克隆花生胚胎发育晚期丰富蛋白基因的引物对及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学与基因工程领域，具体涉及克隆花生胚胎发育晚期丰富蛋白基因的引物对及其应用。

背景技术：

植物在自然环境中经常要面对各种不利条件(如干旱、盐胁迫、低温等)胁迫造成的水分缺失，在植物的正常发育过程中，有时也面临因脱水而造成的伤害，在长期进化过程中植物形成了我一系列的保护机制。在胁迫条件下植物产生保护性物质如低分子量蛋白、多糖、脯氨酸等就是这些保护机制之一。

lea(lateembryogenesisabundantproteins)蛋白最早发现于20世纪80年代初，因其在植物种子发育晚期大量积累而命名为胚胎发育晚期丰富蛋白，很多研究发现在植物应答干旱、寒冷等原因造成的水分缺失的过程中lea蛋白高水平积累，因此lea蛋白也是植物保护物质中的一种。对lea基因的研究有助于分析探究植物对胁迫条件的应激方式和生理变化过程，对植物的育种和新品种的培育具有重要意义。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一对克隆花生胚胎发育晚期丰富蛋白基因的引物对，并提供了使用该引物对克隆花生胚胎发育晚期丰富蛋白基因的方法，本发明的技术方案如下：

克隆花生胚胎发育晚期丰富蛋白基因的引物对，序列如下：

5’-ccctcaaataatcacaatac-3’；

5’-agaacagagtggcagagt-3’。

上述引物对在花生胚胎发育晚期丰富蛋白基因克隆中的应用。

克隆花生胚胎发育晚期丰富蛋白基因的方法，包括植物材料的处理、rna的提取与cdna的合成、pcr克隆基因全长；

其中pcr克隆基因全长中的引物序列为：

5’-ccctcaaataatcacaatac-3’；

5’-agaacagagtggcagagt-3’。

在上述方案的基础上，所述植物材料为花育33号花生。

在上述方案的基础上，所述植物材料处理为：

将花育33号花生种子播种在营养土与蛭石(质量比2:1)的混合土中，萌发后在光照16h/8h黑暗(28/22℃)的光照培养箱中生长，待幼苗生长至三叶期后进行处理；低温处理：将花生幼苗置于光照培养箱中，温度设定为4℃；nacl、peg6000和aba处理：将花生幼苗从土中拔出，小心冲洗干净根部土后直接浸泡到200mmoll^-1nacl、20％peg6000或100μmoll^-1aba溶液中；均在处理0、1、3、6、12、24、48和72h后分别取叶片和根，液氮冷冻保存，作为后续试验材料。

在上述方案的基础上，所述rna的提取与cdna的合成为：使用天根的rneasyminikit提取处理后材料的总rna，用dnasei处理去除dna污染，用m-mlv反转录酶将去除dna污染的rna反转录成cdna。

在上述方案的基础上，所述pcr克隆基因全长为：以反转录后的cdna为模板，以5’-ccctcaaataatcacaatac-3’和5’-agaacagagtggcagagt-3’为引物进行rcr反应，pcr反应条件如下：94℃2min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。

上述方法克隆的花生胚胎发育晚期丰富蛋白基因在培育和筛选花生耐低温、耐高盐、抗干旱和aba新品种中的应用。

本发明的有益效果

使用本发明设计的引物对，从花生中克隆得到了花生胚胎发育晚期丰富蛋白基因，通过序列比对和进化分析，将其命名为ahleal；使用荧光定量pcr技术研究该基因在低温、干旱、高盐和aba胁迫下的表达模式，结果发现：ahleal基因在叶片和根中对低温、高盐和aba胁迫响应明显，ahleal基因在叶片中对干旱响应不明显，在根中，面对干旱胁迫表达量先上升后下降；由此可见，该基因可用于培育和筛选花生耐低温、耐高盐、抗干旱和aba的新品种；对花生的育种和新品种的培育具有重要意义

附图说明

图1ahleal基因的核苷酸及氨基酸序列；

图2ahleal与其他物种胚胎发育晚期丰富蛋白氨基酸序列比对(ah：arachishypogaea花生；pj：prosopisjuliflora牧豆树；ck：caraganakorshinskii柠条锦鸡儿；am：ammopiptanthusmongolicus沙冬青；蛋白序列号：pjlea：abg66530；cklea1：agn90999；amleal：aaw31666；ahlea：acf74336)；

图3ahleal基因在花生叶片和根中在低温胁迫下的表达模式分析；

图4ahleal基因在花生叶片和根中在干旱胁迫下的表达模式分析；

图5ahleal基因在花生叶片和根中在高盐胁迫下的表达模式分析；

图6ahleal基因在花生叶片和根中在aba胁迫下的表达模式分析。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

1.1试验方法及过程

1.1.1植物材料及处理

本发明所用材料为花生(arachishypogaeal.)品种花育33号，该品种是由本项目组创制的亲本杂交后选育到的高产抗逆新品种。将种子播种在营养土与蛭石(质量比2∶1)的混合土中，萌发后在光照16h/8h黑暗(28/22℃)的光照培养箱中生长，待幼苗生长至三叶期后进行处理。

低温处理：将花生幼苗置于光照培养箱中，温度设定为4℃；

nacl、peg6000(聚乙二醇，polyethyleneglycol)和aba处理：将花生幼苗从土中拔出，小心冲洗干净根部土后直接浸泡到200mmol·l^-1nacl、20％peg6000或100μmol·l^-1aba溶液中。

均在处理0、1、3、6、12、24、48和72h后分别取各组叶片和根，液氮冷冻保存，作为后续试验材料。

1.1.2试验试剂

总rna提取试剂盒、top10感受态购自天根生化科技有限公司。

lataqdna聚合酶，pmd18-t载体，荧光定量pcr用sybrpremixextaq聚合酶购自大连宝生物。

m-mlv反转录酶购自promega。

凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自omega公司。

1.1.3rna提取与cdna合成

样品总rna的提取用天根的rneasyminikit，详细方法参考其使用说明。

合成cdna前要将提取的rna用dnasei处理以去除dna污染。

用m-mlv反转录酶进行cdna(互补dna，complementarydna)的合成，每25μl反应体系中加入2μgrna模板；反转录反应体系在42℃进行1h，之后置于冰上冷却5min。

1.1.4基因全长的扩增

根据cdna文库中已知的花生lea蛋白的全长序列，设计扩增基因全长的引物，引物序列如下：5’-ccctcaaataatcacaatac-3’和5’-agaacagagtggcagagt-3’。以反转录cdna为模板，通过pcr反应扩增基因。pcr反应条件如下：94℃2min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。

1.1.5序列分析

将所测得的序列利用ncbi网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上的blast工具进行基因序列的相似性及同源性查找，并利用这些序列进行基因同源性的比较，cdna全长序列的开放阅读框(openreadingframe，orf)分析用www.ncbi.nlm.nih.gov网站orffinder在线分析。根据所测得基因的cdna序列推导其氨基酸序列，并利用序列分析工具对其进行分析：采用protparam(http://web.expasy.org/protparam/)预测蛋白的基本物理化学性质；蛋白的结构功能域在ncbi的cdss(conserveddomainsearchservice)数据库上进行分析；蛋白的二级结构预测采用sopmasecondarystructurepredictionmethod(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)；蛋白质跨膜结构域分析(http://www.ch.embnet.org/software/tmpred_form.html)；利用loctree3(https://rostlab.org/services/loctree3/)分析蛋白质的亚细胞定位情况。

1.1.6系统发育分析

选取genbank中不同物种的lea蛋白，采用dnaman软件的multiplealignment进行多序列比对分析，创建一个不同来源的lea多序列的比对结果；系统发生和进化的分析在比对的基础上用mega4.0软件完成，系统树采用neighbour-joining方法构建。

1.1.7荧光定量pcr进行基因表达分析

进行荧光定量pcr时，先将cdna样品稀释到8ng·μl-¹，每反应体系中加2μl稀释后的cdna。荧光定量pcr仪采用roche的lightcycler2.0。反应条件：95℃10s；95℃，5s，60℃，30s，72℃，10s，40个循环；绘制溶解曲线，温度每10s升高0.5℃。本试验所用的内参基因为actin11，每个样品重复3次，取平均值，采用delta-deltacp方法分析数据，误差线为3次重复的标准偏差。

荧光定量所用引物如下：

actin11引物为：

5’-ttggaatgggtcagaaggatgc-3’和5’-agtggtgcctcagtaagaagc-3’；

ahleal引物为：

5’-taactaacaaactcgtcctt-3’和5’-aactatggcattgaattgaa-3’。

1.2试验结果及分析

1.2.1ahleal基因的克隆

本发明pcr扩增得到lea基因。该基因全长为555bp，开放阅读框orf为291bp，编码97个氨基酸(图1)。在ncbi网站上对该基因编码的蛋白进行blast分析，发现该蛋白与沙冬青(ammopiptanthusmongolicus)、花生(arachishypogaea)、牧豆树(prosopisjuliflora)和柠条锦鸡儿(caraganakorshinskii)等植物中的胚胎发育晚期丰富蛋白同源性达到近65％(图2)。将该基因命名为ahleal(arachishypogaealate-embryogenesisabundantprotein-likeprotein)。

1.2.2ahleal蛋白理化性质及结构分析

利用protparam分析显示，ahleal的理论分子量为10.19kda，理论等电点为10.06，平均亲水系数(grandaverageofhydropathicity，gravy)是-0.494，说明该蛋白为亲水性蛋白；通过蛋白质亚细胞定位工具预测，这个蛋白可能定位于线粒体上。蛋白质二级结构预测结果显示，ahleal中α螺旋占50.52％，β折叠占12.37％，延伸链占6.19％，无规则卷曲占30.93％；保守结构域预测结果表明该蛋白有lea_3保守结构域。

1.2.3ahleal基因在非生物胁迫下的表达变化

1.2.3.1ahleal基因在花生根和叶片中低温胁迫下的表达变化

通过荧光定量pcr检测了ahleal在花生根和叶片中在低温胁迫下的表达情况(图3)。从图3可以看出，无论在叶片还是根中，ahleal在转录水平上的表达对低温响应非常明显。在低温处理1h后ahleal的表达就有所上调，随着低温处理时间的延长，ahleal的表达逐渐增高，至处理72小时表达量达到最高(图3)。与未处理的材料相比，ahleal在叶片中的表达量最高达到100倍以上(图3a)，在根中最高可达12倍以上(图3b)。

1.2.3.2ahleal基因在花生根和叶片中干旱胁迫下的表达变化

ahleal在花生叶片和根中对干旱胁迫响应不明显(图4)。该基因在花生叶片中干旱处理下对干旱胁迫没有明显的响应(图4a)。在花生根中干旱处理后表达略有增加，至处理的6h表达量达到最高，随后又有所下降(图4b)。

1.2.3.3ahleal基因在花生根和叶片中高盐胁迫下的表达变化

ahleal在花生叶片和根中对高盐胁迫响应明显(图5)。从图5可以看出，无论在花生叶片或根中，该基因的表达均在盐胁迫1h既开始上调，至6h表达量达到最高，随后有所降低。在根中的最大上调倍数(50倍以上)要高于叶片中(10倍以上)。

1.2.3.4ahleal基因在花生根和叶片中aba胁迫下的表达变化

研究表明，胁迫响应基因可能通过两种信号途径调控：aba-dependent和aba-independent。为了研究非生物胁迫诱导的ahleal表达与aba的关系，采用外源aba分别对花生根和叶片进行处理后通过荧光定量pcr检测了ahleal基因的表达。结果表明，ahleal的表达在花生叶片和根中均受aba的明显诱导(图6)。从图6可以看出，无论在花生叶片或根中，该基因的表达均在aba胁迫1h后表达量既达到最高，随后有所降低。在根中的最大上调倍数(25倍以上)要高于叶片中(6倍以上)。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。