本发明属于新霉素的
技术领域：
，涉及新霉素的制备方法，具体涉及一种提高硫酸新霉素生产质量的方法。本发明方法操作简单，整个工艺过程稳定，放罐后发酵液中各有关物质的含量分别为新霉素b≥80％，新霉素c≤15％。
背景技术：
：新霉素是由弗氏链霉菌(streptomycesfradiae)发酵产生的一种氨基糖苷类抗生素，其主要成分有新霉素a、新霉素b、新霉素c三种。其中以新霉素b为主要有效成分，新霉素c为次要成分，新霉素a为杂质。其中新霉素b和新霉素c二者互为立体异构体，新霉素b的抗菌活性是新霉素c的60倍，新霉素c几乎无抗菌活性，但其毒性却是新霉素b的300倍，因此，新霉素c被列为主要的受控杂质，产品质量中要求其含量越低越好。在新霉素的合成过程中，新霉素c的合成先于新霉素b的合成，新霉素c在neon异构酶的催化反应下发生异构化反应转化为新霉素b，且此步反应不可逆，因此新霉素b合成的最后一步反应就是新霉素c的异构化反应。目前生产新霉素的发酵液中新霉素b的含量一般在70-80％，新霉素c的含量一般在15-20％，其它部分是杂质。欧洲药典中对硫酸新霉素有关物质的含量要求为c组分含量要低于15％，而c组分含量低于3％的硫酸新霉素产品可制备升级为另一种价格更高的药品即硫酸弗拉菌素。因此，为满足欧洲市场高端客户对高质量新霉素的需求，相关生产厂家在这方面也做了很多工作。但目前生产中控制成品中新霉素c含量的方法是通过提取工艺中树脂吸附、解吸等阶段的控制来去除部分新霉素c，但由于新霉素b和新霉素c的结构非常相近，这些工艺同时也会将一部分有效成分新霉素b去除掉，因此成品收率会受到较大影响，且树脂吸附解吸过程中需要对中间体有关物质的含量进行频繁检测，操作繁琐，生产控制难度大，人力资源成本高。技术实现要素：本发明为解决上述问题，通过发酵调控来促进新霉素b的合成，从根本上降低产品中新霉素c含量，即在发酵合成的过程中直接完成降低新霉素c含量，摒弃现有的提取工艺。通过提供一种发酵工艺控制来提高硫酸新霉素生产质量的方法，使得交付到提取车间的发酵液各种有关物质含量符合成品中有关物质含量的要求，从而规避现有提取生产工艺的缺陷和问题，提高产品收率，降低生产成本。本发明为实现其目的采用的技术方案是：一种提高硫酸新霉素生产质量的方法，包括斜面培养、种子培养和发酵培养，在发酵培养的过程中采用流加或一次性顿补的方式加入酵母粉和/或半胱氨酸和/或s-腺苷-l-蛋氨酸和/或硫酸铵和/或硫酸亚铁和/或硫酸镁和/或硫酸锰，流加时机为发酵100h时开始流加，流加速率为每升发酵液流加0.01l/h。在发酵过程中流加或一次性顿补如下组分：按g/100ml水计，包括酵母粉0-20、半胱氨酸0-2、s-腺苷-l-蛋氨酸0-1、硫酸铵0-25、硫酸亚铁0-0.03、硫酸镁0-0.01、硫酸锰0-0.01，其中所有组分含量不同时为0。一种提高硫酸新霉素生产质量的方法，包括以下步骤：a斜面培养：将弗氏链霉菌接种至茄瓶斜面培养基内，在温度28±1℃、湿度20-60％的恒温室培养6-7天，得到成熟的斜面孢子；b制备孢子液：取步骤a中的孢子斜面在无菌室内每瓶加入30-35个无菌玻璃珠，振摇，将孢子打下，然后加入无菌蒸馏水50-55ml，摇匀，放入已灭菌的空三角瓶中，在2-6℃冰箱中保存备用；c种液的制备：将步骤b制得的斜面孢子悬浮液接入装有种子培养基的种子罐，接种量按体积比计为万分之一，然后在35±1℃，罐压为0.02～0.1mpa条件下培养40-46h，得到种子液；d发酵培养：将步骤c制得的种液接种至装有发酵培养基的发酵罐，接种量10-15％，在35±1℃进行发酵培养，罐压0.02～0.1mpa，培养至100h后开始流加或一次性顿补酵母粉和/或半胱氨酸和/或s-腺苷-l-蛋氨酸和/或硫酸铵和/或硫酸亚铁和/或硫酸镁和/或硫酸锰，培养至190-200h放罐。步骤a中，斜面培养基的成分及用量按g/100ml计，包括葡萄糖0.4-0.6、蛋白胨0.1-0.3、牛肉膏0.3-0.5、氯化钠0.04-0.06、琼脂2.3-2.5。步骤c中，种子培养基的成分及用量按g/100ml计，包括蛋白胨0.4-0.6、黄豆粉0.8-1.2、酵母粉1.8-2.2、淀粉0.8-1.2、葡萄糖2.5-3.5、玉米浆0.8-1.2、硫酸铵0.08-0.12、磷酸二氢钾0.08-0.12、碳酸钙0.8-1.2、豆油0.15-0.25。步骤d中，发酵培养基的成分及用量按g/100ml计，包括淀粉6.5-7.5、淀粉酶0.025-0.035、蛋白胨0.35-0.45、花生粉2.6-3.0、酵母粉0.25-0.35、黄豆饼粉0.4-0.6、葡萄糖3.5-4.5、氯化钠0.20-0.30、磷酸二氢钾0.03-0.05、硫酸铵0.5-0.7、轻质碳酸钙0.35-0.45、豆油0.35-0.45。本发明的有益效果是：本发明在发酵过程中补加酵母粉和/或半胱氨酸和/或s-腺苷-l-蛋氨酸和/或硫酸铵和/或硫酸亚铁和/或硫酸镁和/或硫酸锰来控制发酵液中各组分的含量，使得最终放罐发酵液中各有关物质的含量达到硫酸新霉素成品对各有关物质含量的范围要求。本发明通过在发酵过程中补加流加物质的方法，使得目标产物的含量大幅度提高。本发明经过长期的研究，总结发现只有在发酵100h时开始补加流加物质结合在菌体生长期结束后补料的方式才会使得新霉素c的含量大大降低，这个时间之外的补加会被当成底料利用掉，参与菌体的生长代谢或能量代谢，不参与新霉素c向b的转化，或减弱效价的提高。本发明方法使新霉素发酵液各有关物质的含量发生了质的改变，发酵液中各有关物质的含量达到了硫酸新霉素成品中各有关物质的含量要求，可使用常规的提取工艺进行提取，不用截留或去除原来新霉素c含量较高的洗脱液，也可以得到有关物质含量合格的成品，从而大大简化了提取生产工艺，提高了产品收率，降低了生产成本。本发明所使用的几种组分只有在发酵100h时开始流加才可发挥出最大的作用，菌体进入快速产素期，促进发酵和新霉素的合成，此时加入本发明所述组分可快速作用于新霉素合成途径的酶系，快速实现新霉素c向新霉素b的合成，若提前加入会导致菌丝生长受到影响，降低效价，延后加入会降低营养剂的作用效果，新霉素c向新霉素b的转化率会降低，达不到作用效果；经长期的研究本发明基础料培养基具备种子生长良好的营养条件，如果直接加入到培养基中会使前期培养基成分发生改变，不利于发酵前期种子的快速生长，会对前期种子的生长代谢产生不利影响，从而导致发酵效价比较低，因此必须采用流加，不能是在培养基中加入，否则无法实现效价的提高。本发明控制的流加速率具有较高的设备可操作性，且流加的方式可逐渐驯化菌体对营养剂的适应性，降低一次性顿补对发酵液造成波动的影响。流加速率过高会影响菌体代谢，过小会降低转化率，达不到作用效果。组分的用量和配比间存在一定的关系，本发明控制的组分配比、用量配制较容易，且在流加时与设备匹配度较高，可有效的控制补入的体积，降低误差。本发明经过长期的创造性研究，总结出：必须严格把控流加物质的用量比例，用量比例改变都会影响发酵液效价、新霉素b和c的含量，用量多一是会造成营养物质饱和效价不会再提高，二是会造成抑制、阻遏作用，发酵液效价不仅不会提高反而会下降，这是经过长期的创造性研究发现总结的，并非一朝一夕的理论实验得到的；用量少，发酵液效价无法提高或者提高幅度很小，因而严格控制用量比例至关重要。具体实施方式本发明提供的方法不仅提高了发酵水平，提高了硫酸新霉素的生产质量，并且补料成分简单，价格低廉，发酵结束时检测营养物质基本被耗尽，同时缓解了对数期速效营养不足的矛盾，有利于生物量的提高，降低生产能耗和生产成本，与不补料相比硫酸新霉素产量有较大幅度的提高，新霉素c的含量大幅下降。下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例1：(1)培养基准备：①斜面培养基配方(g/100ml)：葡萄糖0.5、蛋白胨0.2、牛肉膏0.4、氯化钠0.05、琼脂2.4；斜面培养基的配置：按上述比例，称量适量于烧杯中，使用饮用水配制，调前ph在6.50-6.70之间，用20％的naoh将消前ph控制7.45-7.55之间，分装于250ml带有琼脂的茄子瓶中，每瓶50ml，塞上棉塞(12g)，包二层纱布。留一不加琼脂的样测定消后样。将制备好的斜面培养基按121±1℃，0.11±0.01mpa保压30分钟湿热灭菌。斜面灭菌后不要立即铺斜面，待水汽蒸发后，趁热摇匀铺成11-13cm长的斜面，空白斜面在35±1℃恒温室培养3天，斜面表面干燥无水渍，检查无菌后备用。送消后样，进行检测，合格后备用。②种子培养基配方(g/100ml)：蛋白胨0.5、黄豆粉1.0、酵母粉2.0、淀粉1.0、葡萄糖3.0、玉米浆1.0、硫酸铵0.1、磷酸二氢钾0.1、碳酸钙1.0、豆油0.2；按种子罐培养基配比称量所需的原材料，加饮用水至实际配制量，调前ph在5.45-5.65之间，用20％的naoh将消前ph调至7.45-7.55之间，121±1℃，0.11±0.01mpa保压30分钟湿热灭菌，备用。③发酵培养基配方(g/100ml)：淀粉7.0、淀粉酶0.03、蛋白胨0.4、花生粉2.8、酵母粉0.3、黄豆饼粉0.5、葡萄糖4、氯化钠0.25、磷酸二氢钾0.04、硫酸铵0.6、轻质碳酸钙0.4、豆油0.4；按发酵培养基配比称量所需的原材料，加饮用水至实际配制量，调前ph在5.8-5.95之间，用20％的naoh将消前ph调至6.95-7.05之间，121±1℃，0.11±0.01mpa保压30分钟湿热灭菌，备用。(2)斜面培养：准备砂土孢子，所用生产菌株为普通的
背景技术：
介绍的弗氏链霉菌，砂土孢子为生产菌株保藏的细胞库，用消过2遍的无菌针自砂土管挑取砂土孢子0.003-0.005g均匀撒在茄瓶斜面上，反针之字形来回划满整个斜面，反针涂2遍，正针涂1遍，接种完毕，正面朝上放置在28±1℃，相对湿度20％-60％的恒温室中培养6-7天，斜面呈紫色，均匀丰满、无杂菌，孢子生长成熟，得斜面孢子；(3)孢子悬浮液的制备：选择外观生长均匀的二代斜面，在无菌室内每瓶加入30-35个无菌玻璃珠，振摇，将孢子打下，然后每瓶加入无菌蒸馏水50ml，摇匀，根据进罐要求取相应量的孢子悬浮液放入已灭菌的空三角瓶中，塞上棉塞包二层纱布及牛皮纸进行供种，孢子液也可放置在2-6℃冰箱中备用，保存期不超过2天；(4)种子的培养：将制备好的孢子悬浮液接入种子罐培养基，接种量为万分之一(体积比)，培养温度35±1℃，罐压0.02～0.1mpa，培养40-46小时，得到成熟的种子液；(5)流加物质的准备：酵母粉15％、半胱氨酸0％、s-腺苷-l-蛋氨酸0％、硫酸铵0％、硫酸亚铁0％、硫酸镁0％、硫酸锰0％，根据所需要补加的体积(利用流加速率为每升发酵液流加0.01l/h，根据发酵罐体积和运转周期即可算出)按上述配比比例准备，然后用膜过滤设备进行过滤除菌，储备待用；(6)发酵培养：将成熟的种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养，接种量10-15％，在35±1℃进行发酵培养，罐压0.02-0.1mpa，培养至100h时，开始流加步骤(5)的流加物质，流加速率为每升发酵液0.01l/h，培养至200h放罐，发酵液送检。实施例2与实施例1不同之处在于：步骤(5)中，流加物质为：酵母粉0％、半胱氨酸1％、s-腺苷-l-蛋氨酸0％、硫酸铵0％、硫酸亚铁0％、硫酸镁0％、硫酸锰0％。实施例3与实施例1不同之处在于：步骤(5)中，流加物质为：酵母粉0％、半胱氨酸0.5％、s-腺苷-l-蛋氨酸0％、硫酸铵0％、硫酸亚铁0％、硫酸镁0％、硫酸锰0％。实施例4与实施例1不同之处在于：步骤(5)中，流加物质为：酵母粉0％、半胱氨酸0％、s-腺苷-l-蛋氨酸0％、硫酸铵20％、硫酸亚铁0％、硫酸镁0％、硫酸锰0％。实施例5与实施例1不同之处在于：采用一次性顿补的方式，顿补是指将组分一次性全部补入发酵罐的补料方式，一次性补入的总量与连续流加的最终的总量是一致的；步骤(5)中，一次性顿补物质为：酵母粉0％、半胱氨酸0％、s-腺苷-l-蛋氨酸0％、硫酸铵0％、硫酸亚铁0.02％、硫酸镁0％、硫酸锰0％。实施例6与实施例1不同之处在于：步骤(5)中，流加物质为：酵母粉0％、半胱氨酸0％、s-腺苷-l-蛋氨酸0％、硫酸铵0％、硫酸亚铁0％、硫酸镁0.006％、硫酸锰0％。实施例7与实施例1不同之处在于：采用一次性顿补的方式，步骤(5)中，一次性顿补物质为：酵母粉0％、半胱氨酸0％、s-腺苷-l-蛋氨酸0％、硫酸铵0％、硫酸亚铁0％、硫酸镁0％、硫酸锰0.008％。实施例8与实施例1不同之处在于：步骤(5)中，流加物质为：酵母粉15％、半胱氨酸1％、s-腺苷-l-蛋氨酸0％、硫酸铵0％、硫酸亚铁0％、硫酸镁0％、硫酸锰0％。实施例9与实施例1不同之处在于：步骤(5)中，流加物质为：酵母粉0％、半胱氨酸0％、s-腺苷-l-蛋氨酸0.5％、硫酸铵20％、硫酸亚铁0％、硫酸镁0％、硫酸锰0％。实施例10与实施例1不同之处在于：步骤(5)中，流加物质为：酵母粉15％、半胱氨酸0％、s-腺苷-l-蛋氨酸0.5％、硫酸铵0％、硫酸亚铁0％、硫酸镁0％、硫酸锰0％。实施例11与实施例1不同之处在于：步骤(5)中，流加物质为：酵母粉0％、半胱氨酸1％、s-腺苷-l-蛋氨酸0.5％、硫酸铵0％、硫酸亚铁0.02％、硫酸镁0％、硫酸锰0％。实施例12与实施例1不同之处在于：步骤(5)中，流加物质为：酵母粉15％、半胱氨酸1％、s-腺苷-l-蛋氨酸0％、硫酸铵0％、硫酸亚铁0.02％、硫酸镁0％、硫酸锰0％。实施例13与实施例1不同之处在于：步骤(5)中，流加物质为：酵母粉15％、半胱氨酸0％、s-腺苷-l-蛋氨酸0％、硫酸铵20％、硫酸亚铁0.02％、硫酸镁0％、硫酸锰0％。实施例14与实施例1不同之处在于：步骤(5)中，流加物质为：酵母粉0％、半胱氨酸0％、s-腺苷-l-蛋氨酸0.5％、硫酸铵20％、硫酸亚铁0.02％、硫酸镁0％、硫酸锰0％。实施例15与实施例1不同之处在于：步骤(5)中，流加物质为：酵母粉0％、半胱氨酸1％、s-腺苷-l-蛋氨酸0.5％、硫酸铵20％、硫酸亚铁0％、硫酸镁0％、硫酸锰0％。实施例16与实施例1不同之处在于：步骤(5)中，流加物质为：酵母粉15％、半胱氨酸0％、s-腺苷-l-蛋氨酸0％、硫酸铵0％、硫酸亚铁0％、硫酸镁0.006％、硫酸锰0％。实施例17与实施例1不同之处在于：步骤(5)中，流加物质为：酵母粉15％、半胱氨酸0％、s-腺苷-l-蛋氨酸0％、硫酸铵0％、硫酸亚铁0％、硫酸镁0％、硫酸锰0.008％。实施例18与实施例1不同之处在于：步骤(5)中，流加物质为：酵母粉15％、半胱氨酸0％、s-腺苷-l-蛋氨酸0％、硫酸铵20％、硫酸亚铁0.02％、硫酸镁0％、硫酸锰0.008％。实施例19与实施例1不同之处在于：步骤(5)中，流加物质为：酵母粉15％、半胱氨酸1％、s-腺苷-l-蛋氨酸0.5％、硫酸铵20％、硫酸亚铁0.02％、硫酸镁0.006％、硫酸锰0.008％。对比例与实施例1不同之处仅在于不流加任何物质。上述所得发酵液检测结果见表1。表1实验组别放罐效价u/ml新霉素b含量％新霉素c含量％对照组1805370.623.8实施例12304582.112.3实施例22181882.211.6实施例32210182.712.9实施例42191581.313.7实施例52031781.213.4实施例62181381.113.2实施例72000381.013.7实施例82230183.38.9实施例92139184.710.2实施例102261585.48.1实施例112199484.610.4实施例122209185.58.3实施例132281284.910.7实施例142192083.98.1实施例152210586.47.2实施例162211882.911.7实施例172201682.211.2实施例182220784.79.5实施例192189488.33.9从表1可以看出，酵母粉、半胱氨酸、s-腺苷-l-蛋氨酸、硫酸铵、硫酸亚铁对发酵液中新霉素c含量降低的作用比较明显，硫酸镁、硫酸锰作用稍差。而两种或以上的营养物和酶激活剂对新霉素c含量降低的效果更加明显，其中以实施例19的效果最为明显，新霉素c的含量可以降到4％以下，大大提升了发酵液的质量。当前第1页12