一种耐四环素的大肠埃希氏菌及应用的制作方法

本申请属于生物技术领域，具体地说，涉及一种耐四环素的大肠埃希氏菌(escherichiacoli)及应用。

背景技术：

大肠杆菌病是人兽共患病，动物罹患大肠杆菌病的情况十分普遍，原因甚多，临床反复、多次使用相同抗生素容易导致耐药菌株的出现是其原因之一，耐药菌株使抗生素失去抗菌活性而失效。因此耐药菌株的获得，是实验室研究耐药机理、寻找替代抗菌药物的关键，也是有效控制养殖场大肠杆菌病发生的必要材料。

目前研究表明，耐药菌株的获得主要通过临床分离、环境获取、实验室药物诱导细菌耐药等。其中，药物诱导细菌耐药是实验室获得耐药菌株最为方便的途径，而且在药物诱导过程中能够发现细菌对药物的耐受情况，表观细菌对药物敏感到耐药过程、耐药规律以及对耐药机制的探索。实验室采用亚抑菌浓度的药物对质控细菌菌株进行诱导，常常出现的问题是要求较高，操作繁琐，耗费时间较长，且菌株容易出现污染等，使得该方法在短时间类不易获得耐药菌株。如何在简单有效且耗时少地获得实验室药物诱导耐药菌株，是目前困扰实验室研究人员的一大难题。

技术实现要素：

有鉴于此，本申请针对亚抑菌浓度药物诱导细菌耐药法所出现的要求较高，操作繁琐，耗费时间较长，且菌株容易出现污染的问题，提供了一种耐四环素的大肠埃希氏菌(escherichiacoli)及应用。

为了解决上述技术问题，本申请公开了一种耐四环素的大肠埃希氏菌(escherichiacoli)，该菌株于2017年7月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.14456。

进一步地，该菌株的形态特性如下：分离菌株能够在麦康凯培养基上生长，呈红色的、凸起的、圆滑的、湿润的小菌落。

本发明还公开了一种上述的耐四环素的大肠埃希氏菌(escherichiacoli)的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、细菌的分离培养与形态学观察：取病死鸭肝脏组织无菌接种于麦康凯琼脂平板培养基，置恒温37℃条件下培养18-24h观察细菌生长情况；挑取培养基上成粉红色的单个菌落进行革兰氏染色镜检，然后勾取相同的单个菌落接种于麦康凯琼脂平板培养基上进一步分离纯化，将分离纯化的细菌再接种到琼脂斜面上，编号为a，并保存备用；

步骤2、菌株a四环素药敏试验：将菌株a均匀涂布接种于营养琼脂培养基上，按照k-b纸片扩散法进行四环素药敏试验，判定标准参照美国临床实验室标准协会药敏纸片扩散法标准(2010版)；

步骤3、菌株a动物回归试验：将菌株a接种到营养肉汤培养基中，37℃摇振培养12h，菌液经麦氏比浊使菌液含量为1×10⁸.cfu/ml；试验健康雏鸭10只，随机分为试验组和对照组，每组5只；试验组雏鸭肌肉注射菌液，1ml/只，对照组雏鸭肌肉注射生理盐水，1ml/只，观察1周并记录雏鸭发病及死亡情况；

步骤4、四环素耐药菌株诱导试验：将菌株a进行四环素药敏试验，初次可选取四环素药敏纸片抑菌圈边缘的菌再次进行四环素药敏试验，重复多次四环素药敏诱导试验，直至选出四环素抑菌圈直径变成0mm为止的耐药菌株，将此菌株编号为b3，即制备得到权利要求1所述的耐四环素的大肠埃希氏菌(escherichiacoli)。

本发明还公开了一种上述的耐四环素的大肠埃希氏菌(escherichiacoli)在制备耐四环素的产品中的应用。

本发明还公开了一种抑制上述的耐四环素的大肠埃希氏菌(escherichiacoli)的中药，所述中药为黄芩、大黄、大青叶、板蓝根或连翘中的一种。

进一步地，所述连翘对耐四环素的大肠埃希氏菌(escherichiacoli)的最低抑菌浓度为0.125g/ml，黄芩为0.5g/ml，大黄为0.25g/ml。

与现有技术相比，本申请可以获得包括以下技术效果：

1)本发明所提供的大肠杆菌耐药菌株的获取方法针对性强，目标明确。

2)本发明所提供的方法是建立在原亚抑菌浓度药物诱导细菌耐药的原理上进行，方法较前人的更加简便快捷，耗时短，且作用明显。

3)本发明所提供的大肠杆菌b3菌株接种在普通营养肉汤中进行增菌培养，对雏鸭进行动物回归试验，显示了良好的致病能力。

4)本发明所提供的大肠杆菌b3菌株耐药性状稳定，半年后对其进行药敏试验，仍显示出耐药性质，说明该耐药菌株稳定且很难逆转。

当然，实施本申请的任一产品必不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

图1是本申请对四环素敏感(右)和耐药(左)的大肠杆菌；

图2是本发明黄芩对本申请中耐四环素菌株的体外抑菌试验结果，其中，a为正面拍摄图，b为背面拍摄图；

图3是本发明大黄对本申请中耐四环素菌株的体外抑菌试验结果；

图4是本发明板蓝根对本申请中耐四环素菌株的体外抑菌试验结果；

图5是本发明连翘对本申请中耐四环素菌株的体外抑菌试验结果；

图6是本发明大青叶对本申请中耐四环素菌株的体外抑菌试验结果。

具体实施方式

以下将配合附图及实施例来详细说明本申请的实施方式，藉此对本申请如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

10日龄健康雏鸭15只，购自重庆市荣昌区鸭苗市场，随机分为1个对照组、1个敏感菌组和1个耐药菌组，共3个试验组，每组5只雏鸭。

病死鸭来自重庆市荣昌区某鸭场。该鸭场饲养花边肉鸭约500只，30日龄，体重约1.5kg。某日天气突变，闷热，鸭子饮水渐少，鸭场卫生条件逐渐恶劣，个别鸭只出现食欲减少、精神萎顿、排白色稀粪的症状。主采用青霉素、土霉素、氟苯尼考等药物结合清热燥湿的中药如白头翁、大黄、黄芩、黄柏等饮水、拌料治疗，效果不甚理想，每天死亡7～8只，采集病死鸭肝脏用于实验室诊断。

四环素药敏试纸片(30μg/片)，购自杭州滨和微生物试剂有限公司；营养肉汤、营养琼脂、麦康凯琼脂培养基、肠杆菌科细菌生化微量反应管20支，均购自杭州滨和微生物试剂有限公司。

实施例1菌的分离与鉴定

一、菌的分离

(一)、细菌的分离培养与形态学观察

取病死鸭肝脏组织无菌接种于麦康凯琼脂平板培养基，置恒温37℃条件下培养18-24h观察细菌生长情况；挑取培养基上成粉红色的单个菌落进行革兰氏染色镜检，然后勾取相同的单个菌落接种于麦康凯琼脂平板培养基上进一步分离纯化，将分离纯化的细菌再接种到琼脂斜面上，编号为a，并保存备用。

(二)、菌株a四环素药敏试验

将菌株a均匀涂布接种于营养琼脂培养基上，按照k-b纸片扩散法进行四环素药敏试验(沙莎,宋振辉.动物微生物实验教程[m].重庆：西南师范大学出版社，2011.)，判定标准参照美国临床实验室标准协会药敏纸片扩散法标准(2010版)(clsi(clinicalandlaboratorystandardsinstitute).methodsforantimicrobialdilutionanddisksusceptibilitytestingofinfrequentlyisolatedorfastidiousbacteria–documentm45-a2.wayne,pa:clinicalandlaboratorystandardsinstitute；2010.)。

(三)、菌株a动物回归试验

将菌株a接种到营养肉汤培养基中，37℃摇振培养12h，菌液经麦氏比浊使菌液含量为1×10⁸.cfu/ml(0.5个麦氏浓度)。试验健康雏鸭10只，随机分为试验组和对照组，每组5只；试验组雏鸭肌肉注射菌液，1ml/只，对照组雏鸭肌肉注射生理盐水，1ml/只，观察1周并记录雏鸭发病及死亡情况。

(四)、四环素耐药菌株诱导试验

将菌株a进行四环素药敏试验，初次可选取四环素药敏纸片抑菌圈边缘的菌再次进行四环素药敏试验，重复多次四环素药敏诱导试验，直至选出四环素抑菌圈直径变成0mm为止的耐药菌株，将此菌株编号为b3，四环素药敏试纸诱导结果见表1和图1。

表1分离菌对四环素药敏试验结果

从表1可以看出，分离菌对四环素呈现高度敏感性，随着四环素的反复、多次作用，分离菌逐渐失去了敏感性，最终产生了耐药性，抑菌圈直径为0mm。时隔半年后，用耐药菌重新做四环素药敏试验，依旧保持耐药性；说明耐药菌株耐药性很难逆转。

二、鉴定

(一)生化试验

取纯化好的分离菌分别接种于不同的肠杆菌科细菌生化鉴定微量反应管，37℃环境条件下培养24-48h，观察记录结果，生化鉴定结果如下：

菌体的形态特性：

分离菌株能够在麦康凯培养基上生长，呈红色的、凸起的、圆滑的、湿润的小菌落。试验表明，分离菌是鸭大肠杆菌。

菌体的生理生化特征见表2：

表2分离菌株生化鉴定结果

注：“+”，阳性；“-”，阴性

由表2生化鉴定结果可知，敏感菌a和耐药菌b3在上述物质的代谢上完全没有差别。

(二)16srdna试验

提取耐药菌b3的总dna，以其为模板，利用细菌16srdna通用引物进行pcr扩增，得到长度约为1.4kb的扩增产物，将扩增产物回收并进行测序，测得的序列如seqidno.1所示。

根据gen-bank序列同源性比较，耐药菌b3与escherichiacolicau2558(genbank:mf428963.1)同源性为99％，初步判定该菌为埃希氏菌属细菌(e.coli)。

基于以上特征，将菌株耐药菌b3鉴定为escherichiacoli。建议的分类命名为大肠杆菌；该菌株已于2017年7月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc9501，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为cgmccno.14456。

实施例2b3菌株动物回归试验

将b3菌株接种于营养肉汤培养基中，37℃摇振培养12h，菌液经麦氏比浊使菌液含量为1×10⁸.cfu/ml(0.5个麦氏浓度)。试验健康雏鸭10只分2组，分别为试验组和对照组，每组5只；试验组雏鸭肌肉注射接种菌液1mll/只，对照组雏鸭肌肉注射生理盐水，1ml/只，观察1周，记录雏鸭发病及死亡情况。

敏感菌a组和耐药菌b3组的试验鸭攻毒24h后都表现为精神沉郁、食欲减退、站立不稳、粪便稀薄，36h后出现死亡，96h后全部死亡。剖检病死雏鸭，可见纤维素性心包炎，肝脏肿大，肝脏表面覆盖一层薄膜状纤维素性渗出物；将肝脏组织接种在麦康凯琼脂培养基上，可见典型的大肠杆菌菌落长出。2个对照组10只雏鸭饮食、精神状态及生长发育均正常，剖检未见病理变化，将肝脏组织接种在麦康凯琼脂培养基上未见菌落生长。

动物回归试验结果表明：试验雏鸭出现典型的大肠杆菌病临床症状及病理变化特征；同时敏感菌、耐药菌都有很强的毒力，其致死率达到100％，说明诱导成功的耐药菌株毒力没有改变。

将临床疑似大肠杆菌病的病理组织通过接种于鉴别培养基、镜检、生化试验能够区分鸭大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌和多杀性巴氏杆菌。只有大肠杆菌才能够在麦康凯培养基上生长，为红色、凸起、圆滑、湿润的小菌落；显微镜下呈红色的小杆状，表明分离菌是大肠杆菌。

已知四环素抗菌作用机理是通过细菌细胞外膜的亲水性孔，由内膜上能量依赖性转移系统进入细胞，与核糖体30s亚基特异性结合，阻止氨基酰rna联结，从而抑制肽链延长和蛋白质合成。此外，也可改变细菌细胞膜通透性，导致细胞内重要成分外漏，迅速抑制dna的复制。目前已知大肠杆菌耐四环素基因分别有teta、tetb、tetc、tetd、tetk、tetl六个基因，又由于敏感菌和耐药菌在形态、生理生化特性、毒力方面均没有改变，所以可以推测耐药菌株的产生的可能的原因之一是细菌产生了主动外排的蛋白质。

实施例3中药对耐四环素b3菌的体外抑制作用

(一)供试中药溶液的制备：取黄芩、大黄、大青叶、板蓝根和连翘共五种中药提取物(每g提取物相当于原生药材10g)各4g，分别放入不同的烧杯中，加蒸馏水20ml，搅拌使溶解，过滤，滤液于西林瓶中减压蒸汽灭菌(115℃；20min)备用。此时药液浓度为2g/ml。

(二)菌液制备：将-20℃下甘油保存菌种b3复苏接种于普通琼脂培养基上，37℃培养24h，挑取典型菌落接种于普通肉汤培养基中，37℃培养18～24h，备用。

(三)牛津杯法中药抑菌试验：将培养后的菌液经麦氏比浊达到0.5个麦氏浓度后，即1.5×10⁸cfu/ml(若超过0.5个麦氏浓度，可用营养肉汤或生理盐水进行稀释)，用灭菌后的棉拭子沾取适量待检菌液，以划线方式将细菌致密涂布到平皿培养基表面。待菌液被琼脂吸收后，以无菌操作用镊子将灭菌的牛津杯(内径为6.0mm±0.1mm，高为10.0mm±0.1mm，外径为7.8mm±0.1mm)轻轻放置在培养基上，轻压牛津杯，使杯底与琼脂之间无缝隙，加入药液240ul于牛津杯中，设置三个重复置，37℃培养24h，观察结果。

中药抑菌实验的结果，应按抑菌圈直径大小作为判定敏感度高低的标准。抑菌圈直径：≧20为高敏，10-19mm为中敏，<10mm为不敏。结果如表3和图2-6。

表3五种中药溶液对b3菌的抑菌圈直径

结果表明，中草药黄芩、连翘和大黄对耐四环素大肠杆菌b3菌抑菌效果均较好，以中药连翘和大黄的抑菌效果最为明显。

(四)中药对耐四环素b3菌的最小抑菌浓度

配制生药1g/ml待测中药水煎液，采用96孔板法测定最小抑菌浓度，在无菌环境下，取菌检后的肉汤100μl分别加入96孔板1-10列分别，第1列加入药液100μl，逐次倍比稀释至第8列(每孔终体积是100μl)，第8列的稀释后多余液体弃掉。在第1-9孔中加入待测菌液10μl，每孔终体积110μl；第9列为阳性对照，第10列为肉汤空白对照，第11列为药物空白对照。保鲜膜覆盖表面，于37℃的培养箱中培养18～24小时后观察，结果如表4。

表4中药水提物对耐四环素大肠杆菌b3的最小抑制浓度

注：“+”为有菌生长，“－”为无菌生长。

本发明表明，中草药黄芩、连翘和大黄对耐四环素大肠杆菌b3菌抑菌效果均较好，以中药连翘和大黄的抑菌效果最为明显；5种中药中连翘对b3菌株的最低抑菌浓度为0.125g/ml，黄芩为0.5g/ml，大黄为0.25g/ml，作为传统的抗菌药物，其毒副作4用小、来源广、价格低廉，较少出现耐药性，对3种致病菌有很强的抑制作用。

现代医学认为，多次、重复应用相同抗生素治疗同一致病菌引起的疾病，容易产生耐药性；导致无论是人医或是兽医临床上，采用抗生素治疗疾病效果甚微，因此寻求新的有效抗菌药物成为目前医学药物研究新热点；中兽医学认为，中草药具有低毒、副作用小、不耐药等优点，而且我国中草药资源丰富、品种齐全、加工方便。因此，研究中草药对耐药细菌的抑菌效果及抑菌机理具有积极的临床意义，本试验所采取的药物纸片法制备耐药菌株为实验室获取耐药菌株提供了更为方便、有效的途径，减轻了临床采集样本的繁琐，且耐药菌株耐药性状稳定，适合试验研究。

如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定成分或方法。本领域技术人员应可理解，不同地区可能会用不同名词来称呼同一个成分。本说明书及权利要求并不以名称的差异来作为区分成分的方式。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本申请的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还存在另外的相同要素。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

序列表

<110>西南大学

<120>一种耐四环素的大肠埃希氏菌及应用

<130>2017

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1370

<212>dna

<213>大肠埃希氏菌(escherichiacoli)

<400>1

gctgacgagtggcggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcctgatggagggggataac60

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