水稻稻瘟病广谱抗性基因Bsr‑d1的功能特异性分子标记的制作方法

一、技术领域

本发明涉及水稻稻瘟病广谱抗性基因bsr-d1的功能特异性分子标记，属于生物技术工程领域，专用于水稻稻瘟病广谱抗性基因bsr-d1的基因型鉴定。

二、

背景技术：

水稻是我国最重要的粮食作物，全国有一半以上的人口以稻米为主食。影响水稻生产安全的因素很多，其中病害问题是制约水稻生产的重要障碍之一。据统计，危害水稻的侵染性病害有300多种，有些分布于全世界，有些局限于部分地区。在我国，常年发生的水稻病害有29种(雷财林等，生物学通报，2004，39(11):4-7)。其中，由稻瘟病菌(magnaportheoryzae；无性态，pyriculariaoryzae)引起的稻瘟病是水稻上最具毁灭性的病害之一，俗称水稻的“癌症”(oushricediseases,2ndednuk:cabinternational,1985，109-201)。稻瘟病在全球85个有水稻种植的国家和地区均有发生。据统计，在1975～1990年的16年间，由稻瘟病引起的全球水稻产量损失高达1.57亿t(bakerb，etal.，science，1997，276：726-733)。我国每隔7～10年就发生一次较大规模的稻瘟病危害，受害面积达300～600万hm2，稻谷损失70～125万t(shenmg，etal.riceblastdisease.uk：intriceresinst，1994：321-331.)稻瘟病的防治途径主要是化学防治和种植抗病品种，长期实践证明，选育和推广抗病品种是防治稻瘟病最经济、有效和安全的方法。但由于稻瘟病菌具有高度的变异性，普通抗病品种种植3～5年后抗性就会逐渐丧失。因此，选择抗谱广、抗性持久的抗病基因作为抗源来选育新品种，已经成为抗病育种的最经济有效的策略之一。

传统的水稻稻瘟病抗病育种主要依赖于抗性表型的鉴定，不仅周期长且极易受环境条件和人为因素的影响，从而降低了目标基因的选择效率。另外，由于受可鉴别不同基因的鉴别菌系的限制，单纯地依赖表型鉴定很难实现多个抗性基因的聚合。分子标记辅助选择是利用与目标基因紧密连锁或共分离的分子标记来选择基因型，可以在水稻全生育期甚至种子鉴定目标基因及其纯合性，且不受环境影响，因而大大提高了选择的效率和准确性。开发与稻瘟病抗性基因紧密连锁的分子标记，特别是根据抗性基因本身引起抗性变异的dna序列差异开发出的基因功能标记进行分子标记进行辅助选择，不仅可以大大提高抗源筛选、抗性基因鉴定及育种选择效率，而且使得通过基因聚合手段培育持久、广谱抗病良种成为可能。

自20世纪60年代日本系统开展抗稻瘟病基因的遗传研究以来，国内外研究者已经从不同抗病品种中鉴定出80多个稻瘟病抗性基因，pi-b、pi-ta、pi-d2、pi9等30多个抗稻瘟病基因已经被克隆(杨勤忠等，中国农业科学，2009，42(5)：1601-1615)。li(cell,2017,170:114-126)等利用广谱高抗水稻地谷与基因组已经测序的66份非广谱抗病水稻进行gwas(全基因组关联)分析，并应用高抗水稻地谷与高感材料丽江新团黑谷为亲本构建的重组自交系(抗病性经多年田间自然诱发和苗期接种鉴定)进行共相关分析，发现了编码c2h2类转录因子的基因bsr-d1的启动子自然变异后对稻瘟病具有广谱持久的抗病性，进一步分析发现在地谷中，bsr-d1基因的启动子区域因一个关键碱基变异，导致上游myb转录因子对bsr-d1的启动子结合增强，从而抑制bsr-d1响应稻瘟病菌诱导的表达，并导致bsr-d1直接调控的h2o2降解酶基因表达下调，使h2o2降解减弱，细胞内h2o2富集，提高了水稻的免疫反应和抗病性。该等位变异在提高抗病性的同时，对产量性状和稻米品质没有明显影响，因而具有十分重要的应用价值。

因此，根据bsr-d1基因的启动子区域关键变异碱基设计得到与目标基因共分离的pcr分子标记来快捷、准确鉴定bsr-d1基因的不同基因型，将有利于广谱抗稻瘟病水稻新品种的选育，从而提高稻瘟病抗性育种的技术水平。

三、

技术实现要素：

技术问题：本发明针对水稻稻瘟病抗性改良选育过程抗性表型鉴定极易受环境和人为因素影响，从而降低目标基因选择料率的技术难题，根据稻瘟病广谱抗性基因bsr-d1功能区域存在的单碱基差异，设计、合成与目的基因共分离的功能标记，并通过简单的检测方法，快速鉴定含广谱抗性基因bsr-d1的水稻种质资源，同时还能进一步应用于分子标记辅助育种。

技术方案：

水稻稻瘟病广谱抗性基因bsr-d1的功能特异性分子标记，其特征在于：该分子标记包括2对特异扩增水稻稻瘟病广谱抗性基因bsr-d1及其感病等位基因bsr-d1的pcr分子标记引物，其中

bsr-d1和bsr-d1正向共用引物bsr-d1-f序列为5'-agtctagcatccaccgttccac-3'

bsr-d1反向引物3bsr-d1-r序列为5'-cttttcgcttatacttatatttatcaac-3'

bsr-d1反向引物3bsr-d1-r序列为5'-cttttcgcttatacttatatttatcaat-3'。

所述功能特异性分子标记在检测水稻稻瘟病广谱抗性基因bsr-d1中的应用。其特征在于，用所述2对特异扩增水稻稻瘟病广谱抗性基因bsr-d1及其感病等位基因bsr-d1的pcr分子标记引物：bsr-d1和bsr-d1正向共用引物bsr-d1-f，bsr-d1反向引物3bsr-d1-r和bsr-d1反向引物3bsr-d1-r共同扩增水稻基因组dna，如用3bsr-d1引物对能扩增出241bp的特异条带，而用3bsr-d1引物对不能扩增出241bp特异条带，则该水稻品种含bsr-d1基因的纯合体；如用3bsr-d1引物对不能扩增出241bp的特异条带，而用3bsr-d1引物对扩增出241bp特异条带，则该品种含有bsr-d1基因的纯合体；如用3bsr-d1引物对和3bsr-d1引物对同时都能够扩增出241bp特异条带，则该品种为bsr-d1的杂合体。

分子标记的扩增和电泳检测包括：

20μlpcr反应体系包括：10×pcrbuffer(mg²⁺)2.0ml，10mmol/l的dntp0.5μl，5u/μl的taq酶0.2μl，10pmol/l的正向引物1.0μl，10pmol/l的反向引物1.0μl，dna2.0μl，ddh2o13.3μl；

pcr反应条件包括：94℃预变性5min,然后94℃变性1min、58℃退火1min、72℃延伸1.5min,32个循环,最后72℃延伸10min,10℃冷却10min后，将扩增产物加上样缓冲液终止反应；

反应结束后扩增产物加入指示剂，将扩增产物在1.5％琼脂糖上进行电泳，dured染色，紫外凝胶成相系统保存图像。

有益效果：

本发明提供的水稻稻瘟病广谱抗性基因bsr-d1的功能特异性分子标记，具有以下优点：

(1)本发明提供的分子标记是根据基因的功能区域差异设计的基于pcr扩增和限制性内切酶的功能性标记，其基因型能直接反映植株的表型，不仅不存在由于遗传交换而造成的错误鉴定，而且在操作上准确、高效、快捷。

(2)本发明提供的分子标记方法能实现对水稻基因资源的快速鉴定，能从大量水稻资源中准确筛选出含有稻瘟病广谱抗性基因bsr-d1的品种，这些具有抗性基因的水稻品种在育种中可以作为优异亲本应用于水稻稻瘟病抗性改良育种中。

(3)本发明提供的分子标记方法能广泛用于水稻稻瘟病抗性改良的辅助育种。可以有效地对分离群体中稻瘟病广谱抗性基因bsr-d1进行基因型选择，并且能够区分杂合基因型和纯合基因型，大大提高育种工作的预见性。

因此，本发明提供的分子标记方法，对于加速水稻稻瘟病广谱抗性基因bsr-d1在水稻育种中的应用具有重要意义。

四、附图说明

图1水稻稻瘟病广谱抗性基因bsr-d1功能特异性分子标记的设计策略

(阴影部分表示引物所在位置，方框部分为单碱基差异位点)

图2bsr-d1基因功能特异性分子标记的梯度pcr扩增产物在1.5％的琼脂糖胶电泳结果(m：dna分子标记，由上到下依次为2kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp；a：1bsr-d1-r引物对梯度pcr扩增产物；b：1bsr-d1-r引物对梯度pcr扩增产物；c：2bsr-d1-r引物对梯度pcr扩增产物；d：2bsr-d1-r引物对梯度pcr扩增产物；e：3bsr-d1-r引物对梯度pcr扩增产物；f：3bsr-d1-r引物对梯度pcr扩增产物；1-12为地谷的不同引物对在退火温度分别为45.1℃、45.3℃、45.9℃、46.8℃、47.9℃、49.1℃、50.4℃、51.7℃、52.8℃、53.8℃、54.5℃、54.8℃扩增产物；13-24为nipponbare的不同引物对在退火温度分别为45.1℃、45.3℃、45.9℃、46.8℃、47.9℃、49.1℃、50.4℃、51.7℃、52.8℃、53.8℃、54.5℃、54.8℃扩增产物)

图3bsr-d1基因功能特异性分子标记3bsr-d1和3bsr-d扩增产物在1.5％的琼脂糖胶电泳结果(m：dna分子标记由上到下依次为2kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp；1-6：地谷、nipponbare、南粳9108、广陆矮4号、武育粳3号、南粳45；m左侧为3bsr-d1的pcr扩增产物；m右侧为3bsr-d1的pcr扩增产物)

图4部分水稻品种bsr-d1基因位点功能区的序列比对结果

图5bsr-d1基因功能特异性分子标记3bsr-d1和3bsr-d对部分水稻品种的分子检测结果(a：3bsr-d1检测结果；b：3bsr-d1检测结果；m：dna分子标记，由上到下依次为2kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp；1-24：地谷、nipponbare；南京1号；绵恢501；浙恢7954；盐恢559；镇恢084；bg90-2；圭630；明恢63；青四矮16b；辐恢718；扬稻6号；冈46b；陆财号；明恢78；irbb21；蜀恢527；多恢1号；桂朝2号；绵恢725；乐恢188；广恢128；珍汕97b)

五、具体实施方式

为充分公开本发明水稻稻瘟病广谱抗性基因bsr-d1的功能特异性分子标记，以下结合方法验证和实施实例加以说明。其具体实施步骤如下：

(一)试验材料

均为水稻生产推广品种地谷(福建)、nipponbare(日本)、南粳9108(江苏)、广陆矮4号(广东)、武育粳3号(江苏)、南粳45(江苏)、南京1号(江苏)、绵恢501(四川)、浙恢7954(浙江)、盐恢559(江苏)、镇恢084(江苏)、bg90-2(斯里兰卡)、圭630(圭亚那)、明恢63(福建)、青四矮16b(广东)、辐恢718(四川)、扬稻6号(江苏)、冈46b(四川)、陆财号(福建)、明恢78(福建)、irbb21(菲律宾)、蜀恢527(四川)、多恢1号(四川)、桂朝2号(广东)、绵恢725(四川)、乐恢188(四川)、广恢128(广东)、珍汕97b(浙江)。

以上材料均为公知公用材料，江苏省农业种质资源中期库可免费提供。具体参考文献为：游年顺等，地谷不育系的选育及其主要特征，福建农业科技，1991，1：5-6；蒋云洪，日本晴水稻高产栽培技术，山东农业科学，1981，2：28-29；王才林等，优良食味粳稻新品种南粳9108的选育与利用，2013，41(9)：86-88；黄岩县农业科学研究所，早稻广陆矮4号增产途径的探讨，浙江农业科学，1980，2：59-64；邹江石等，武运粳3号的培育构思及生产表现，江苏农业科学，1994，6：7-9；仲维功等，粳稻新品种南粳45的选育及栽培技术，江苏农业科学，2009，5：123-125；林世成等，中国水稻品种及其系谱，上海科学技术出版社，1991:57；谢崇华等，水稻恢复系绵恢501的选育及系列组合的应用，杂交水稻，1997，12(3)：8-10；黄益峰等，浙恢7954实现高产制种的关键技术，浙江农业科学，2009，2：339-340；姚立生等，广谱性恢复系盐恢559及其系列杂交稻组合选育，江苏农业学报，2009，25(3)：469-473；盛生兰等，籼稻恢复系镇恢084的选育及利用，杂交水稻，2002，17(2)：6-7；李育红等，水稻骨干亲本bg90-2在扬稻系列培育中的作用及对白叶枯病抗性，2011，25(4)：439-442；王德师，圭630及其配组的杂交水稻品种，福建农业科技，1979，357-59；吴方喜等，籼型杂交稻恢复系明恢63的利用与创新，福建农业科学，2011，26(6)：1101-1112；万建民，中国水稻遗传育种与品种系谱，中国农业出版社，2009，624；霍二伟等，高产抗病杂交水稻新组合双辐优718，杂交水稻，2011，26(5)：88-89；徐卯林等，优质高产抗病中籼新品种扬稻6号的选育及利用，中国稻米，2001，1：24-26；彭华碧等，冈46a繁殖制种优质高产技术总结，杂交水稻，2002，17(6)：28-29；徐旭增，早秈蓮塘早、陆财号、澄南1号、矮脚南特等品种典型性鉴定的探讨，浙江农业科学，1964，9：436-438；郑家团，恢复系“明恢78”的选育及其特征特性的研究，福建农业科技，1995，2：2-3；曾列先等irbb21(xa21)对广东稻白叶枯病菌5个小种的抗性反应，植物保护学报，2002，29(2)：97-100；王玉平等，高配合力优质水稻恢复系蜀恢527的选育与利用，杂交水稻，2004，19(4)：12-14；郭福泰等，特优多系1号，杂交水稻，1998，13(4)：32；刘纬，水稻新品种“桂朝2号”，温州农业科技，1980，3：13-14；黄廷友等，绵恢725及其相关亲本的issr分析，西南科技大学学报，2008，23(1)：87-90；李乾安等，高产稳产杂交水稻新组合蓉18优188，杂交水稻，2013，28(3)：77-78；郭国强等，广恢128与不同类型不育系测配f1代表现研究，广西农业科学，2004，35(4)：279-281；罗天宽等，籼稻珍汕97b成熟胚诱导再生体系的建立及优化，杂交水稻，2013，28(6)：69-72。

(二)水稻稻瘟病广谱抗性基因bsr-d1功能特异性分子标记的获得

1功能特异性分子标记的开发

稻瘟病广谱抗病基因bsr-d1在loc-os03g32230启动子618bp位点为g碱基，而感病基因bsr-d1在该位点为a碱基，抗病品种中该变异导致上游myb转录因子对bsr-d1的启动子结合增强，从而抑制bsr-d1响应稻瘟病菌诱导的表达，并导致bsr-d1直接调控的h2o2降解酶基因表达下调，使h2o2降解减弱，细胞内h2o2富集，提高了水稻的免疫反应和抗病性。选取功能差异位点突变两侧300～500bp范围内的序列，用primerpremier5软件设计引物。为了能准确鉴定不同水稻品种中的bsr-d1基因型，采用等位基因特异pcr(allele-specificpcr，as-pcr)的方法设计基因功能特异性分子标记。其基本原理是根据目的基因存在的snp设计的特异引物，特异引物仅在一种基因型中有扩增产物，而另一种基因型中没有扩增产物，因此通过2次pcr扩增就可以区分3种基因型。针对loc-os03g32230启动子618位点存在的snp，以该位点为引物的3‘端设计2条反向引物，一个与bsr-d1基因完全匹配，一个与bsr-d1完全匹配；而另一条正向引物为相同引物(图1)。这样，2对引物为互补的等位基因特异引物，可以分别与抗病和感病基因型结合，进行特异扩增。

在引物设计过程中，为增强pcr扩增的特异性，在引物的3’端另外加入1到2个错配碱基。有报道认为g/a，c/t为强错配类型，c/a、c/t为弱错配类型，a/a、c/c、g/g、t/t为中等错配类型。本研究主要在3’端的第2和第3加入弱或强错配的碱基。本研究所合成引物见表1，引物由invitrogen中国公司合成。

表1基于变异位点设计的等位基因特异引物和测序引物

2分子标记的验证

(1)水稻植物基因组dna提取

水稻植株基因组dna的提取参照sds法(dellaportasl,etal.,plantmolbiolrep,1983,1(1):19221)。具体步骤为：取水稻分蘖期叶片1g左右，在-20℃预冷的研钵中用液氮研磨并装入2.0ml离心管；加入600ul提取液(20％sds，1mtris-hcl，0.5medta，5mnacl，65℃预热)，摇匀，65℃温浴30min，中间振荡3～4次；加入1/4体积5mkac,摇匀后置冰上30min；加入氯仿-异戊醇(24:1)300～400ul，在摇床上充分振荡，120rpm，30min；8,000～10,000rpm离心15min，液面分层，下层颜色较深，上层微带黄绿色，取上清(400ul左右)至另一离心管；加入等体积氯仿-异戊醇(24:1)，摇床上充分振荡，80～90rpm，30min；8,000rpm离心15min，转移上清(400ul左右)至新的离心管；加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，轻轻摇匀直到有絮状物产生，12,000rpm离心6min；弃无水乙醇，加入4℃70％乙醇，放置10min，弃上清，超净工作台上风干1h；加入100～200ulte，-20℃保存。

(2)分子标记的扩增和电泳检测

20μlpcr反应体系包括：10×pcrbuffer(mg²⁺)2.0ml，dntp(10mmol/l)0.5μl，taq酶(5u/μl)0.2μl，正向引物(10pmol/l)1.0μl，反向引物(10pmol/l)1.0μl，dna2.0μl，ddh2o13.3μl。

pcr反应条件包括：94℃预变性5min,然后94℃变性1min、58℃退火1min、72℃延伸1.5min,32个循环,最后72℃延伸10min,10℃冷却10min后，将扩增产物加上样缓冲液终止反应。

反应结束后扩增产物加入指示剂(0.25％溴酚兰、0.25％二甲苯青ff、40％蔗糖水溶液)，将扩增产物在1.5％琼脂糖上进行电泳，dured染色，紫外凝胶成相系统保存图像。

(3)分子标记的筛选和验证

利用sds方法提取地谷与nipponbare的dna，利用表1设计的引物进行梯度pcr扩增，扩增产物在1.5％琼脂糖电泳分析(图2)。图2a为bsr-d1基因型设计引物1bsr-d1(bsr-d1-f和1bsr-d1-r)，由图2a可以看出1bsr-d1引物可以扩增出地谷中bsr-d1基因型特异条带，但也能够扩增出nipponbare中bsr-d1基因型非特异条带；图2b为bsr-d1基因型设计引物1bsr-d1(bsr-d1-f和1bsr-d1-r)，由图2b可以看出1bsr-d1引物可以扩增出nipponbare中bsr-d1基因型特异条带，但也能够扩增出地谷中bsr-d1基因型非特异条带；图2c为bsr-d1基因型设计引物2bsr-d1(bsr-d1-f和2bsr-d1-r)，由图2c可以看出2bsr-d1引物可以扩增出地谷中bsr-d1基因型特异条带，但也能够扩增出nipponbare中bsr-d1基因型非特异条带；图2d为bsr-d1基因型设计引物2bsr-d1(bsr-d1-f和2bsr-d1-r)，由图2d可以看出2bsr-d1引物既能扩增出nipponbare中bsr-d1基因型特异条带有能扩增出非特异性条带，同时也能够扩增出地谷中bsr-d1基因型非特异条带。图2e为bsr-d1基因型设计引物3bsr-d1(bsr-d1-f和3bsr-d1-r)，由图2e可以看出3bsr-d1引物可以扩增出地谷中bsr-d1基因型特异条带，同时不能够扩增出nipponbare中bsr-d1基因型非特异条带；图2f为bsr-d1基因型设计引物3bsr-d1(bsr-d1-f和3bsr-d1-r)，由图2f可以看出3bsr-d1引物可以扩增出nipponbare中bsr-d1基因型特异条带，同时不能够扩增出地谷中bsr-d1基因型非特异条带。

以地谷(digu)、nipponbare(nip)、南粳9108(nj9108)、广陆矮4号(gla4)、武育粳3号(wyj3)和南粳45(nj45)的dna为模板，筛选出的引物3bsr-d1和3bsr-d1进行pcr扩增，退火温度为52℃，扩增产物在1.5％琼脂糖电泳分析(图3)。由图3可以看出，以3bsr-d1为引物，地谷和广陆矮4号能够扩增出241bp的特异条带，同时以3bsr-d1为引物，地谷和广陆矮4号不能够扩增出241bp的非特异条带，说明地谷和广陆矮4号含有稻瘟病广谱抗性基因bsr-d1；以3bsr-d1为引物，nipponbare、南粳9108、武育粳3号和南粳45不能够扩增出241bp的非特异条带，同时以3bsr-d1为引物，nipponbare、南粳9108、武育粳3号和南粳45能够扩增出241bp的特异条带，说明这些品种中均不含有bsr-d1基因。

为了进一步验证bsr-d1基因功能特异性分子标记3bsr-d1和3bsr-d1检测结果的准确性，我们对地谷、nipponbare、南粳9108、广陆矮4号、武育粳3号和南粳45等6个水稻品种进行了bsr-d1基因功能位点的全长测序，通过序列比对发现，广陆矮4号与地谷中bsr-d1功能区域序列完全一致，即在bsr-d1基因启动子的618bp处为g碱基；南粳9108、武育粳3号和南粳45等3个品种中bsr-d1序列与nipponbare完全一致，即在bsr-d1基因启动子的618bp处为a碱基(图4)。因此，利用3bsr-d1和3bsr-d1分子标记可以准确鉴定出水稻品种中是否含有稻瘟病广谱抗性基因bsr-d1。

(4)对水稻资源的bsr-d1基因型鉴定

利用分子标记3bsr-d1和3bsr-d1对来自不同地区的22份水稻品种进行pcr扩增，pcr扩增产物经1.5％琼脂糖电泳检测分析。结果显示：绵恢501、浙恢7954、镇恢084、bg90-2、圭630、明恢63、辐恢718、扬稻6号、明恢78、irbb21、蜀恢527、多恢1号、绵恢725、乐恢188和广恢128等15个品种在以3bsr-d1为引物时都能够扩增出241bp的特征条带，在以3bsr-d1为引物时都不能够扩增出241bp的非特征条带，与nipponbare一致，因此这些品种中均不含有bsr-d1基因；南京1号、盐恢559、青四矮16b、冈46b、陆财号、桂朝2号和珍汕97b等7个品种在以3bsr-d1为引物时都能够扩增出241bp的特征条带，在以3bsr-d1为引物时都不能够扩增出241bp的非特征条带，与地谷的带型完全一致，说明这7个水稻品种中均含有稻瘟病广谱抗性基因bsr-d1，这些水稻品种在育种中可以作为优异亲本用于水稻稻瘟病的抗性改良(图5)。因此，3bsr-d1和3bsr-d1分子标记能准确鉴定水稻稻瘟病抗性种质资源。

序列表

<110>江苏省农业科学院

<120>水稻稻瘟病广谱抗性基因bsr-d1的功能特异性分子标记

<160>11

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>5’utr

<222>(1)..(22)

<400>1

agtctagcatccaccgttccac22

<210>2

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<221>5’utr

<222>(1)..(28)

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cttttcgcttatacttatatttatcagc28

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<211>28

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<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

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<210>4

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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