的器官形态且小鼠体重在给药前后没有显著的改变。

dna的甲基化对基因的表达调控起非常重要的作用。本申请的发明人对blast细胞和lics进行过硫酸铵盐处理后的甲基化高通量测序研究发现，blast细胞和lics的特异性基因的甲基化整体水平没有显著性差异，但pu.1的promoter区的甲基化水平在lics和blast细胞之间存在显著性差异，即，lics的pu.1的promoter区处于低甲基化状态，而blast细胞的处于高甲基化状态。

利用甲基化抑制剂5-氮-2-脱氧胞苷(5-az)可以在体外和体内blast细胞中恢复pu.1，tim-3，cd11c等基因的表达。另外，分别用5-az处理人t-all细胞系ke-37(表达pu.1和tim-3)和cem(不表达pu.1和tim-3)后，ke-37细胞中pu.1和tim-3的表达几乎不受影响，而cem细胞中则出现pu.1和tim-3等基因的表达上调，c-myc基因的表达下调，证明在人的t-all中，pu.1同样受甲基化的调控。另外，在体外用5-az处理cem细胞后，将不同浓度的处理后细胞进行移植，结果发现5-az处理后可以使cem细胞向肿瘤干细胞方向转变，该现象解释了采用5-az等dna甲基化抑制剂治疗t-all等肿瘤后，肿瘤出现耐药的原因。

本申请的发明人采用5-az和pu.1抑制剂db1976联合用药，处理人cem，molt-4，loucy和molt-3等细胞后，能显著性杀伤这些人t-all细胞系。不受特殊理论的限制，发明人推测，5-az和db1976联合用药时，5-az将cem，molt-4，loucy和molt-3等细胞向肿瘤干细胞方向转化，db1976杀伤转化后的细胞，从而达到杀伤cem，molt-4，loucy和molt-3等细胞的效果。

在此基础上，pu.1可以作为表达pu.1细胞或pu.1表达所致疾病的诊断和治疗的生物学靶标，尤其是可以作为t-all或t/b混合型all的诊断和治疗的生物学靶标。细胞表达pu.1，就会启动pu.1调控的相关基因的表达，例如tim-3、cd11c等的表达，从而改变细胞的生物学功能，例如使细胞幼稚化；使肿瘤细胞向肿瘤干细胞方向转化，即，处于静息状态，具有异质性分裂能力，对作用于分裂和增殖状态的肿瘤细胞的抗肿瘤药物耐药等。通过检测细胞或组织中，例如t-all或t/b混合型all的组织或细胞中pu.1的表达水平，可以用来进行疾病的分子分型、预后判断、耐药性判断、治疗效果检测、用药方案规划等。而通过给予pu.1抑制，可以抑制表达pu.1的细胞，治疗pu.1表达所致疾病，例如，自身免疫性疾病，增殖性疾病(例如：t-all或t/b混合型all，尤其是耐药的t-all或t/b混合型all)。

本发明的第一方面提供：

一种用于识别、诊断或监测细胞或组织表达pu.1的生物标志物组，其包含基因pu.1或者其所编码的蛋白或蛋白片段。

优选，所述生物标志物组进一步包含基因tim-3或者其所编码的蛋白或蛋白片段、基因cd11c或者其所编码的蛋白或蛋白片段、基因lmo2或者其所编码的蛋白或蛋白片段和基因myc或者其所编码的蛋白或蛋白片段中的至少一种。

优选，所述生物标志物组用于识别、诊断或监测t-all或t/b混合型all。

例如，所述生物标志物组包含基因pu.1，或者pu.1基因所编码的蛋白或蛋白片段；或者，所述生物标志物组包含基因tim-3和pu.1，或者所述基因所编码的蛋白或蛋白片段；或者，所述生物标志物组包含基因pu.1和cd11c，或者所述基因所编码的蛋白或蛋白片段；或者，所述生物标志物组包含基因pu.1和lom2，或者所述基因所编码的蛋白或蛋白片段；或者，所述生物标志物组包含基因pu.1和myc，或者所述基因所编码的蛋白或蛋白片段；或者，所述生物标志物组包含基因pu.1、tim-3和cd11c，或者所述基因所编码的蛋白或蛋白片段；或者，所述生物标志物组包含基因pu.1、tim-3和lom2，或者所述基因所编码的蛋白或蛋白片段；或者，所述生物标志物组包含基因pu.1、tim-3和myc，或者所述基因所编码的蛋白或蛋白片段；或者，所述生物标志物组包含基因pu.1、tim-3、cd11c和myc，或者所述基因所编码的蛋白或蛋白片段等。

所述识别、诊断或监测t-all或t/b混合型all可以是识别、诊断或监测t-all或t/b混合型all组织或细胞是否表达pu.1，以及pu.1表达量的变化，例如增高或者降低。所述识别、诊断或监测可以用于t-all或t/b混合型all的诊断、分子分型、预后判断、复发监测、用药效果评估、用药方案规划等。

根据本发明的研究，如果t-all或t/b混合型all的细胞表达了pu.1，则预示着所述细胞的异质性分裂和体内成瘤性增强，更具有肿瘤干细胞的特质或向肿瘤干细胞转化。依据肿瘤干细胞理论，肿瘤干细胞是肿瘤复发、转移和耐药的关键原因，如果t-all或t/b混合型all的组织或细胞中表达pu.1的细胞出现或增多，则预示着所述患者的预后较差，或者对作用于分裂和增殖状态的肿瘤细胞的抗肿瘤药物的响应会较差或存在耐药性。如果患者在抗肿瘤治疗之后，t-all或t/b混合型all的组织或细胞中出现表达pu.1的细胞或表达pu.1的细胞增多，或者细胞表达pu.1的水平增加，则预示着所述治疗效果较差，或存在肿瘤复发的趋势。

由于pu.1的表达与tim3、cd11c、lmo2的表达正相关，与myc的表达负相关，进一步包括tim3、cd11c、lmo2和/或myc的生物标志物，可以提高识别、诊断或监测的准确性。

本发明的第二个方面提供：

一种用于识别、诊断或监测细胞或组织表达pu.1的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包含能与基因pu.1或其编码的蛋白或蛋白片段相结合的结合剂。

优选，所述试剂或试剂盒进一步包含能与基因tim-3或其编码的蛋白或蛋白片段相结合的结合剂，能与基因cd11c或其编码的蛋白或蛋白片段相结合的结合剂，能与基因lmo2或其编码的蛋白或蛋白片段相结合的结合剂和能与基因myc或其编码的蛋白或蛋白片段相结合的结合剂中的至少一种。

优选，所述试剂或试剂盒用于识别、诊断或监测t-all或t/b混合型all。

检测细胞或组织表达pu.1的试剂或试剂盒在制备诊断试剂中的用途，所述试剂或试剂盒包含能与基因pu.1或其编码的蛋白或蛋白片段相结合的结合剂。

优选，所述试剂或试剂盒进一步包含能与基因tim-3或其编码的蛋白或蛋白片段相结合的结合剂，能与基因cd11c或其编码的蛋白或蛋白片段相结合的结合剂，能与基因lmo2或其编码的蛋白或蛋白片段相结合的结合剂和能与基因myc或其编码的蛋白或蛋白片段相结合的结合剂中的至少一种。

优选，所述诊断试剂用于识别、诊断或监测t-all或t/b混合型all。

优选所述试剂盒包括盛装一种或多种所述结合剂的一个容器或多个容器。进一步优选，还包含使用所述试剂盒的指导材料，例如说明书。

所述的结合剂包括核酸、配体、酶、底物、抗体等。

所述结合剂上可以进一步结合报告分子，例如荧光物质、放射性物质、酶等。

所述核酸可以是能与所述基因杂交的核酸探针；可以是能扩增所述基因的引物序列。

可以采用本领域已知的探针和引物序列的设计方法，根据所述目标基因的序列，设计并合成所述的核酸探针和引物序列，例如采用本领域已知的设计软件包括但不限于oligo、primerpremier、dnaman等。

所述抗体是能与所述基因编码的蛋白或者蛋白片段相结合的抗体。可以采用本领域已知的抗体制备方法制备获得相应的抗体，包括但不限于抗原免疫法、杂交瘤技术、噬菌体展示技术等。

在本发明的一个实施方式中，所述诊断试剂用于治疗前进行识别、诊断或监测t-all或t/b混合型all，以用于t-all或t/b混合型all患者的分子分型。所述分子分型可用于判断患者的预后，或者判断t-all或t/b混合型all患者对作用于分裂和增殖状态的肿瘤细胞的抗肿瘤药物治疗是否有响应或者是否会耐药，或者判断t-all或t/b混合型all患者是否需要联合使用pu.1抑制剂。

在本发明的一个实施方式中，所述诊断试剂用于治疗后识别、诊断或监测t-all或t/b混合型all，以用于判断t-all或t/b混合型all患者对作用于分裂和增殖状态的肿瘤细胞的抗肿瘤药物治疗是否有响应或者是否会耐药，或者用于评价治疗效果，或者用于判断t-all或t/b混合型all是否复发，或者判断t-all或t/b混合型all患者是否需要联合使用pu.1抑制剂。

一种检测或诊断方法，包括以下步骤：

a)测量从患者获得的组织或细胞的pu.1的表达水平；

b)根据测量结果进行判断。

优选，在步骤a)中进一步包括测量组织或细胞的tim-3、cd11c、lmo2和/或myc的表达水平。

优选，所述患者是t-all或t/b混合型all的患者。

在本发明的一个实施方式中，所述检测或诊断方法在患者接受治疗前进行，以用于t-all或t/b混合型all患者的分子分型。此时，在步骤b)中，如果肿瘤组织或细胞中表达了pu.1，则将该患者分类为pu.1阳性患者，意味该患者的预后较差。

在本发明的一个实施方式中，所述检测或诊断方法在患者接受治疗前进行，以用于判断t-all或t/b混合型all患者对作用于分裂和增殖状态的肿瘤细胞的抗肿瘤药物治疗是否有响应或者是否会耐药。此时，在步骤b)中，如果肿瘤组织或细胞中表达了pu.1，则该患者分类为响应不良或会耐药的。

在本发明的一个实施方式中，所述检测或诊断方法在患者接受治疗后进行，以用于判断t-all或t/b混合型all的治疗效果。此时，在步骤b)中，与治疗前测量的pu.1表达水平进行比较，如果肿瘤组织或细胞中表达了pu.1或者表达增高了，则该患者的治疗效果不佳；如果肿瘤组织或细胞中不表达pu.1或者表达降低了，则治疗效果较好。

在本发明的一个实施方式中，所述检测或诊断方法在患者接受治疗后进行，以用于判断患者t-all或t/b混合型all是否复发。此时，在步骤b)中，与治疗后的前一次测量的pu.1表达水平进行比较，如果肿瘤组织或细胞中表达了pu.1或者表达增高了，则预示着肿瘤复发；如果肿瘤组织或细胞中不表达pu.1或者表达降低了或未发生变化，则预示着未复发。

在本发明的一个实施方式中，所述检测或诊断方法在患者接受治疗前进行，以用于判断患者是否需要使用pu.1抑制剂。此时，在步骤b)中，如果肿瘤组织或细胞中表达了pu.1或者pu.1高表达，则该患者在施用作用于分裂和增殖状态的肿瘤细胞的抗肿瘤药物时，同时或之前或之后需要联合使用pu.1抑制剂。

在本发明的一个实施方式中，所述检测或诊断方法在患者接受治疗后进行，以用于判断患者是否需要使用pu.1抑制剂。此时，在步骤b)中，如果治疗后肿瘤组织或细胞中表达了pu.1或者pu.1表达增高，则该患者需要联合使用pu.1抑制剂。

在本发明的一个实施方式中，所述检测或诊断方法在患者接受dna甲基化抑制剂治疗后进行，以用于判断患者体内肿瘤细胞是否发生了pu.1去甲基化，或者判断患者体内肿瘤细胞是否发生了向肿瘤干细胞方向的转化。此时，在步骤b)中，如果治疗后肿瘤组织或细胞中表达了pu.1或者pu.1表达增高，则该患者体内肿瘤细胞发生了pu.1去甲基化，或者患者体内肿瘤细胞发生了向肿瘤干细胞方向的转化。

可以采用本领域已知的各种手段检测所述基因的表达水平，例如pcr，westen-blot，流式细胞技术，酶联免疫吸附技术等。

在本发明的一个实施方式中，采用本发明第二个方面所述的试剂或试剂盒进行所述的检测或诊断。

在本发明的一个实施方式中，对于t-all或t/b混合型all肿瘤组织，通过采用pu.1抗体标记细胞，利用流式细胞仪将标记了pu.1抗体的细胞分离出来，并可进一步计算pu.1抗体标记细胞占总体肿瘤细胞的比例。

根据本发明，所述的检测或诊断方法可以是在体内进行或者体外进行。

本发明的第三个方面提供：

pu.1抑制剂在制备抑制表达pu.1细胞的药物或者治疗pu.1表达所致疾病的药物中的应用。

优选，所述细胞为免疫细胞，包括但不限于t细胞、b细胞、nk细胞、树突状细胞等。

优选，所述疾病是自身免疫性疾病、增殖性疾病。

优选，所述疾病是肿瘤。

优选，所述疾病是恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征和白血病。

优选，所述疾病是t-all或t/b混合型all。

pu.1抑制剂和另一种或多种抗肿瘤药物联合在制备治疗肿瘤的药物中的应用，所述另一种或多种抗肿瘤药物是作用于分裂和增殖状态的肿瘤细胞，能够抑制细胞分裂、增殖和生长的抗肿瘤药物。

优选，所述肿瘤是恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征和白血病。

优选，所述肿瘤是t-all或t/b混合型all。

pu.1抑制剂和dna甲基化抑制剂联合在制备治疗肿瘤的药物中的用途。

优选，所述肿瘤是恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征和白血病。

优选，所述肿瘤是t-all或t/b混合型all。

治疗肿瘤的药物组合物，其含有pu.1抑制剂。

根据本发明，所述药物组合物中还进一步含有另一种或多种抗肿瘤药物，所述另一种或多种抗肿瘤药物是作用于分裂和增殖状态的肿瘤细胞，能够抑制细胞分裂、增殖和生长的抗肿瘤药物。

根据本发明，所述药物组合物中还进一步含有一种或多种dna甲基化抑制剂。

优选，所述肿瘤是恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征和白血病。

优选，所述肿瘤是t-all或t/b混合型all。

治疗肿瘤的药物组合套装，其含有两种或多种独立包装的药物组合物，其中一种独立包装的药物组合物含有pu.1抑制剂，其余的独立包装的药物组合物分别含有另一种或多种抗肿瘤药物或dna甲基化抑制剂，所述另一种或多种抗肿瘤药物是作用于分裂和增殖状态的肿瘤细胞，能够抑制细胞分裂、增殖和生长的抗肿瘤药物。

优选，所述肿瘤是恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征和白血病。

优选，所述肿瘤是t-all或t/b混合型all。

一种治疗肿瘤的方法，其特征在于，向有需要的患者给予pu.1抑制剂。

根据本发明，所述治疗方法中还进一步包含向所述患者给予另一种或多种抗肿瘤药物或dna甲基化抑制剂，所述另一种或多种抗肿瘤药物是作用于分裂和增殖状态的肿瘤细胞，能够抑制细胞分裂、增殖和生长的抗肿瘤药物。

优选，所述肿瘤是恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征和白血病。

优选，所述肿瘤是t-all或t/b混合型all。

术语“增殖性疾病”指非期望的过多的或异常的细胞不需要的或不受控制的增殖，例如赘生的或增生的生长(无论体外或体内)。增殖性疾病的实例包括但不限于恶性前的细胞增殖和恶性的细胞增殖，包括但不限于恶性的赘生物、肿瘤、骨髓增生异常综合征(mds)、牛皮癣、骨疾病、纤维增殖性紊乱(例如，结缔组织的纤维增殖性紊乱)、和动脉粥样硬化。可以治疗任何类型的细胞，包括但不限于肺、结肠、乳房、卵巢、前列腺、肝、胰腺、脑、造血系统和皮肤。

在本发明的一个实施方式中，所述增殖性疾病是骨髓增生异常综合征。

所述肿瘤包括实体瘤和非实体瘤，可以是良性的和恶性的。

所述实体瘤包括但不限于：来源于上皮组织的良性或恶性肿瘤，例如：乳头状瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺瘤、腺癌、移行上皮癌、恶性多形性腺瘤等；来源于间叶组织的良性或恶性肿瘤，例如：纤维肉瘤、脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、血管肉瘤、骨肉瘤、恶性巨细胞瘤、软骨肉瘤等；来源于淋巴组织的恶性肿瘤，例如：恶性淋巴瘤；来源于神经组织的良性或恶性肿瘤，例如：神经纤维肉瘤、恶性胶质细胞瘤、神经母细胞瘤；来源于其他组织的良性或恶性肿瘤，例如：恶性黑色素瘤、绒毛膜上皮癌、间质细胞瘤等。

所述非实体瘤包括但不限于：来自于造血组织的恶性肿瘤，例如：各种白血病，多发性骨髓瘤等。

所述恶性淋巴瘤包括：何杰金病、非何杰金淋巴瘤、burkitt淋巴瘤、蕈样霉菌病。

所述白血病包括：急性淋巴细胞性白血病(all)，慢性淋巴细胞性白血病(cll)，急性粒细胞性白血病(aml)，慢性粒细胞性白血病(cml)。

急性淋巴细胞性白血病(all)包括：t细胞性all(t-all)，b细胞性all(b-all)和混合性all(t/b-all)。

pu.1是转录因子，能够通过结合下游基因的特异性结合域(bindingmotif)而调控下游基因的表达，因此本发明中，pu.1抑制剂包括但不限于能抑制pu.1蛋白质活性或其蛋白质水平的化学物质，能抑制pu.1的mrna水平的化学物质，能够干扰pu.1-dna复合物形成的化学物质(例如，能够与pu.1竞争性结合下游基因的特异性结合域的化学物质)。

抑制pu.1蛋白质活性或蛋白质水平的化学物质包括但不限于pu.1蛋白质的抗体、抑制pu.1蛋白质活性或蛋白质水平的蛋白质、多肽、酶、小分子化合物(例如天然化合物、合成化合物等)。

抑制pu.1的mrna水平的化学物质可以是其反义核酸序列、sirna、mirna、shrna、dsrna，或者抑制pu.1的mrna水平的蛋白质、多肽、酶、小分子化合物(例如天然化合物、合成化合物等)。

干扰pu.1-dna复合物形成的化学物质可以是蛋白质、核酸序列、多肽、酶、小分子化合物(例如天然化合物、合成化合物等)，所述化学物质竞争性结合到pu.1所调控的下游基因的特异性结合域上或其结合域的相邻序列上，从而干扰pu.1结合到下游基因上，阻断pu.1转录因子的作用。

根据本发明，所述被pu.1调控的下游基因包括但不限于tim-3，cd11c，lom2，myc等，优选为tim-3，cd11c，lom2，myc。

在本发明的一个实施例中，所述化学物质竞争性结合到tim-3，cd11c，lom2，myc基因上pu.1的特异性结合域的核酸序列“ggaa”和/或“ttcc”上。

在本发明的一个实施方式中，所述pu.1抑制剂是db75、db1213、db293、db1281、db270、db1976或db1977。所述化合物的结构式如下所示，其制备方法可参考已知文献(structure-dependentinhibitionoftheets-familytranscriptionfactorpu.1bynovelheterocyclicdiamidines.manojmundeetal.nucleicacidsresearch,2013,1–12)。

在本发明的一个具体实施方式中，所述pu.1抑制剂是db1976或db1977。

在本发明的另一个实施方式中，所述pu.1抑制剂是pu.1的mrna的shrna，其干扰的靶向序列为：5’-agatctgatttacatacgga-3’。

优选所述shrna序列为：5’-tccgtatgtaaatcagatct-3’。

所述另一种或多种抗肿瘤药物是作用于分裂和增殖状态的肿瘤细胞，能够抑制细胞分裂、增殖和生长的抗肿瘤药物，包括但不限于：细胞毒性药物、激素类药物、生物反应调节剂、抗侵入剂、生长因子功能抑制剂、抗血管生成剂、血管损伤剂、内皮素受体拮抗剂、hsp90抑制剂、反义治疗药物、放射性药物等。

细胞毒性药物包括但不限于：作用于dna化学结构的药物，例如烷化剂、氮芥类、塞替派类、亚硝脲类、甲基磺酸酯类、铂类化合物、丝裂霉素等，具体如：氮芥、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、塞替派、卡莫司汀、司莫司汀、白消安、顺铂、奥沙利铂、卡铂、草酸铂、丝裂霉素等；影响核酸合成的药物，例如二氢叶酸还原酶抑制剂、胸腺核苷合成酶抑制剂、嘌呤核苷合成酶抑制剂、核苷酸还原酶抑制剂、dna多聚酶抑制剂，具体如：甲氨蝶呤、5-fu、ft-207、卡培他滨、6-巯基嘌呤、6-tg、羟基脲、阿糖胞苷、吉西他滨、培美曲塞等；作用于核酸转录的药物，例如放线菌素d、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、阿克拉霉素、光辉霉素等；作用于dna复制的拓扑异构酶i抑制剂，例如伊立替康、拓扑替康、羟基喜树碱等；作用于有丝分裂m期干扰微管蛋白合成的药物，例如紫杉醇、多西他赛、长春花碱、长春新碱、长春瑞滨、鬼臼碱类、高三尖杉酯碱等。

激素类药物包括但不限于：抗雌激素，例如三苯氧胺、托瑞米芬、依西美坦等；芳香化酶抑制剂，例如氨鲁米特、兰特隆、来曲唑、阿那曲唑等；孕激素，例如甲孕酮、甲地孕酮等；性激素，例如睾丸酮、雌激素等；抗雄激素，例如氟它氨等；rh-lh激动剂/拮抗剂，例如戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林等；糖皮质激素，例如地塞米松、波尼松龙等。

生物反应调节剂包括但不限于：干扰素，il-2，胸腺肽类等。

抗侵入剂包括但不限于：c-src激酶家族抑制剂如4-(6-氯-2,3-亚甲基二氧基苯胺基)-7-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]-5-四氢吡喃-4-基氧基喹唑啉(azd0530；国际专利申请wo01/94341)、n-(2-氯-6-甲基苯基)-2-{6-[4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基]-2-甲基嘧啶-4-基氨基}噻唑-5-甲酰胺(达沙替尼，bms-354825；j.med.chem.,2004,47,6658-6661)和博舒替尼(bosutinib)(ski-606)，以及金属蛋白酶抑制剂如马立马司他(marimastat)、尿激酶纤溶酶原激活物受体功能的抑制剂或乙酰肝素酶的抗体等。

生长因子功能的抑制剂包括但不限于：生长因子抗体和生长因子受体抗体，例如，抗erbb2抗体曲妥珠单抗、抗egfr抗体帕尼单抗、抗erbb1抗体西妥昔单抗以及通过stern等人.criticalreviewsinoncology/haematology，2005，第54卷，第11页-第29页公开的任何生长因子或生长因子受体抗体；酪氨酸激酶抑制剂，例如表皮生长因子家族的抑制剂(例如，egfr家族酪氨酸激酶抑制剂例如n-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉基丙氧基)喹唑啉-4-胺(吉非替尼，zd1839)、n-(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺(埃罗替尼，osi-774)和6-丙烯酰氨基-n-(3-氯-4-氟苯基)-7-(3-吗啉基丙氧基)-喹唑啉-4-胺(ci1033)，erbb2酪氨酸激酶抑制剂例如拉帕替尼)；肝细胞生长因子家族的抑制剂；胰岛素生长因子家族的抑制剂；血小板衍生的生长因子家族的抑制剂例如伊马替尼和/或尼罗替尼(amn107)；丝氨酸/苏氨酸激酶的抑制剂(例如ras/raf信号抑制剂例如法尼基转移酶抑制剂，例如索拉非尼(bay43-9006)、替吡法尼(r115777)和洛那法尼(sch66336))、通过mek激酶和/或akt激酶的细胞信号的抑制剂、c-kit抑制剂、abl激酶抑制剂、pi3激酶抑制剂、plt3激酶抑制剂、csf-1r激酶抑制剂、igf受体(胰岛素类生长因子)激酶抑制剂；极光激酶抑制剂(例如azd1152、ph739358、vx-680、mln8054、r763、mp235、mp529、vx-528和ax39459)和细胞周期素依赖性激酶抑制剂例如cdk2和/或cdk4抑制剂等。

抗血管形成剂包括但不限于：抑制血管内皮生长因子的作用的那些抑制剂，例如来那度胺、沙利度胺、抗血管内皮细胞生长因子抗体贝伐单抗，vegf受体酪氨酸激酶抑制剂凡德他尼(vandetanib)(zd6474)、瓦他拉尼(vatalanib)(ptk787)、舒尼替尼(su11248)、阿西替尼(ag-013736)、帕唑帕尼(gw786034)和4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯烷-1-基丙氧基)喹唑啉(azd2171；在wo00/47212内的实施例240)，诸如在国际专利申请wo97/22596、wo97/30035、wo97/32856和wo98/13354中公开的那些化合物以及通过其他机制起作用的化合物(例如利诺胺(linomide)、整合蛋白αvβ3功能的抑制剂和血管抑素等。

血管损伤剂包括但不限于：康普立停a4(combretastatina4)以及在国际专利申请wo99/02166、wo00/40529、wo00/41669、wo01/92224、wo02/04434和wo02/08213中公开的化合物等。

内皮素受体拮抗剂包括但不限于：zibotentan(zd4054)或阿曲生坦(atrasentan)等。

hsp90抑制剂包括但不限于：格尔德霉素、根赤壳菌素或17-n-烯丙基氨基-17-去甲氧格尔德霉素(17aag)等。

反义治疗药物，例如被导向至上文列出的靶标的那些反义物，比如isis2503(抗ras反义物)。

优选所述抗肿瘤药物为柔红霉素、阿霉素、去甲氧柔红霉素、米托蒽醌、rapamycin、利妥昔单抗、伊马替尼、来那度胺、沙利度胺、硼替佐米、地塞米松、波尼松龙、阿糖胞苷、环磷酰胺、6-巯基嘌呤、左旋门冬酰胺酶、甲氨碟呤、长春新碱和/或达沙替尼。

所述dna甲基化抑制剂包括但不限于可以使dna去甲基化的化学物质，包括但不限于：核苷类药物，例如地西他滨、5-氮-2-脱氧胞苷、折布拉林、法扎拉宾、二氢-5’-胞苷、5-氟-2-脱氧胞苷、二氢-5-氮杂胞苷等；非核苷类药物，例如氨基苯甲酸类、茶多酚类、肼类、邻苯二酰胺类、反义寡核苷酸类等，具体如普鲁卡因、普鲁卡因胺、表没食子儿茶素没食子酯酸、肼屈嗪、rg108、mg98、三氧化二砷。

在本发明的一个实施方式中，所述dna甲基化抑制剂选自5-氮-2-脱氧胞苷、地西他滨和三氧化二砷的任一种或其组合。

根据本发明，所述药物和药物组合物中含有药学上可接受的载体。

所述药学上可接受的辅料是制药领域中常用或已知的各种辅料，包括但不限于：稀释剂、粘合剂、抗氧化剂、ph调节剂、防腐剂、润滑剂、崩解剂等。

所述稀释剂例如：乳糖、淀粉、纤维素衍生物、无机钙盐、山梨醇等。所述粘合剂例如：淀粉、明胶、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮等。所述抗氧化剂例如：维生素e、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、丁羟基茴香醚等。所述ph调节剂例如：盐酸、氢氧化钠、柠檬酸、酒石酸、tris、乙酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等。所述防腐剂例如：对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、间甲酚、苯扎氯铵等。所述润滑剂例如：硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉等。所述崩解剂例如：淀粉、甲基纤维素、黄原胶、交联羧甲基纤维素钠等。

本发明药物和药物组合物的剂型可以是口服剂的形式，例如片剂、胶囊、丸剂、粉剂、颗粒剂、悬浮剂、糖浆剂等；也可以是注射给药的剂型，例如注射液、粉针剂等，通过静脉内、腹膜内、皮下或肌肉内的途径。所有使用的剂型形式都是药学领域普通技术人员所熟知的。

所述药物和药物组合物的施用途径包括但不限于：口服的；含服的；舌下的；透皮的；经黏膜的；鼻内的；眼用的；肺的；直肠的；阴道的；肠胃外的，例如，通过注射，包括皮下的、真皮内的、肌内的、静脉内的、动脉内的、心内的、鞘内的、脊柱内的、囊内的、囊下的、眼眶内的、腹膜内的、气管内的、表皮下的、关节内的、蛛网膜下的和胸骨内的；通过植入储库或储液器。

施用的剂量将取决于接受者的年龄、健康和体重，联用药物的种类，治疗频率，给药途径等。药物可以单一日剂量施用，或者总日剂量以每天两次，三次或四次的分开剂量施用。剂量可以施用一次或多次，施药时间可以单日至几个月或更长时间。

根据本发明，所述的药物组合物或者药物组合套装或者联合用药的治疗方法，可以同时给药，或顺序给药，或间隔一段时间后先后给药，或将上述给药方案结合使用。例如同时使用pu.1抑制剂和另一种或多种抗肿瘤药物或dna甲基化抑制剂；或者先给药pu.1抑制剂，之后紧接着给另一种或多种抗肿瘤药物或dna甲基化抑制剂；或者先给另一种或多种抗肿瘤药物或dna甲基化抑制剂，之后紧接着给药pu.1抑制剂；或者先给另一种或多种抗肿瘤药物或dna甲基化抑制剂一段时间后，再给药pu.1抑制剂。

具体给药顺序根据患者体内肿瘤细胞状态的检测结果进行选择和调整。

具体给药剂量，根据患者体内肿瘤细胞状态和整体身体状态，进行选择和调整。

在本发明的一个实施方式中，所述t-all或t/b混合型all是耐药的t-all或耐药的t/b混合型all，所述耐药指对作用于分裂和增殖状态的肿瘤细胞的抗肿瘤药物的耐药。

本发明的第四个方面提供：

筛选药物的方法，该方法包括以下步骤：

1)将受试化学物质与pu.1基因或其编码的蛋白或蛋白片段混合，或者将受试化学物质与表达pu.1基因的细胞混合，或者将受试化合物与被pu.1调控的下游基因的序列混合；

2)检测pu.1蛋白的活性变化、或者受试化学物质是否与pu.1的基因或其编码的蛋白或蛋白片段结合、或者所述细胞的活性变化、或者所述细胞的pu.1基因表达量的变化、或者所述细胞中被pu.1调控的下游基因的表达量的变化、或者受试化合物是否与被pu.1调控的下游基因的序列结合。

根据本发明，所述筛选药物的方法是在体外进行的。该药物筛选方法可以在医药工业的新药研发过程中使用。

根据本发明，所述筛选药物的方法是用于筛选pu.1抑制剂。

根据本发明，所述筛选药物的方法是用于筛选能抑制表达pu.1细胞的药物。

根据本发明，所述筛选药物的方法是用于筛选能治疗pu.1表达所致疾病的药物。

根据本发明，所述筛选药物的方法是用于筛选能治疗t-all或t/b混合型all的药物。

在本发明的一个实施方式中，所述筛选药物的方法是用于筛选能抑制表达pu.1的t-all或t/b混合型all细胞的药物。

根据本发明，所述被pu.1调控的下游基因包括但不限于tim-3，cd11c，lom2，myc等，优选为tim-3，cd11c，lom2，myc。

根据本发明，所述表达pu.1基因的细胞是t-all或t/b混合型all的细胞。

在本发明的一个实施方式中，所述表达pu.1基因的细胞是人t-all细胞ke-37或molt-16，ptennullt-all小鼠的tim-3high细胞。

在本发明的一个实施方式中，如果受试化合物与表达pu.1基因的细胞混合后，所述细胞的pu.1的基因表达被抑制了，则，所述受试化合物就是潜在的活性药物。

在本发明的一个实施方式中，如果受试化合物与表达pu.1基因的细胞混合后，所述细胞的tim-3、cd11c和/或lom2的表达降低，和/或myc的表达增高，则，所述受试化合物就是潜在的活性药物。

在本发明的一个实施方式中，如果受试化合物能与tim-3，cd11c，lom2，myc基因上pu.1的特异性结合域的核酸序列“ggaa”和/或“ttcc”相结合，则，所述受试化合物就是潜在的活性药物。

根据本发明，所述筛选药物的方法中步骤2)的检测可以采用本领域已知的各种检测手段，包括但不限于：流式细胞仪、酶联免疫吸附法、mtt法、实时pcr、westen-blot等。

本发明中的术语说明：

tim-3，又名havcr2，编码蛋白属于免疫球蛋白超家族和tim家族。已知该基因表达于th1细胞上，能够调节巨噬细胞的活性，并且抑制th1细胞介导的自体免疫反应，从而促进免疫耐受。

cd11c，又名itgax，该基因编码的蛋白是整合素α的x链。整合素是异源二聚体跨膜蛋白，包含α链和β链。整合素与中性粒细胞和单核细胞粘附并刺激内皮细胞，以及吞噬补体颗粒的作用有关。

pu.1，又名spi1，该基因编码ets域转录因子，该转录因子激活b淋巴细胞和髓性细胞发育过程中的基因表达。

myc，又称为c-myc，该基因是一种原癌基因，编码一种核蛋白，在细胞周期、细胞凋亡和细胞转化中起作用。在许多人类癌症中经常观察到这种基因的扩增。

lmo2，该基因编码一种富含半胱氨酸的具有两个lim结构域的蛋白，是卵黄囊红细胞生成所需的蛋白。lmo2蛋白在造血发育中起关键作用。

上述基因的基本信息如下(基因名称以hgnc为准，ng、nm和np编号以refseq数据库为准)：

术语“结合剂”、“结合分子”和“结合实体”是同义的，可以互换使用。在本发明的上下文中，结合剂结合、识别所述的基因、蛋白或蛋白片段，与之相互作用、反应或以别的方式发生关联。示例性结合剂可以包括但不限于抗体或其片段、抗原、适配体、核酸(例如dna和rna)、蛋白质(例如受体、酶、酶抑制剂、酶底物、配体)、肽、凝集素、脂肪酸或脂质和多糖。例如，在本发明的一些实施例中，结合剂包括抗体或其片段、核酸(例如dna和rna)。

术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核酸”是指由两个或更多个，优选地超过三个并且通常超过十个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸组成的分子。精确的大小将取决于许多因素，其继而取决于寡核苷酸最终的功能或用途。寡核苷酸可以以多种方式产生，包括化学合成、dna复制、逆转录或其组合。本发明中的核酸含有2-100个核苷酸。

本文中术语“核苷酸”和“碱基”可以互换使用，是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，以及任何其他经修饰的/未经修饰的嘌呤/嘧啶碱基的n-糖苷。所述嘌呤或嘧啶可以是但不限于腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和/或尿嘧啶，以及其他经修饰的、非标准或衍生的碱基。

术语“抗体”以最宽泛的意义使用，具体地涵盖合成抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、胞内抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、单价抗体、多价抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、灵长类化抗体、fab片段、f(ab')片段、单链fvfc(scfvfc)、单链fv(scfv)、抗独特型(抗id)抗体和任何其他免疫活性抗体片段，只要它们展示出所希望的生物活性(即，标记相关或结合)即可。在更广的意义上，本发明的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子(即，含有抗原结合部位的分子)的免疫活性片段，其中这些片段可以或可以不与另一个免疫球蛋白结构域(包括但不限于fc区或其片段)融合。此外，如在此更详细地概述的，术语抗体和多种抗体具体地包括fc变体或其片段，包括全长抗体和包含fc区的变体fc-融合物，其任选地包含至少一个氨基酸残基修饰并且与免疫球蛋白的免疫活性片段融合。

分子的“片段”意思是指分子的任何连续多肽或核苷酸子集。例如跨膜蛋白的片段可以包括仅包含胞外结构域或其某个部分的构建体。就本发明而言，标记片段或衍生物可以包括选择标记的任何免疫反应性或免疫活性部分。

分子(如标记)的“类似物”意思是指在功能上与整个分子或与其片段相似的分子。如在此使用的，当分子含有通常不是该分子的一部分的另外的化学部分时，将所述分子称为另一种分子的“化学衍生物”。这样的部分可以改善分子的溶解度、吸收、生物半衰期，等等。这些部分可以替代地降低分子的毒性、消除或减弱分子的任何不良副作用，等等。

术语“受试者”或“患者”可互换使用，包括但不限于人、非人类动物，例如非人灵长类如黑猩猩和其他猿类和猴种类；农场动物如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养受试者如狗和猫；实验室动物，包括啮齿类如小鼠、大鼠和豚鼠，等等。该术语不指示具体的年龄或性别。

术语“诊断剂”和“诊断试剂”的含义相同，是指用于诊断疾病或失调目的的任何分子、化合物、和/或物质。在优选的实施例中，诊断试剂应当包含与报告分子结合的结合剂。诊断试剂的其他非限制性实例包括抗体、抗体片段、或其他蛋白质，包括与检测试剂结合的那些。术语“检测试剂”或“报告分子”是指通过本领域技术人员可获得的任何方法学可检测的任何分子、化合物、和/或物质，非限制性实例包括染料、荧光标记、气体、金属、或放射性同位素。

术语“受试化学物质”是指被测定活性的化学物质，包括但不限于小分子化合物，核酸(dna或rna)，蛋白质或多肽(例如配体、抗体、融合蛋白等)，多糖等。

术语“抑制”是指与没有抑制剂的情况相比，蛋白质或细胞的活性降低。在一些实施方式中，术语“抑制”是指活性降低至少约25％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、或至少约95％。在其它实施方式中，抑制是指活性降低约25％至约50％、约50％至约75％、或约75％至100％。在一些实施方式中，抑制是指活性降低约95％至100％，例如活性降低95％、96％、97％、98％、99％、或100％。可使用多种本领域技术人员公知的技术来测量这样的降低。

术语“表达”和“基因表达”含义相同，是指细胞在生命过程中，把储存在dna顺序中的遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。

术语“表达增高”和“高表达”含义相同，是指与正常水平相比，基因转录的拷贝数增高，和/或翻译增高。根据本发明，基因转录的拷贝数增高，和/或翻译增高是超过正常水平至少1.3倍，例如，至少2、3、4、5、10、20或更多倍。

此外，不同物种的遗传背景复杂程度不同，在本发明的描述中，对于tim-3、cd11c、lmo2等而言，对于遗传背景干净的物种，例如小鼠等，其tim-3和cd11c等的“高表达”，就与遗传背景复杂的物种，例如人类等，其tim-3和cd11c等的“表达”含义相同。例如在本发明的一些实施方式中，采用流式细胞分析技术分析时，在人类细胞中tim-3和cd11c等采用抗体标记后与同型对照抗体(isotype)相比，荧光强度增加，就意味着“表达”了相应基因，而在小鼠细胞中tim-3和cd11c等采用抗体标记后与同型对照抗体(isotype)相比，荧光强度增加，就意味着“高表达”了相应基因。术语“表达降低”和“低表达”含义相同，是指与正常水平相比，基因转录的拷贝数降低，和/或翻译降低。根据本发明，基因转录的拷贝数降低，和/或翻译降低是不超过正常水平的0.8倍，例如，不超过0.5、0.33、0.25、0.1或更少倍。

术语“预后”是指预测疾病的可能病程和结局，既包括判断疾病的特定后果(如康复，某种症状、体征和并发症等其它异常的出现或消失及死亡)，也包括提供时间线索，如预测某段时间内发生某种结局的可能性。

在本发明中，lics和blast细胞均沿用前期文献(guow,laskyjl,changcj,etal.multi-geneticeventscollaborativelycontributetopten-nullleukaemiastem-cellformation[j].nature,2008,453(7194):529-533)中对应细胞的相同含义，lics即该文献中的lscs(leukaemiastem-cell，白血病干细胞)，其表面的分子标记为lin^-cd3⁺c-kit^mid；blast细胞即为该文献中的白血病细胞，其表面的分子标记为lin^-cd3⁺c-kit^-。

附图说明

图1：rna-seq操作流程图

图2：对t-all小鼠lics细胞和blast细胞进行rna-seq分析后获得lics细胞特异性表达的基因tim-3和cd11c。其中b部分是依据基因表达量通过wgcna分析获得的聚类图；c部分是对聚类得到的由lics细胞特异表达的220个基因进行功能性分析的结果图，分析结果显示这220个基因主要是编码膜蛋白的基因；d部分是tim-3和cd11c在lics细胞和blast细胞中表达量的统计对比图。

图3：利用流式细胞分析和分选方法，对t-all小鼠lics细胞和blast细胞按照tim-3和cd11c的蛋白表达量的高低进行细胞亚群的分选结果。

图4：单细胞转录组测序操作流程图

图5：t-all小鼠单细胞转录组信息分析结果图，其中b部分是对tim-3high亚群、tim-3middle亚群、tim-3low亚群和blast细胞进行的tsne分析结果，按照不同小鼠来源和细胞亚型进行表征，表明tim-3high亚群与其他亚群细胞区分度很高；c部分是对tim-3high亚群、tim-3middle亚群、tim-3low亚群和blast细胞进行谱系追踪分析的结果，在一个二维独立空间t-all细胞的表达谱，实线显示4个亚群细胞的主要分化路径，表明它们之间的发育顺序为tim-3high亚群→tim-3middle亚群→tim-3low亚群→blast细胞；d部分是基于单细胞分析结果进行的tim-3和cd11c表达量的伪时频分析(pseudo-temporalanalysis)。

图6：利用细胞内抗体染色和流式细胞分析，研究tim-3high亚群、tim-3middle亚群、tim-3low亚群和blast细胞中，干细胞相关信号通路nf-κb，erk1/2和β-canteninc，分化增殖相关基因c-myc的表达量。

图6-1和图6-2：t-all小鼠单细胞转录组信息分析结果图，tim-3high细胞亚群特异表达的基因主要富集在造血干细胞，晚期祖母细胞和免疫耐受等信号通路，blast细胞则富集于c-myc调控的淋巴瘤和细胞复制、分裂等信号通路。

图7：小鼠细胞移植实验操作流程图

图8：辐照后的小鼠移植不同浓度的tim-3high亚群、tim-3low亚群和lics细胞后，其生存曲线图；从左到右的图依次为稀释后注射10个，100个和1000个细胞后的生存曲线图，每个图中的线从左到右依次为tim-3high亚群组、lics细胞组和tim-3low亚群组。

图8-1：t-all小鼠给药rapamycin和tim-3抗体后，小鼠的生存曲线图，图中左边生存曲线为rapamycin和对照抗体组，右边曲线是rapamycin和tim-3抗体组。

图8-2：t-all小鼠给药rapamycin和tim-3抗体后组织he染色镜检图。

图9：基于单细胞测序信息，对tim-3high亚群、tim-3middle亚群、tim-3low亚群和blast细胞的pu.1、tim-3、cd11、c-myc的表达量进行伪时频分析图。

图9-1：pu.1与tim-3、tcrα、c-myc的特异性结合域示意图

图10：过表达pu.1的blast细胞株的分析结果，其中g部分是chip-qpcr的分析结果，过表达pu.1能导致tim-3，cd11c和lmo2表达升高，myc表达下降(n≥3,*,p≤0.05；**,p≤0.01；***,p≤0.001)，其中每个基因柱状图中右边的柱为过表达pu.1的细胞株的结果；h部分是野生型小鼠胸腺细胞、blast-egfp细胞和过表达pu.1的blast细胞中pu.1和c-myc蛋白水平的western-blot分析结果。

图11：pu.1敲低的ke-37细胞株的chip-qpcr分析结果，敲低pu.1可以导致tim-3，cd11c和lmo2表达下降，myc表达升高(n≥3,*,p≤0.05；**,p≤0.01；***,p≤0.001)，其中每个基因柱状图中右边的柱为敲低pu.1的细胞株的结果。

图12：不同pu.1负荷程度的小鼠生存曲线图：图中最左边的生存曲线是ptennullt-all小鼠的(pten^l/l；cre⁺；pu.1^+/+)，中间的生存曲线是敲除一半pu.1染色体的小鼠的(pten^l/l；cre⁺；pu.1^l/+)，最右边的生存曲线是pu.1被完全敲除的小鼠的(pten^l/l；cre⁺；pu.1^l/l)。

图13：不同pu.1负荷程度的小鼠各器官内tim-3high细胞亚群和blast细胞群体的比例(n≥3,*,p≤0.05；**,p≤0.01；***,p≤0.001)，其中每个基因柱状图中右边的柱为敲除pu.1的小鼠的结果。

图14：不同pu.1负荷程度的小鼠各器官的he染色镜检图：第一行为正常小鼠的胸腺、脾、肺、肾和肝脏的组织镜检图，第二行为t-all小鼠的胸腺、脾、肺、肾和肝脏的组织镜检图，第三行为pu.1完全被敲除的小鼠的胸腺、脾、肺、肾和肝脏的组织镜检图。

图15：db1976对tim-3，cd11c，lmo2和c-myc基因的表达影响，所述细胞为过表达pu.1的blast细胞株(n≥3,*,p≤0.05；**,p≤0.01；***,p≤0.001)。

图16：不同处理方式后t-all小鼠的生存曲线图：图中的生存曲线从左到右依次为对照组小鼠(5只，中位存活时间为63天)，单独给药db1976组小鼠(6只，中位存活时间为65天)，单独给药rapamycin组小鼠(7只，中位存活时间为89天)，联合给药db1976和rapamycin组小鼠(6只，中位存活时间为120天)。

图17：不同处理方式25天后t-all小鼠各器官中blast细胞和tim-3high细胞的绝对计数，不同的处理分别为对照组，单独给药db1976，单独给药rapamycin，联合给药db1976和rapamycin(n≥3,*,p≤0.05；**,p≤0.01；***,p≤0.001)，每个脏器的柱状图的柱从左到右依次对应与上述处理方式。

图18：不同处理方式后t-all小鼠的依赖于肿瘤中laz的成像图。

图18-1：t-all小鼠的tim-3high细胞向blast细胞分化过程中pu.1，bcl11a，bcl11b，lmo2，flt3和c-kit表达量的伪时频分析，与t细胞谱系分析结果一致。

图19：不同细胞中pu.1的启动子(promoter)区的甲基化水平示意图：图上部是野生型dp细胞、blast细胞和lics细胞的pu.1启动子区的甲基化位点的dna图谱，灰阶代表甲基化水平；图下部为tim-3^high,tim-3^middle,tim-3^low和blast细胞pu.1启动子区四个cpg位点的甲基化水平，每类细胞进行了15个克隆的测序和分析，空白圈代表该位点去甲基化，实心圈代表该位点甲基化。

图20：甲基化抑制剂5-az体外处理ptennullt-all小鼠的blast细胞后，对pu.1，tim-3，cd11c，lmo2，c-myc的表达进行定量pcr分析(n≥3,*,p≤0.05；**,p≤0.01；***,p≤0.001)，其中每个基因柱状图中右边的柱为5-az组的结果。

图21：甲基化抑制剂5-az给药1月龄ptennullt-all小鼠15天，细胞内染色确定blast细胞中pu.1和c-myc的蛋白质水平。

图22：ke-37和cem细胞中pu.1、tim-3和c-myc基因表达的定量pcr分析结果统计图(n≥3,*,p≤0.05；**,p≤0.01；***,p≤0.001)。

图23：5-az和db1976联合处理人t-all细胞cem，loucy，molt-3，molt-4后细胞存活率统计图(n≥3,*,p≤0.05；**,p≤0.01；***,p≤0.001)，其中每个基因柱状图中右边的柱为5-az组的结果。

图24：5μm5-az体外处理cem细胞后，移植不同浓度的cem细胞后小鼠的生存曲线，图中左边的曲线是移植了处理后cem细胞的小鼠生存曲线，右边的曲线是移植了未处理cem细胞的小鼠的生存曲线。

图25：人t-all细胞株中tim3表达量的流式细胞分析图：其中ke-37和molt-16表达tim-3，其他细胞株不表达tim3。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步描述。

需要说明的是，实施例不能作为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员理解，任何在本发明基础上所作的改进和变化都在本发明的保护范围之内。

以下实施例所用化学试剂都是常规试剂，均可商购获得。

具体实施例中所使用的实验方法如下：

1、流式细胞分析和分选方法：

相应年龄的ptennullt-all小鼠(构建方法参见：guow,laskyjl,changcj,etal.multi-geneticeventscollaborativelycontributetopten-nullleukaemiastem-cellformation[j].nature,2008,453(7194):529-533)处死后分别取骨髓(bm)，胸腺(thymus)，脾脏(spleen)等器官，通过研磨的方式获得单细胞悬液细胞(细胞溶解于hbss++：hbss+2％fbs+双抗)。分别取5×10⁶个细胞溶于200μl的hbss++，添加biolegend的流式细胞抗体，4℃下染色15-30min后1500rpm离心5min，去掉上清，重悬于1ml的hbss++后再次500rpm离心5min。去掉上清后重悬于200μl的hbss++，利用bd公司influx流式细胞分选仪进行细胞分选或者bd公司fortesa流式细胞分析仪进行分析。

在分析和分选lics和blast细胞时，加入的抗体为：ter119-apc-cy7，b220-apc-cy7(ra3-6b2)，cd45-pe或者fitc(30-f11)，cd3-pe-cy7(145-2c11)，c-kit-apc(2b8)。

对lics细胞的tim-3相关亚群分析和分选时，加入的抗体为：ter119-apc-cy7，b220-apc-cy7(ra3-6b2)，cd45-pe或者fitc(30-f11)，cd3-pe-cy7(145-2c11)，c-kit-apc(2b8)，tim-3-pe(b8.2c12)。依据tim-3的表达高低将lics细胞进行再细分。其中tim-3表达的检测依据tim-3抗体的染色后流式细胞仪分析检测，其定量依赖于tim-3抗体相对应的isotype。blast细胞群体的tim-3抗体标记结果和isotype群体的基本相同，为tim-3不表达状态。lics细胞依据tim-3的表达则出现三个不同群体，离isotype峰最远的细胞亚群为tim-3high，居中的为tim-3middle，最接近isotype峰的为tim-3low。

人t-all细胞的tim-3表达量的分析操作相同。

2、转录组高通量测序：

分选出的细胞按照qiagen公司的rna提取试剂盒的步骤(qiagen,74106)进行rna的提取。提取后的总rna按照neb公司rna-seq建库试剂盒的步骤进行文库的构建(neb,e7530)。建好的文库委托北京诺和致源公司进行高通量测序。

3、rna-seq测序数据的分析：

获取高通量测序的数据后，通过和参考序列的比对获取每个样本中每个基因的rpkm值后，进行后续的生物信息学研究。

wgcna具体方法参考langfelderp,horvaths.wgcna:anrpackageforweightedcorrelationnetworkanalysis[j].bmcbioinformatics,2008,9(1):559。

4、genego(功能性分析)：

具体分析方法参考ashburnerm,ballca,blakeja,etal.geneontology:toolfortheunificationofbiology[j].naturegenetics,2000,25(1):25。

5、单细胞测序及其分析方法：

分选出的细胞通过显微镜挑取的方式，每次挑取一个细胞到预先装有细胞裂解液的96孔板中，重复多次挑取直至达到测序需要的细胞数量。

参考以下文献的方法进行单细胞的测序以及数据的分析：

picellis,faridanior,k,etal.full-lengthrna-seqfromsinglecellsusingsmart-seq2[j].natureprotocols,2014,9(1):171。

t-sne：maatenl,hintong.visualizingdatausingt-sne[j].journalofmachinelearningresearch,2008,9(nov):2579-2605。

谱系追踪分析:trapnellc,cacchiarellid,grimsbyj,etal.thedynamicsandregulatorsofcellfatedecisionsarerevealedbypseudotemporalorderingofsinglecells[j].naturebiotechnology,2014,32(4):381-386。

pseudo-temporal分析:trapnellc,cacchiarellid,grimsbyj,etal.pseudo-temporalorderingofindividualcellsrevealsdynamicsandregulatorsofcellfatedecisions[j].naturebiotechnology,2014,32(4):381。

6、细胞胞内染色：

相应年龄的ptennullt-all小鼠处死后分别取骨髓(bm)，胸腺(thymus)，脾脏(spleen)等器官，通过研磨的方式获得单细胞悬液细胞(细胞溶解于hbss++：hbss+2％fbs+双抗)。

分别取2×10⁶个细胞悬于100μl的hbss++溶液。分别加入2μl的ter119-apc-cy7，b220-apc-cy7(ra3-6b2)，cd45-bv605(30-f11)，cd3-pe-cy7(145-2c11)，c-kit-apc(2b8)，tim-3-pe(b8.2c12)的表面抗体，4℃染色15-30min。

然后1500rpm离心5min后去上清，用100μl的细胞固定液a(gas003invitrogen)固定细胞，常温静置15min。

加入1ml预冷的hbss++溶液吹打20次，12000rpm离心30s。去掉上清，加入100μl的细胞打孔试剂b(gas003invitrogen)，吹打重悬。

分别加入相应的细胞膜内抗体c-myc(d84c12,cellsignalingtechnology)，pu.1(9g7,cellsignalingtechnology)，p-nf-κb(93h1,cellsignalingtechnology)，p-p44/42mapk(erk1/2)(d13.14.4e,cellsignalingtechnology)和non-phospho(active)β-catenin(d2u8y,cellsignalingtechnology)，根据抗体说明书的指引确定抗体加入量。室温旋转避光进行抗体标记30min。

标记完成后，加入1ml预冷的hbss++吹打20次，12000rpm离心30s。去掉上清，重复加入1ml预冷的hbss++吹打20次，12000rpm离心30s。

加入100μl打孔试剂b重悬细胞后，加入0.5μl/样的带有荧光fitc的二抗(711545-003，jacksonimmuneresearch)，室温旋转避光进行抗体标记30min。

加入1ml预冷的hbss++溶液吹打20次，12000rpm离心30s。去上清，重复加入1ml预冷的hbss++溶液吹打20次，12000rpm离心30s。去上清，利用200μlhbss++重悬后，利用流式细胞仪分析各个胞内蛋白的表达。

7、细胞移植实验(操作流程见图7)

免疫缺陷ncg小鼠购自南京模式生物研究所，属龄6周左右。小鼠饲养于北京大学动物中心一周后用于实验。

实验前5h利用x-ray辐射仪对小鼠造血系统进行破坏，照射剂量为2gry。同时取一只未照射的ncg小鼠用于载体细胞(carriercell)的获取。

carriercell的获取方法为：处死小鼠后，取出小鼠两条骨髓，在冰浴环境下，利用注射器吹打出骨髓中的细胞重悬于hbss++中。400g离心10min，去除上清，将细胞重悬于hbss++中，细胞计数后使其细胞浓度为1×10⁷/ml。

取ptennullt-all小鼠的骨髓，在冰浴环境下，利用注射器吹打出骨髓中的细胞重悬于hbss++中。400g离心10min，去除上清，将细胞重悬于1mlhbss++中，细胞计数后取2×10⁷细胞于1mlhbss++中。分别加入biolegend的流式细胞抗体ter119-apc-cy7，b220-apc-cy7(ra3-6b2)，cd45-pe或者fitc(30-f11)，cd3-pe-cy7(145-2c11)，c-kit-apc(2b8)，tim-3-pe(b8.2c12)，4℃下染色15-30min后1500rpm离心5min，去掉上清，重悬于1ml的hbss++后，再次1500rpm离心5min。去掉上清后重悬于500ul的hbss++，利用bd公司influx流式细胞分选仪进行细胞分选，分别分选出lin^-；cd3⁺；c-kit^mid，lin^-；cd3⁺；c-kit^mid；tim-3^high，lin^-；cd3⁺；c-kit^mid；tim-3^low。

将分选所得的每种细胞分别稀释为10⁵/ml，10⁴/ml，10³/ml，然后分别取100μl的细胞与10μl的carriercell混合后，尾静脉注射入照射的小鼠体内。观察小鼠的存活情况，每隔两个星期采取外周血检测白血病的发病情况。

8、tim-3抗体治疗实验

取23只两月龄的ptennullt-all小鼠随机分成2组，其中igg组10只，tim-3抗体组13只。

igg组小鼠给药igg(be0083bioxcell公司)和rapamycin，tim-3抗体组给药tim-3抗体(bp0115bioxcell公司)和rapamycin。igg和tim-3抗体的浓度均为100ng/只/次，采用隔天腹腔给药的方式。rapamycin给药浓度为4mg/kg/天，采用腹腔每天给药的方式。

持续给药24天后，每组分别取3只小鼠解剖后进行组织切片he的研究。余下小鼠持续给药60天后撤药观察其生存状态。

9、pu.1过表达blast细胞株的构建

通过分子克隆的方法构建mscv-pu.1-ires-gfp的pu.1过表达质粒。

mscv-ires-gfp的质粒购买于addgen(plasmid：20672)，将pcr扩增的pu.1cdna通过bgiii和ecori两个限制性酶切位点克隆入mscv-ires-gfp得到mscv-pu.1-ires-gfp。

将mscv-pu.1-ires-gfp和mscv-ires-gfp同时转染phoenix细胞(来自于ucla吴虹实验室)进行病毒的包装。24h后利用20％fbs的dmem换液。

72h后收集细胞上清，3000rpm离心10min。转移上清至无菌的50ml的离心管中，去除细胞残渣。转移病毒至超速离心管内，4℃下以rpm25000的转速超速离心2-2.5h。离心完成后，去除上清，取20μl培养基加入离心管底部。

利用293t细胞检测病毒的滴度以备后续感染需要。

将包装完成的病毒加入培养的blast细胞中，感染24后，对培养基进行换液处理，2-3天后利用流式细胞检测gfp阳性的细胞的比例。

待细胞扩增起来后，利用流式细胞仪分选出gfp阳性的细胞，即pu.1过表达的细胞系。

10、pu.1敲低ke-37细胞株的构建

通过分子克隆的方法构建pll3.7-shrna-gfp的pu.1shrna(序列：5’-tccgtatgtaaatcagatct-3’)质粒(由中国医学科学院张俊武教授提供，参考：chenmt,linhs,shenc,mayn,wangf,zhaohl,yuj,zhangjw.pu.1-regulatedlongnoncodingrnalnc-mccontrolshumanmonocyte/macrophagedifferentiationthroughinteractionwithmicrorna199a-5p.molcellbiol.2015；35:3212–3224.)引物序列见方法17。

将pll3.7-shrna-gfp和pll3.7-gfp连同包装质粒(pax2，pmd.2g)同时转染293t细胞进行病毒的包装，24h后利用20％fbs的dmem换液。

72h后收集细胞上清，3000rpm离心10min。转移上清至无菌的50ml的离心管中，去除细胞残渣。转移病毒至超速离心管内，4℃下以rpm25000的转速超速离心2-2.5h。离心完成后，去除上清，取20μl培养基加入离心管底部。

利用293t细胞检测病毒的滴度以备后续感染需要。

将包装完成的病毒加入培养的ke-37细胞中，感染24后，对培养基进行换液处理，2-3天后利用流式细胞检测gfp阳性的细胞的比例。

待细胞扩增起来后，利用流式细胞仪分选出gfp阳性的细胞，即pu.1敲低的细胞系。

11、pten和pu.1条件性敲除小鼠的构建

pten敲除小鼠(pten^loxp/loxp；ve-cadherin-cre⁺t-all，即ptennullt-all，构建方法同前)。

pu.1条件性敲除小鼠(pu.1^loxp/loxp)从澳大利亚沃尔特和伊丽莎·霍尔医学研究所stephenl.nutt教授处获得，该小鼠的构建方法参见：dakica,metcalfd,diragol,etal.pu.1regulatesthecommitmentofadulthematopoieticprogenitorsandrestrictsgranulopoiesis[j].journalofexperimentalmedicine,2005,201(9):1487-1502。

将pten^loxp/loxp；ve-cadherin-cre⁺t-all小鼠与pu.1^loxp/loxp小鼠经过三次杂交获得pten^loxp/loxp；ve-cadherin-cre⁺；pu.1^loxp/loxp用于后续研究(pten的鉴定见：guow,laskyjl,changcj,etal.multi-geneticeventscollaborativelycontributetopten-nullleukaemiastem-cellformation[j].nature,2008,453(7194):529-533，pu.1的鉴定见：dakica,metcalfd,diragol,etal.pu.1regulatesthecommitmentofadulthematopoieticprogenitorsandrestrictsgranulopoiesis[j].journalofexperimentalmedicine,2005,201(9):1487-1502。)。

12、db1976的合成和鉴定

合成路线：

化合物2的合成：4-氨基-3-硝基-苯甲脒盐酸盐1(108.3mg，0.50mmol)溶于10.7ml无水乙醇中，随后加入10％的钯碳(10.8mg)。用氢气将体系完全置换后，室温下搅拌24小时。随后过滤除去钯碳，将滤液在真空条件下旋干得到黄色化合物2(98.6mg，定量反应)。¹hnmr(400mhz,cd3od)δ7.11(dd,j＝2.4,8.4hz,1h),7.06(d,j＝2.4hz,1h),6.73(d,j＝8.4hz,1h)；¹³cnmr(100mhz,cd3od)δ167.7,143.9,135.3,121.3,116.3,115.4,115.2。

化合物4的合成:将硒酚3(670.0mg,5.10mmol)和四甲基乙二胺(711.0mg,6.12mmol)溶于1.6ml的无水正己烷中，将体系使用氩气完全置换后，将氩气通入反应液中7分钟，用冰盐浴将反应体系降温至零下5℃，将叔丁基锂的正己烷溶液(8.5ml,1.3m)逐滴缓慢加入到反应体系中，加完后反应体系缓慢升温至室温并回流30分钟。加入6.3ml新蒸四氢呋喃，并将反应体系降温至零下40℃，将无水n,n-二甲基甲酰胺(1.49g,20.4mmol)缓慢滴加进入反应体系中。加完后反应体系缓慢升温至室温，并在室温搅拌1.5小时。随后反应液缓慢倒入8.7ml的浓盐酸溶液中，加入饱和碳酸氢钠溶液调节ph值至6-7。随后用30.0ml乙醚萃取3次，有机相使用无水硫酸钠干燥。粗产品使用乙醇(4ml)重结晶，最后得到橙红色化合物4(626.1mg,66％)。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.89(s,2h),8.10(s,2h)；¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ184.8,156.2138.2。

化合物5的合成:将化合物2(56.0mg,0.30mmol)，化合物4(28.1mg,0.15mmol)和苯醌(32.4mg,0.30mmol)溶于6.0ml无水乙醇中，将反应体系充分用氩气置换后，回流8至10小时，tlc板上显示化合物4完全消失。将反应体系冷却至室温加入丙酮/乙醇(7.5ml/0.75ml)的混合溶液，充分搅拌后过滤，用无水乙醚洗涤滤出物，干燥得到黑色固体。再将固体溶于1：1混合的热甲醇/乙醇(13.2ml/13.2ml)混合液中，再次过滤滤除不溶物。将滤液浓缩至总体积9.0ml，随后加入0.9ml的氯化氢饱和的乙醇溶液，室温搅拌过夜。随后加入50.0ml的无水乙醚稀释反应体系，过滤分离得到固体，50℃真空干燥12小时，最终得到墨绿色固体5(57.4mg,两步收率85％)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.36(s,2h),9.04(s,2h),8.38(s,1h),8.16(s,1h),7.80(d,j＝8.8hz,1h),7.70(d,j＝8.4hz,1h)；¹³cnmr(125mhz,dmso-d6)δ165.9,149.9,141.0,139.5,137.8,132.8,123.2,122.4,115.9,114.8。

13、db1976和雷帕霉素的单独和联合给药

取35只2月鼠龄的ptennullt-all小鼠，将其随机分为4个小组，每组8-10只。

雷帕霉素组：腹腔给4mg/kg的雷帕霉素；db1976组：灌胃2.5mg/kg的db1976；联合给药组：腹腔给4mg/kg的雷帕霉素联合灌胃2.5mg/kg的db1976；对照组：给予等体积溶剂(5.2％peg400+5.2％tween80)。每组均每天给药1次。

其中，用于成像和苏木素-伊红染色，以及blast细胞和tim-3high细胞检测的小鼠分别给药25天；用于小鼠寿命监测的小鼠持续给药1个月，记录小鼠死亡时间。

14、过硫酸铵盐处理后的甲基化检测和高通量测序(小鼠)

利用前面的流式细胞分选和分析方法，分选出lics，blast细胞或者tim-3high亚群，tim-3middle亚群和tim-3low亚群。细胞离心富集后按照qiagendna提取试剂盒(qiagen,69504)的说明方法进行dna的提取。

提取的dna按照zymoezdnamethylation-directkit(zymoresearch)的说明书的方法进行过硫酸铵盐对dna的转化和dna的纯化回收。

过硫酸铵盐处理后的lics和blast细胞按照nebdna文库构建试剂盒(neb，e7645)的说明进行dna文库的构建，最后采用illuminahiseq4000测序，测序模式为双端150bp进行高通量测序的研究。数据的分析参考guow,fizievp,yanw,etal.bs-seeker2:aversatilealigningpipelineforbisulfitesequencingdata[j].bmcgenomics,2013,14(1):774。

过硫酸铵盐处理后tim-3high，tim-3middle，tim-3low亚群和blast细胞的dna，利用下面pcr体系对pu.1promoter区进行pcr扩增。

小鼠pu.1启动子区甲基化引物

pu.1bisdnafw5′-gaaaggagataaaatgtgggagat-3′

pu.1bisdnarv5′-ccaaataatccactattcttttaacct-3′

反应体系为：

pcr条件：

pcr后的样品跑琼脂糖胶后，按照qiagen胶回收试剂盒(qiagen，28704)的说明进行切胶回收。将回收后的dna样品按照全式金peasy-bluntcloningkit(全式金，cb101)的说明步骤克隆进入peasy-bluntcloning(全式金；cb101)载体。

利用peasy-bluntcloning载体的测序引物对插入片段进行sanger测序，并将测序的片段和原始片段输入http://quma.cdb.riken.jp/进行甲基化位点的检测和图标的绘制。

15、过硫酸铵盐处理后的甲基化检测和高通量测序(人细胞系)

所用方法和前述小鼠的方法相同，区别在于pu.1启动子区甲基化引物如下：

humanpu.1bisdnafw5′-gagattttttgtatgtagygtaaga-3′

humanpu.1bisdnafw5′-taacttcccactaataacaaacca-3′。

16、细胞增殖生长的测定

将5×10⁵细胞(cem，loucy，molt-3，molt-4)提前培养于24孔板中，培养24小时后，分为四组：db1976组(加入2μm或4μm的db1976)，5-az组(加入5μm的5-az)，两种药物联用组(加入2μm或4μm的db1976和5μm的5-az)，对照组(加入等体积水)。

每组分别处理72小时后，用微量移液器吹打混匀细胞，使细胞充分混匀，吸取10μl细胞悬液和10μl台盼蓝等体积混合，取10μl混合液用血细胞计数板进行计数。重复计数3次取平均值。

细胞存活率(％)＝(1-药物处理组细胞数/对照组细胞数)×100％

17、实时定量pcr

取1×10⁵分选的细胞或者培养的细胞，按照qiagen公司的rna提取试剂盒的步骤(qiagen,74106)进行rna的提取。

取200ng总的rna用于cdna的合成，cdna的合成按照vazyme(r223-01)的说明书的方法进行。

将逆转录cdna稀释10倍后，用于q-pcr。pcr的体系和条件按照vazyme(q121-01)说明书的体系和条件进行。引物如下：

小鼠：

actin-f:5’-gatggtgggaatgggtcag-3’

actin-r:5’-tttgatgtcacgcacgatttcc-3’

c-myc-f：5’-gtgctgcatgaggagacacc-3’

c-myc-r:5’-tttgcctcttctccacagaca-3’

tim-3-f:5’-cccctgccaagtactcatgt-3’

tim-3-r:5’-caagtgccccaggtgtagat-3’

cd11c-f:5’-gagtcagggcctctggagta-3’

cd11c-r:5’-ggtttttggggttccgggta-3’

pu.1-f:5’-agcgatggagaaagccatag-3’

pu.1-r:5’-tgcagctctgtgaagtggtt-3’

lmo2-f:5’-tgggtgaggcatttcttagg-3’

lmo2-r:5’-gcctatcaggatggcacagt-3’

人：

actin-f:5’-ggaacggtgaaggtgacagc-3’

actin-r:5’-aatcaaagtcctcggccaca-3’

c-myc-f：5’-tccacctccagcttgtacct-3’

c-myc-r:5’-gctgtcgttgagagggtagg-3’

tim-3-f:5’-gctactacttacaaggtcctcag-3’

tim-3-r:5’-attcacatccctttcatcagtc-3’

cd11c-f:5’-gtggtggtgtgatgctgttc-3’

cd11c-r:5’-atactgcagcctggaggaga-3’

pu.1-f:5’-gctctagaatgttacaggcgtgcaaaatgg-3’

pu.1-r:5’-cggaattctcagtggggcgggtggc-3’

lmo2-f:5’-aggcaattagcccagaaggt-3’

lmo2-r:5’-ctcctctctcgggaaggtct-3’

shpu.1–f:tgtccgtatgtaaatcagatctttcaagagaagat

ctgatttacatacggacttttttc

shpu.1–r:tcgagaaaaaagtccgtatgtaaatcagatct

tctcttgaaagatctgatttacatacggaca

18.5-az给药后细胞移植实验

免疫缺陷ncg小鼠购自南京模式生物研究所，属龄6周左右。小鼠饲养于北京大学动物中心一周后用于实验。实验前5h利用x-ray辐射仪对小鼠造血系统进行破坏，照射剂量为2gry。同时取一只未照射的ncg小鼠用于载体细胞(carriercell)的获取。

实验前7天将1×10⁶细胞铺种于6孔板中。培养12h后，分别加入5μm的5-az和相应体积的水，48小时换一次液和加入新鲜培养基。6天后收集细胞并利用血细胞计数板对细胞进行计数。将细胞分别稀释为10⁶/ml，10⁵/ml，10⁴/ml。分别取100ul的细胞与10ul的carriercell(carriercell的获取同方法7)混合后，尾静脉注射入照射的小鼠体内。观察小鼠的存活情况，每隔一个星期采取外周血检测白血病的发病情况。

19、5-az体外处理blast细胞检测tim-3，cd11c，pu.1，lmo2和c-myc的表达。

取1×10⁶的blast细胞种植于1640加血清的培养基中24小时，分别加入5μm的5-az和相应体积的水，给药处理72小时后，离心收集细胞，按照方法17的步骤提取rna反转录和进行实时pcr检测。

20、db976体外处理blast-gfp细胞检测tim-3，cd11c，pu.1，lmo2和c-myc的表达。

取1×10⁶的blast-gfp细胞种植于dmem加血清的培养基中24小时，分别加入2μm，4μm和8μm的db1976和相应体积的dmso，给药处理24小时后，离心收集细胞，按照方法17的步骤提取rna反转录和进行实时pcr检测。

实施例1lics细胞亚群分选

按照流式细胞分析和分选方法操作，分选出lics细胞(lin^-cd3⁺c-kit^mid)和blast细胞(lin^-cd3⁺c-kit^-)，进行高通量测序(操作流程图见图1)。对测序获得的信息，基于blast细胞和lics表达谱的不同，通过生物信息学wgcna分析进行聚类树状图，确定出只在lics中特异性表达的220个基因，将这些基因组合定义为lics特异表达模块(见图2的b部分)，进一步的功能性分析发现，lics特异表达模块中的基因大部分都是膜蛋白，例如tim-3和cd11c(见图2的c和d部分)。通过流式细胞仪的分析发现，tim-3和cd11c在细胞表达量上有很高的相关性，依据tim-3的表达量，可以将来源于t-all小鼠的胸腺、脾脏、骨髓的lics群体进一步分为tim-3high亚群、tim-3middle亚群、tim-3low亚群(见图3)。

实施例2对lics的细胞亚群进行谱系追踪分析

依据分选出的tim-3high亚群、tim-3middle亚群、tim-3low亚群，对lics进行群体间发育关系的研究。按照前述单细胞测序及分析方法，对流式细胞分选出来的tim-3high，tim-3middle，tim-3low和blast细胞进行转录组学研究(操作流程见图4)，一共研究了来源于两只小鼠(雌雄各一只)的281个细胞，其中tim-3high亚群的90个，tim-3middle亚群的38个，tim-3low亚群的76个，blast细胞77个，每一簇细胞的转录组和基因数量都满足分析要求，获得的读段数(reads)也符合分析要求。

通过t-sne等生物信息学研究发现，取自不同小鼠的lics中，tim-3high亚群与其他亚群细胞能很好分开(图5的b部分)。谱系追踪分析发现，白血病的发育路径是由tim-3high亚群开始，经tim-3middle亚群，tim-3low亚群最终成为末端分化的blast细胞(图5的c部分)。该动态发育路径也可以通过单个细胞的tim-3和cd11c表达量的pseudotemporal排序证实(图5的d部分)。

前期的研究发现在lics细胞中，可以根据c-myc的蛋白水平将lics分为c-myc低表达和c-myc高表达群体，c-myc低表达群体占lics群体的30％，且该细胞群体对于brd4的抑制剂jq1和雷帕霉素具有耐药性，细胞处于静息状态(guow,laskyjl,changcj,etal.multi-geneticeventscollaborativelycontributetopten-nullleukaemiastem-cellformation[j].nature,2008,453(7194):529-533)。本发明中，按照前述细胞内染色方法和流式细胞分析和分选的方法，对tim-3high细胞亚群进行进一步分析发现，tim-3high细胞亚群和lics细胞中c-myc低表达群体为同一群体细胞，其干细胞相关信号通路nf-κb，erk1/2和β-canteninc等均处于激活状态，而分化增值相关基因c-myc在基因和蛋白水平均低于blast细胞(图6)。

利用单细胞测序及其分析方法，分析得到tim-3high细胞亚群特异表达的基因主要富集在造血干细胞，晚期祖母细胞和免疫耐受等信号通路，相对而言，blast细胞则富集于c-myc调控的淋巴瘤和细胞复制、分裂等信号通路(图6-1和图6-2)。

且tim-3high细胞亚群在lics中的比例在t-all的诞生器官胸腺中最高(胸腺中tim-3high细胞亚群在lics中的比例为40％左右，脾和骨髓中均为15％左右)，tim-3high细胞亚群中处于g0/1期的细胞比例(76.3％)也远远高于blast细胞的(43.1％)。

实施例3lics中各亚群细胞的体内成瘤性研究

按照前述细胞移植实验方法，将tim-3high亚群(lin^-cd3⁺c-kit^midtim-3^high)，tim-3low亚群(lin^-cd3⁺c-kit^midtim-3^low)和lics群体细胞(lin^-cd3⁺c-kit^mid)移植免疫缺陷小鼠ncg，观察小鼠成瘤和存活指标。

结果见图8，随着移植细胞数量的增加，tim-3high亚群组、tim-3low亚群组和lics组的生存时间均逐渐缩短；在相同的细胞移植量下，与tim-3low亚群组和lics组相比，tim-3high亚群组小鼠的死亡时间都显著缩短，其中当移植细胞数降低为10个时，tim-3high亚群组的小鼠全部死亡，而tim-3low亚群组仅死亡一只，lics组死亡三只。由此可见，tim-3high亚群具有较强的成瘤性，小鼠死亡时间显著性提前。

实施例4tim-3抗体对t-all小鼠的治疗

采用t-all小鼠模型，按前述方法8中的实验方法，给药rapamycin和tim-3抗体，观察小鼠的生存情况，结果如图8-1：igg组，小鼠在100天左右全部死亡，tim-3抗体组，在180天内有5只死亡，其中除一个小鼠在90天死亡外，其余小鼠的死亡时间都大于120天。说明联合应用了tim3抗体后，小鼠的生存时间延长，死亡数量减少，表明tim-3抗体能够治疗t-all。

经过组织he染色镜检可见，tim-3抗体小鼠的肿瘤组织形态要好于igg组小鼠的(图8-2)。

实施例5pu.1在tim-3high细胞亚群中特异性表达

t细胞的发育是众多转录因子相互协调和控制的结果。单细胞测序研究同样表明ptennullt-all的lics主要定位于t细胞发育的早期。通过寻找lics的核心转录因子发现，pu.1调控lics中tim-3high细胞亚群特异表达的基因中的约50％左右的基因的表达情况(414/816)。pu.1对于t细胞的发育至关重要，且pu.1和其他基因的融合在t-all中也有发现。根据单细胞测序获得的各基因表达量进行伪时频分析发现，pu.1特异性地在tim-3high细胞亚群中表达，表达上与tim-3和cd11c具有很强的正相关性，和myc具有负相关(图9)。

按照前述实验方法建立过表达pu.1的blast细胞株，并进行chip-qpcr的研究发现，pu.1可以直接结合在tim-3的启动子区域、c-myc、tcrα的ea区域(图9-1)。并且过表达pu.1能导致tim-3，cd11c和lmo2表达升高，myc表达下降(图10)。

按照前述实验方法利用sirna建立pu.1敲低的ke-37细胞株，并进行chip-qpcr的研究发现，敲低pu.1的表达可以导致tim-3，cd11c和lmo2表达下降，myc表达升高(图11)。

通过分析病人样本(数据来源于：liu,y.；easton,j.；shao,y.；maciaszek,j.；wang,z.；wilkinson,m.r.；mccastlain,k.；edmonson,m.；pounds,s.b.；shi,l.；etal.thegenomiclandscapeofpediatricandyoungadultt-lineageacutelymphoblasticleukemia.nat.genet.2017,49,1211–1218.)的测序结果发现，在病人中pu.1与tim-3，cd11c和lmo2具有很强的正相关，与myc负相关。

实施例6pu.1敲除可阻止白血病的发生

为了验证pu.1在功能上对于t-all的影响，按照前述实验方法，将pu.1条件性敲除小鼠和ptennullt-all小鼠进行交配，在t-all小鼠模型中敲除pu.1发现：敲除一半pu.1的染色体就能很好的延长小鼠寿命和减轻小鼠白血病的负荷(pten^l/l；cre⁺；pu.1^l/+，6只，中位存活时间为87天)。完全敲除pu.1则能在三个月内完全阻止白血病的发生(pten^l/l；cre⁺；pu.1^l/l，4只，中位存活时间为120天)。而ptennullt-all小鼠pten^l/l；cre⁺；pu.1^+/+，9只，中位存活时间只有59天(图12)。

并且利用流式细胞分析发现完全敲除pu.1的小鼠体内，3个月内几乎检测不到tim-3high细胞亚群和blast细胞群体(图13)。同时相对白血病小鼠各个器官肿瘤的浸润，pu.1敲除小鼠具有很好的器官形态(图14)。

实施例7db1976对t-all的治疗效果

对于已经发生了白血病的小鼠，研究能否通过靶向tim-3high群体来治疗白血病。db1976是pu.1的小分子抑制剂，在过表达pu.1的blast细胞中进行了检测，发现2-8μm的db1976在细胞水平可以很好的抑制tim-3，cd11c和lmo2基因的表达，同时上调myc基因的表达，db1976的相应作用具有量效关系，而db1976对pu.1的表达没有影响(图15)。

按照前述实验方法，将rapamycin和db1976进行单独和联合给药t-all小鼠，单独的使用任何一个抑制剂都会导致小鼠的死亡，但死亡原因不太相同，rapamycin组是由于rapamycin只能杀死blast细胞，但对lics中tim-3high亚群不具有杀伤性，最后由于耐药而死亡；db1976组由于db1976只能靶向lics中tim-3high亚群而对肿瘤细胞不具有杀伤性，最终小鼠由于白血病细胞大量的扩增而死亡。联合用药组，rapamycin和db1976能同时靶向blast细胞和lics中tim-3high亚群，才能有效的延长小鼠的生存期(图16)。

细胞的绝对计数表明db1976和rapamycin单独使用均不能很好地杀伤blast细胞和tim-3high细胞亚群，而联合用药不仅可以很好地杀伤blast细胞，同时对tim-3high细胞亚群也有显著的杀伤(图17)。

通过依赖于肿瘤细胞中laz的成像实验(图18)可以很清楚的观察到：白血病细胞在联合给药后的小鼠体内明显减少，而单独给药rapamycin或db1976都无法抑制白血病在小鼠体内的增殖和生长。此外，经组织he染色镜检，小鼠各器官在联合给药后也能恢复到很好的器官组织形态；小鼠体重在给药前后没有显著的改变。

实施例8pu.1在不同细胞中的甲基化情况

pu.1在t细胞的发育的早期处于高表达状态，利用单细胞测序及其分析方法，通过将tim-3high细胞亚群特异表达的基因与t细胞发育的各个阶段群体特征性基因进行对比研究发现，tim-3high亚群的特征趋近于dn2a的t细胞发育阶段，如bcl11a，pu.1和tim-3的高表达，bcl11b的低表达(图18-1)。dna的甲基化对于基因的表达调控起着非常重要的作用。按照前述实验方法，对blast细胞和lics细胞进行过硫酸铵盐处理后的甲基化高通量测序研究，发现blast细胞和lics的特异性基因的甲基化整体水平没有显著性差异，但pu.1的promoter区的甲基化水平在lics和blast细胞之间存在显著性差异，即，lics的pu.1的promoter区处于低甲基化状态，而blast细胞的处于高甲基化状态，进一步分析发现，lics的tim-3high亚群细胞的pu.1promoter区甲基化水平远低于tim-3middle亚群、tim-3low亚群和blast细胞(图19)。

利用甲基化抑制剂5-az可以在体外显著性地恢复blast细胞中pu.1，tim-3，cd11c基因的表达，其中pu.1被恢复的程度最大，可以降低c-myc的表达(图20)，此外，通过甲基化抑制剂5-az体内给药ptennullt-all小鼠，经细胞内染色发现，blast细胞中pu.1的蛋白水平升高，c-myc的蛋白水平降低(图21)。

另外，分别用4μm和8μm的5-az体外处理人t-all细胞系ke-37(表达pu.1和tim-3)和cem(不表达pu.1和tim-3)后，各浓度处理后的ke-37细胞中pu.1和tim-3的表达变化，与未处理组相比无显著性差异，而4μm5-az处理后的cem细胞中则出现pu.1和tim-3基因的表达上调，myc基因的表达下调，与未处理组相比变化均有极其显著的差异，8μm5-az处理后的cem细胞中pu.1基因的表达上调与未处理组相比有极其显著的差异，tim-3基因的表达有上调、myc基因的表达有下调，但与未处理组相比均差异不显著(图22)，证明在人的t-all细胞中，pu.1同样受甲基化的调控。

实施例95-az和db1976对t-all的作用

按照前述实验方法，采用5-az和pu.1抑制剂db1976联合用药的方式处理人t-all细胞株(cem，loucy，molt-3，molt-4，细胞均来源于ucla吴虹实验室)，可以看到单独使用5-az均可显著抑制cem，loucy，molt-3，molt-4细胞的生长，联合应用db1976之后，cem，loucy，molt-3，molt-4的生长抑制更明显，并且4μm的db1976抑制率高于2μm的，存在量效关系(图23)。

通过体外cem细胞给药5-az后移植不同浓度的实验组和给药组cem细胞可以发现，移植了5-az处理后的cem细胞的小鼠存活时间均显著短于移植了未处理cem细胞的小鼠，随着移植的处理后cem细胞数量的增加，小鼠的存活时间缩短，存在量效关系。由于5-az处理后cem细胞的tim3表达增加，由此说明，5-az处理可以是cem细胞向肿瘤干细胞方向转化(图24)。