一种检测人类细小病毒B19的RCA方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种检测人类细小病毒b19的rca方法。

背景技术：

人类细小病毒b19(humanparvovirusb19,hpvb19)属于细小病毒科红病毒属，是儿科常见的出疹性疾病—传染性红斑(又称第五病)的病因；b19感染成年人，可引起关节炎或关节痛；对免疫能力正常者，b19的感染多是自限性的；但对孕妇、免疫力低下者，b19的危害较大，感染孕妇可造成胎儿水肿及胎儿先天性贫血，甚至死胎；对免疫力低下者会导致慢性贫血，短暂的再生障碍性危象等严重疾病。b19还可能与系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎等多种自身免疫性疾病相关。人细小病毒b19感染也是先天性心脏病的重要病因之一。b19病毒对胎儿心肌细胞有亲嗜性，胎儿发生b19病毒感染可致心肌肿胀变性。b19病毒感染呈世界范围分布，一年四季均可发生,以冬春季为高峰。

针对b19的检查方法有很多，包括电镜观察，酶联免疫吸附试验以及红血球凝集法等，但是目前针对b19的检测方法主要还是血清学检测和pcr检测，分别针对血清中存在抗体和病原核酸进行检测。

血清学检测的特异性和灵敏性不高，常常造成假阳性结果；pcr方法灵敏度高、特异性强，但反应条件要求高，并且也存在一定的假阳性反应。滚环扩增(rollingcircleamplification,rca)是一种恒温线性扩增技术，以其快速简易、灵敏度高和特异性强等优点受到广泛关注。锁式探针由5’端模板结合区、中间连接序列区和3’端模板结合区组成。当5’端和3’端与靶序列完全互补时，探针两段在dna连接酶的作用下形成磷酸二酯键被连接成环，为rca扩增提供环形模板，环化后的探针就可通过引物进行滚环复制和支链扩增。反之，若靶序列上存在变异或没有所要检测的目的基因，探针无法被连接成环状，复制也就无法进行。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于提供一种检测人类细小病毒b19的rca方法，该检测方法操作简单、检测时间周期短、高特异性和灵敏性，通过滚环复制法，能够检测出人类细小病毒b19。

本发明的技术方案如下：一种检测人类细小病毒b19的rca方法，按照如下步骤完成：

(1)将待测标本按qiagen公司的病毒dna提取试剂盒步骤处理，获得样本的dna；

(2)捕获探针的杂交：在32μl杂交缓冲液中依次加入6μldna样品、1μmol/l的锁式探针1μl、捕获探针1μl，充分混匀，55℃水浴杂交1h，缓慢冷却至室温，加入40μl链霉亲和素包被的磁珠(溶于2×结合缓冲液中)，混匀，室温放置20min，磁性分离。用1×结合缓冲液清洗磁珠2次，弃去洗液。

(3)锁式探针的环化连接与酶切：去离子水16μl、步骤(2)制得的杂交产物和10×e.colibuffer2μl，混匀，95℃5min，45℃孵育40min后，加入10×bsa缓冲液2μl和0.2μle.colidna连接酶，混匀，37℃进行环化连接反应40min；再加入10×exonucleaseⅰbuffer2μl和exonucleaseⅰ核酸外切酶2μl，混匀，37℃反应1h，最后在95℃条件下灭活exonucleaseⅰ核酸外切酶；

(4)rca扩增：取步骤(3)中值得的探针环化连接产物42μl、加入100μmol/l引物1μl和10×phi29buffer5μl，95℃5min，冰浴1min；加入phi29dna聚合酶1μl、dntp液1μl，混匀后37℃进行rca反应2h；

(5)取步骤(4)制得的扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像仪观察电泳结果；

所述步骤(2)(4)中所设计用于rca反应的引物是：

引物5’-gacagttatctgaccaccttatcatagag-3’seqno1；

探针是：

锁式探针

5’-gctaacttgcccaggcttgtgtaagtcttcactagataatgtctgtatctgctaaccaagagcaactacacgaattctcgattaggttagcacaagcgggaagacaaccacagacaccgtcc-3’，探针的5’端进行磷酸化修饰seqno2；

捕获探针

biotin-gacagttatctgaccaccagtagcagtcatgcagaacctagaggagaseqno3。

采用上述技术方案，本发明通过锁式探针特异识别靶基因序列，rca扩增放大检测信号，是一种检测人类细小病毒b19的新方法。该方法不需特殊设备、操作简单、特异性好、灵敏度高，在病毒检测方面具有独特优势。

rca扩增反应的最低检测浓度：

用本发明的方法检测终浓度分别为5pm、50pm、500pm和5nm的模板，rca扩增产物电泳结果如图1所示。结果显示，rca在模板终浓度5pmol/l以下均未见扩增产物，模板终浓度50pmol/l以上均可见明亮条带，表明rca的最低检测浓度为50pmol/l。结果提示，循环rca能较好满足低病毒载量标本的检测。

有益效果：本发明锁式探针结合rca技术是一种检测人类细小病毒b19的新方法，通过锁式探针特异识别靶基因序列，rca扩增放大检测信号。该方法不需特殊设备、操作简单、特异性好、灵敏度高，在低病毒载量检测方面具有独特优势。

附图说明

图1rca检测不同浓度的模板电泳结果(第1,2,3,4,5泳道分别代表marker、终浓度为5nm，500pm，50pm，5pm模板组rca产物电泳结果)

图2样本进行rca检测的电泳结果(1泳道为marker,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14为第1至13号标本rca产物组电泳结果)

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明：

实施例1

一种检测人类细小病毒b19的rca方法，按照如下步骤完成：

(1)将待测标本按qiagen公司的病毒dna提取试剂盒步骤处理，获得样本的dna；

(2)捕获探针的杂交：在32μl杂交缓冲液中依次加入6μldna样品、1μmol/l的锁式探针1μl、捕获探针1μl，充分混匀，55℃水浴杂交1h，缓慢冷却至室温，加入40μ链霉亲和素包被的磁珠(溶于2×结合缓冲液中)，混匀，室温放置20min，磁性分离。用1×结合缓冲液清洗磁珠2次，弃去洗液。

(3)锁式探针的环化连接与酶切：去离子水16μl、步骤(2)制得的杂交产物和10×e.colibuffer2μl，混匀，95℃5min，45℃孵育40min后，加入10×bsa缓冲液2μl和0.2μle.colidna连接酶，混匀，37℃进行环化连接反应40min；再加入10×exonucleaseⅰbuffer2μl和exonucleaseⅰ核酸外切酶2μl，混匀，37℃反应1h，最后在95℃条件下灭活exonucleaseⅰ核酸外切酶；

(4)rca扩增：取步骤(3)中值得的探针环化连接产物42μl、加入100μmol/l引物1μl和10×phi29buffer5μl，95℃5min，冰浴1min；加入phi29dna聚合酶1μl、dntp液1μl，混匀后37℃进行rca反应2h；

(5)取步骤(4)制得的扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像仪观察电泳结果；

所述步骤(2)(4)中所设计用于rca反应的引物是：

引物5’-gacagttatctgaccaccttatcatagag-3’seqno1；

探针是：

锁式探针

5’-gctaacttgcccaggcttgtgtaagtcttcactagataatgtctgtatctgctaaccaagagcaactacacgaattctcgattaggttagcacaagcgggaagacaaccacagacaccgtcc-3’探针的5’端进行磷酸化修饰seqno2。

捕获探针

biotin-gacagttatctgaccaccagtagcagtcatgcagaacctagaggagaseqno3。

通过实施例1的检查方法对13例临床标本进行检测：

rca产物检测：

通过实施例1的检查方法对13例标本提取dna，然后将dna进行rca检测，结果显示8例为阳性，5例为阴性。

人类细小病毒b19的阳性检测结果与常规pcr方法完全一致，说明检测的结果是满意的。