植物作为宿主在表达凝血九因子中的应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，特别涉及植物作为宿主在表达凝血九因子中的应用。

背景技术：

人凝血九因子(fix)学名为凝血酶原复合物(prothrombincomplex，pcc)，全名冻干人凝血酶原复合物，俗称九因子，为人体血浆制品，主要用于治疗乙型血友病。fix是非正常血液凝固所必需的非酶血浆蛋白。人类因子fix活性的不足与先天性出血性疾病(称为血友病b)有关。患者是因为缺乏凝血因子(大多数患者缺乏“八因子”，少数患者是缺乏“九因子”或“十一因子”)而流血不止，如得不到及时治疗，发病症状为出血部位疼痛难忍、留下残疾甚至死亡。乙型血友病属x连锁隐性遗传病，约占血友病的10％。凝血因子ix替代疗法是治疗本病的根本措施，常见替代品有新鲜血液、血浆及浓缩凝血因子ix等。对严重患者给予预防替代疗法可以预防自发性出血，还可以延缓慢性关节病恶化。

目前，我国市场上凝血九因子均为从血液中获得，通过两步灭活生产工艺提取凝血九因子。由于血源供应不足，导致凝血九因子产量远远达不到临床的需求量，致使凝血九因子价格快速上涨。由于凝血因子vii、ii等是与ix因子性质很相似的蛋白质，要获得纯的ix因子，还需要从凝血酶元复合物中作再次的分离，需要更为复杂的提纯过程。而且，血浆中潜在的病原体如肝炎和艾滋病毒导致从目前从血浆中来源的凝血九因子存在各种风险。为了消除血浆病原体以及病毒污染的潜在风险，利用基因工程技术生产重组九因子(rfix)可以作为大规模生产一种更安全以及低成本的fix从而取代血浆来源的九因子。

植物作为药物蛋白质的表达和生产系统，已经研究了近三十年。除了低成本和产量高等的优点外，基于植物的表达系统还降低了人和动物病原体从产生蛋白质的过程中传播到人类的风险。此外，植物真核蛋白内膜表达系统和分泌途径类似于哺乳动物细胞。植物表达系统可大量生产大分子量以及多亚基的药物蛋白质，且大大优于原核生物表达系统，比如大肠杆菌表达系统。如需要翻译后修饰的，糖基化的蛋白，以及需要组装的单克隆抗体，其不能用原核系统实现。利用植物生产的药用蛋白作为生物试剂已经商业化，或用作家禽的疫苗添加剂。2012年，美国食品和药物管理局(fda)批准了用于治疗遗传疾病1型戈谢病的蛋白elelyso^tm(taliglucerasealfa)，而这种蛋白是利用胡萝卜生产的。在过去十年中，人们对药物蛋白质的需求急剧增加，所以fda批准用于临床试验的植物药用蛋白质的数量也在不断增加。

植物瞬时表达系统可以大量生产重组蛋白用于临床研究或者应对突发性疾病。2014年，唯一用于有效抵抗埃博拉病毒爆发的抗体治疗药物，zmapptm，就是农杆菌渗透方法在烟草叶片中生产。zmapp的功效和安全性为推动植物制药业的行业开辟了道路。目前，烟草瞬间蛋白表达最常见的宿主植物，并且已经开发了各种载体和农杆菌渗透方法，用于在短时间内进行大规模生产。然而，烟草具有高纤维含量和潜在的有毒化合物，如生物碱尼古丁，显著增加了下游纯化过程中的成本，极大地阻碍了植物外源蛋白药物的进一步发展。与烟叶系统相比，生菜中含有更少的酚类和有毒化合物，因此，将生菜作为宿主在表达人凝血九因子具有重要的现实意义。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供植物作为宿主在表达凝血九因子中的应用。本发明利用生菜作为重组蛋白生产的有效平台，消除了植物生长周期，大大节省了前期培育植物的时间。本发明用生菜系统表达了凝血九因子(fix)，并且在温和的条件下成功分离出有活性的外源蛋白，证明生菜表达平台可以用来生产重组人凝血九因子。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了植物作为宿主在表达凝血九因子中的应用；所述植物选自生菜、烟草、白菜、水稻、玉米、大豆或小麦；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述凝血九因子为人fix。

本发明还提供了一种表达载体，包括凝血九因子的核苷酸序列和双元植物载体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述表达载体中所述凝血九因子包括人fix。

在本发明的一些具体实施方案中，所述表达载体的构建方法包括如下步骤：

步骤1：在凝血九因子的核苷酸序列的5’末端加入xbal限制性酶切位点，在3’末端加入sacl限制性酶切位点；所述凝血九因子为人fix；

步骤2：克隆到载体puc57载体中，获得克隆载体puc57-fix；

步骤3：通过xbal/sacl从步骤2所得的克隆载体中获得基因片段fix，克隆至双元植物载体pcam35s，获得表达载体p35s-fix。

具体的，本发明提供的表达载体的构建方法为：将人fix(genbankaccession号：a22493.1)密码子优化为植物偏好的密码子，由geneart^tmgeneoptimizer^tm(thermofisher)设计并由金斯瑞公司合成。在优化的fix序列5’末端加入xbal限制性酶切位点，在3’末端加入sacl位点，并由金斯瑞公司克隆到puc57载体中，得到克隆载体puc57-fix(图1)。人凝血九因子基因片段fix通过xbal/sacl从puc57-fix中分离，并克隆到双元植物载体pcam35s，分别产生瞬时表达载体p35s-fix(图2)。将植物表达构建体分别通过用multiporator(eppendorf，hamburg，germany)电穿孔转化到根癌土壤杆菌gv3101中。将所得菌株均匀地铺展在含有卡那霉素抗生素(50mg/l)的选择性lb平板上。在黑暗中28℃孵育2d后，挑取单菌落接种到0.5lyeb(酵母提取物肉汤，5g/l蔗糖，5g/l胰蛋白胨，6g/l酵母提取物，0.24g/lmgso4，ph7.2)并补充抗生素液体培养基(50mg/l卡那霉素)。将接种的培养物在振荡器(220rpm)中以25～28℃孵育72h。通过添加yeb培养基测量od600值并调节至3.5～4.5。然后收集培养液，离心(4500转速)10min。将农杆菌细胞重悬在渗透培养基(10mmmes，10mmmgso4)中至o.d.600为0.5。

在本发明中，fixcdna序列(genbank:a22493.1)如seqidno.1所示；fix氨基酸序列如seqidno.2所示；密码子优化后的fixcdna序列如seqidno.3所示。

本发明还提供了所述表达载体在表达凝血九因子中的应用。在本发明的一些具体实施方案中，所述凝血九因子为人fix。

本发明还提供了一种植物作为宿主表达凝血九因子的方法，将所述的表达载体转化到农杆菌中，通过农杆菌介导真空渗透入植物组织后，提取、分离蛋白质，获得人凝血九因子。

在本发明的一些具体实施方案中，所述方法中所述凝血九因子为人fix。

在本发明的一些具体实施方案中，所述农杆菌介导真空渗透包括如下步骤：

步骤1：抽真空25～45s；

步骤2：保持真空(-95kpa)压力30～60s；

步骤3：释放压力使得渗透液渗入所述植物组织；

重复上述步骤2～3次，避光处理4d。

在本发明的一些具体实施方案中，所述农杆菌为根癌土壤杆菌gv3101。

具体的，农杆菌介导真空渗透的方法为：将制备好的农杆菌培养悬浮液置于2l烧杯，并置于干燥器中。将本实验室保存的生菜倒置(核心向上)并轻轻地旋转于细菌悬浮液中，将干燥器密封。将真空泵(welchvacuum，niles，il，usa)打开以抽空，并且可见渗透液在叶片组织中。保持压力状态30～60s。快速打开该系统以释放压力，使渗透液渗入组织内的空间。该过程重复2～3次，直到清晰可见渗透液在生菜组织中扩散明显。然后将生菜组织从渗透液中轻轻取出，并用蒸馏水连续冲洗三次，然后转移到塑料膜覆盖的容器中。将处理的样品在黑暗中保持4d。

渗透后，绝大多数生菜组织在真空浸润过程中淹没，除了坚固的中肋区域外，其余部分均在真空渗透4天后显示淡黄褐色区域。为了增加浸入叶组织的土壤农杆菌的数量，使用剪刀将10％的生菜从头切掉使得生菜叶组织尽可能的浸润在渗透液中，和释放。与更长的真空暴露时间相比，该方法减少了叶片组织坏死。

在本发明的一些具体实施方案中，提取、分离蛋白质具体为：

经农杆菌真空渗透的生菜样品用搅拌器搅拌，并用体积比为1:1比例的提取缓冲液(100mmkpi，ph7.8；5mmedta；10mmβ-巯基乙醇)搅拌机中高速匀浆1～2min。将匀浆物调节至ph为8.0，用纱布过滤，过滤物在4℃以10,000g离心15min以除去细胞碎片。收集上清液，与硫酸铵(50％)混合，并在冰上摇动孵育60min。通过离心机(10,000g)在4℃下再次分离15min。将得到的上清液进行第二轮硫酸铵(70％)沉淀，冰上摇动悬浮60min，再次在4℃下以10,000g离心15min。然后，弃去上清液，将处理样品沉淀蛋白质溶于5ml缓冲液(20mmkpi，ph7.8；2mmedta；10mβ-巯基乙醇)中并在4℃下储存。

收集从农杆菌真空渗透生菜提取的纯化蛋白质，取样品(5ul)热变性(95℃)加载缓冲液(biorad，hercules，ca，usa)在4～12％plussds-凝胶(thermofisherscientific，waltham，ma，usa)跑电泳，然后用考马斯蓝g250(biorad)染色后再次对凝胶进行拍照。对于重组fix的westernblot蛋白印迹杂交，10ul的重组样品以及人fix标准品(biovision)分别在10～20％plus聚丙烯酰胺凝胶上分离，并将其电泳转移到聚偏二氟乙烯(pvdf)膜上，用抗fix的抗体(abcam)分别进行免疫反应，稀释1：10000和辣根过氧化物酶(hrp)标记的山羊抗兔igg(beyotime)，稀释度分别为1:20000，并使用eclplus(amershambiosciences)显现，对显示图像进行拍照。

植物来源的重组蛋白质的下游加工通常难于并且昂贵，因为纤维素细胞壁难以裂解以及次级植物代谢产物。本发明用搅拌机搅拌匀浆，大大节省匀浆成本以及工艺。重组fix经过sds-page分离我们在泳道中观察到估计分子量大约为46kda的条带(图3a，泳道1)，在隐形对照泳道中没有明显的对应条带(图3a，泳道2)。基于bradford测定法和光密度测定对照组测定纯化样品的蛋白含量0.48mg/kg。另外，western印迹分析也检测到大约46kda的条带(图3b，泳道1)，观察到的蛋白分子量(46kda)与预测的蛋白分子量一致。

在新鲜血浆中加入人凝血九因子5ug。5分钟后检查血浆凝固情况。检查血浆结果表明，没有任何处理的血浆没有任何凝血反应。相比之下，使用纯化的重组fix或相等的阳性对照fix标准处理的凝血良好(图4)。这些结果表明，通过生菜系统瞬间表达的外源fix具有生物学活性，生菜系统可能是生物活性重组药物蛋白质批量生产的合适的生物反应器。

用于真空农杆菌渗透的烟草植物的生长时间通常为4至6周。本发明利用生菜作为重组蛋白生产的有效平台，消除了植物生长周期，大大节省了前期培育植物的时间。本发明用生菜系统表达了fix，并且在温和的条件下成功分离出有活性的外源蛋白，证明生菜表达平台可以用来生产人凝血九因子。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1(a)示fix克隆载体(金斯瑞公司构建合成)；

图1(b)示fix基因片段酶切(xbai/saci)鉴定；

图2示植物瞬时表达载体p35s-fix构建流程；利用限制性内切酶(xbai/saci)双酶切，从图1克隆载体分别切下fix片段，连接入pcam35s的xbai/saci位点，生成植物瞬时表达载体p35s-fix；

其中，35s，具有烟草花叶病毒(tmv)5‘utr的camv35s启动子；nptii，用于卡那霉素抗性的编码nptii基因的表达；nos3’，终止子；

图3(a)示利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)检测纯化的重组人经生长因子(fix)；泳道1:纯化重组fix(5μg)；泳道2：非真空渗透叶片洗脱液阴性对照；

图3(b)示western印记杂交检测纯化的重组人凝血九因子；泳道1:纯化重组fix(5μg)；泳道2：非真空渗透叶片洗脱液阴性对照；

图4示凝血九因子显著促进凝血实验；使用纯化的fix处理血浆，观察血浆凝固反应；5分钟后，重组人凝血九因子明显促进血浆凝血。

具体实施方式

本发明公开了植物作为宿主在表达凝血九因子中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明研究表明，生菜系统可以是有效的表达平台，为快速，瞬时表达重组蛋白质提供了方法。真空农杆菌渗透方法简单，快速，减少叶片坏死，而且可以提高重组蛋白产量。生菜可以通过承受真空压力而增加蛋白质产量，并允许每片叶子更完整的渗透。由于生菜易于生长并且可商业上大量生产，因此比其他瞬时表达植物，如烟草等更容易获得并且更便宜。并且由于不需要特殊设备或液氮，成本效益更高。本发明证明该方法可以用于短时间内大规模生产fix重组蛋白质。

本发明提供了植物尤其是生菜作为宿主在表达凝血九因子中的应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1植物瞬时表达载体的构建

为了提供外援蛋白在植物中的高效表达，本发明将人fix(genbankaccession号：a22493.1)密码子优化为植物偏好的密码子，由geneart^tmgeneoptimizer^tm(thermofisher)设计并由金斯瑞公司合成。在优化的fix序列5’末端加入xbal限制性酶切位点，在3’末端加入sacl位点，并由金斯瑞公司克隆到puc57载体中得到克隆载体puc57-fix(图1)。人凝血九因子基因片段fix通过xbal/sacl从puc57-fix中分离，并克隆到双元植物载体pcam35s，分别产生瞬时表达载体p35s-fix(图2)。将植物表达构建体分别通过用multiporator(eppendorf，hamburg，germany)电穿孔转化到根癌土壤杆菌gv3101中。将所得菌株均匀地铺展在含有卡那霉素抗生素(50mg/l)的选择性lb平板上。在黑暗中28℃孵育2d后，挑取单菌落接种到0.5lyeb(酵母提取物肉汤，5g/l蔗糖，5g/l胰蛋白胨，6g/l酵母提取物，0.24g/lmgso4，ph7.2)并补充抗生素液体培养基(50mg/l卡那霉素)。将接种的培养物在振荡器(220rpm)中以25～28℃孵育72h。通过添加yeb培养基测量od600值并调节至3.5～4.5。然后收集培养液，离心(4500转速)10min。将农杆菌细胞重悬在渗透培养基(10mmmes，10mmmgso4)中至o.d.600为0.5。

实施例2农杆菌介导的真空渗透

本发明优化了农杆菌真空渗透的方法。将制备好的农杆菌培养悬浮液置于2l烧杯，并置于干燥器中。将本实验室保存的生菜倒置(核心向上)并轻轻地旋转于细菌悬浮液中，将干燥器密封。将真空泵(welchvacuum，niles，il，usa)打开以抽空，并且可见渗透液在叶片组织中。保持压力状态30～60s。快速打开该系统以释放压力，使渗透液渗入组织内的空间。该过程重复2～3次，直到清晰可见渗透液在生菜组织中扩散明显。然后将生菜组织从渗透液中轻轻取出，并用蒸馏水连续冲洗三次，然后转移到塑料膜覆盖的容器中。将处理的样品在黑暗中保持4d。

渗透后，绝大多数生菜组织在真空浸润过程中淹没，除了坚固的中肋区域外，其余部分均在真空渗透4天后显示淡黄褐色区域。为了增加浸入叶组织的土壤农杆菌的数量，使用剪刀将10％的生菜从头切掉使得生菜叶组织尽可能的浸润在渗透液中，和释放。与更长的真空暴露时间相比，该方法减少了叶片组织坏死。

实施例3蛋白质提取和分离

经农杆菌真空渗透的生菜样品用搅拌器搅拌，并用体积比为1:1比例的提取缓冲液(100mmkpi，ph7.8；5mmedta；10mmβ-巯基乙醇)搅拌机中高速匀浆1～2min。将匀浆物调节至ph为8.0，用纱布过滤，过滤物在4℃以10,000g离心15min以除去细胞碎片。收集上清液，与硫酸铵(50％)混合，并在冰上摇动孵育60分钟。通过离心机(10,000g)在4℃下再次分离15min。将得到的上清液进行第二轮硫酸铵(70％)沉淀，冰上摇动悬浮60min，再次在4℃下以10,000g离心15min。然后，弃去上清液，将处理样品沉淀蛋白质溶于5ml缓冲液(20mmkpi，ph7.8；2mmedta；10mmβ-巯基乙醇)中并在4℃下储存。

实施例4sds-page凝胶电泳以及westernblot蛋白印迹杂交

收集从农杆菌真空渗透生菜提取的纯化蛋白质，取样品(5ul)热变性(95℃)加载缓冲液(biorad，hercules，ca，usa)在4～12％plussds-凝胶(thermofisherscientific，waltham，ma，usa)跑电泳，然后用考马斯蓝g250(biorad)染色后再次对凝胶进行拍照。对于重组fix的westernblot蛋白印迹杂交，10ul的重组样品以及hfix和标准品(biovision)分别在10～20％plus聚丙烯酰胺凝胶上分离，并将其电泳转移到聚偏二氟乙烯(pvdf)膜上，用抗hfix的抗体(abcam)分别进行免疫反应，稀释1：10000和辣根过氧化物酶(hrp)标记的山羊抗兔igg(beyotime)，稀释度分别为1:20000，并使用eclplus(amershambiosciences)显现，对显示图像进行拍照。

植物来源的重组蛋白质的下游加工通常难于并且昂贵，因为纤维素细胞壁难以裂解以及次级植物代谢产物。我们用搅拌机搅拌匀浆，大大节省匀浆成本以及工艺。重组fix经过sds-page分离我们在泳道中观察到估计分子量大约为46kda的条带(图3a，泳道1)，在隐形对照泳道中没有明显的对应条带(图3a，泳道2)。基于bradford测定法和光密度测定对照组测定纯化样品的蛋白含量为0.48mg/kg。另外，western印迹分析也检测到大约46kda的条带(图3b，泳道1)，观察到的蛋白分子量(46kda)与预测的蛋白分子量一致。

实施例5凝血九因子凝血实验

在新鲜血浆中加入人凝血九因子5ug。5分钟后检查血浆凝固情况。检查血浆结果表明，没有任何处理的血浆没有任何凝血反应。相比之下，使用纯化的重组fix或相等的阳性对照fix标准处理的凝血良好(图4)。这些结果表明，通过生菜系统瞬间表达的外源fix具有生物学活性，生菜系统可能是生物活性重组药物蛋白质批量生产的合适的生物反应器。

实施例6

对照组：利用烟叶生产人凝血九因子；

实验组：本发明提供的生菜生产人凝血九因子；

表1人凝血九因子

^*示与对照组相比p≤0.05；^#示与对照组相比p≤0.01；

由表1可知，与对照组的烟叶系统相比，生菜瞬时表达人凝血九因子(fix)显著(p≤0.05)缩短了生产周期，显著(p≤0.05)提高了蛋白含量，显著(p≤0.05)提高了蛋白活性，简化了蛋白纯化的难易程度，极显著(p≤0.01)降低了生产成本。

综合上述试验结果表明，植物系统尤其是生菜系统是更加经济、高效的表达平台。能够快速瞬时表达重组蛋白质，可以在短时间内大规模生产人凝血九因子。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>北京惠升生物工程科技有限公司

<120>植物作为宿主在表达凝血九因子中的应用

<130>mp1721455

<160>3

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<212>dna

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