检测传染性肌肉坏死病毒的遗传标志物及使用该遗传标志物检测传染性肌肉坏死病毒的方法与流程

本发明涉及用于检测传染性肌肉坏死病毒(infectiousmyonecrosisvirus)的遗传标志物(geneticmarker)，以及使用所述遗传标志物检测传染性肌肉坏死病毒的方法，并且更具体地涉及包括以下的方法：扩增传染性肌肉坏死病毒(imnv)的特定核酸；杂交特异性识别扩增产物的肽核酸(pna)；控制杂交产物的温度以获得温度依赖性解链曲线(meltingcurve)；以及通过分析所获得的解链曲线确定解链温度(meltingtemperature)来检测传染性肌肉坏死病毒或确定虾是否感染了所述病毒。
背景技术：
：虾占全球水产品贸易量的17％，并且75％的虾由水产养殖生产(fao,2009)。虽然全球的虾养殖业大幅增长，但由于疾病暴发造成的虾损失也在持续增加。实际上，自从1994年以来，预计由病毒疾病造成的虾损失是每年约30亿美元($us)以上。传染性肌肉坏死(imn)，近年来报道的新型疾病，2002年在巴西东南部地区的白腿虾(litopenaeusvannamei)水产养殖场首次报道，并且2004年传播至巴西的其他地区，并且2006年在印度尼西亚的爪哇岛也有报道，其中养殖了从巴西进口的虾苗。此后，传染性肌肉坏死(imn)被传播至整个东南亚地区(包括泰国)、中国等，并且已经被认为特别是白腿虾的最大威胁。传染性肌肉坏死(imn)，是一种在韩国没有报道的传染性疾病，被归为二类传染性水生生物疾病，并且已经被分为需要预防措施的国家通报的传染性疾病。然而，近年来，在韩国的白腿虾苗养殖场中也有检测出传染性肌肉坏死(imn)的情况。因此，需要加强监控以阻止传染性肌肉坏死(imn)在韩国的流入和传播。导致肌肉坏死的病毒是传染性肌肉坏死病毒(imnv)。传染性肌肉坏死病毒(imnv)是一种全病毒(totivirus)，并且已知与属于整体病毒科(thefamilytotiviridae)的蓝氏贾第虫鞭毛病毒(giardialabliavirus)密切相关。传染性肌肉坏死病毒(imnv)的基因由7560bp的单链、双链rna分子组成。已知传染性肌肉坏死病毒(imnv)的感染导致大范围的疾病，并且增加水产养殖业的死亡率。已知传染性肌肉坏死病毒(imnv)的主要宿主物种为南美白对虾(penaeusvannamei)。进入传染性肌肉坏死病毒(imnv)的急性传染阶段的虾显示白色坏死部分集中在横纹肌(骨骼肌)或覆盖广泛的区域。具体地，可能有一些由于坏死造成腹部结和尾扇变红的虾。受疾病严重影响的虾处于垂死状态，并且在虾经受“应激(stress)”后，虾的死亡率可能立即迅速增加，并且这种增加可能持续数日。近年来，为了诊断传染性肌肉坏死病毒(imnv)，已经开发了基于分子诊断的诊断方法和试剂盒。在所述方法中，主要使用的方法包括：进行一般聚合酶链式反应(pcr)；和通过电泳分析反应的扩增产物，或使用荧光探针或sybr绿通过实时pcr分析扩增产物。具体地，为了诊断传染性肌肉坏死病毒(imnv)，根据世界动物卫生组织(oie)水生动物卫生法典中提出的标准，进行常规pcr以获得扩增产物，并且通过电泳分析扩增产物，之后克隆扩增产物，并且纯化的质粒dna的核苷酸序列通过诸如桑格测序(sangersequencing)的方法来分析。因此，缺点在于程序复杂，并且疾病诊断的分析耗时。此外，根据oie标准通过电泳分析pcr扩增产物无法客观地实现(灰色区域)，或进行验证步骤，其包括使用克隆载体克隆微小的pcr扩增产物，然后通过测序再确定扩增产物的核苷酸序列。该验证步骤通过分析非特异性pcr条带的序列进行验证，并且问题在于分析程序复杂并且耗时。具体地，当常规pcr(通过测序确定之前)表明扩增产物为阳性时，认为扩增产物具有引起水生生物传染性疾病的风险，并且因此采取预防措施。然而，当稍后进行的测序表明pcr结果为假阳性时，测试实验室的可靠性可能降低，并且还可能发生渔业合作社受损。由于此原因，急需以快速和准确的方式诊断国家通报的传染性疾病的改善的方法。在这样的技术背景下，本发明的发明人已经鉴定了用于辨别和/或检测传染性肌肉坏死病毒(imnv)的遗传标志物，并且发现当使用特异性针对遗传标志物的肽核酸和引物获得扩增和解链曲线时，可以简单、快速和准确的方式检测传染性肌肉坏死病毒(imnv)，从而完成本发明。技术实现要素：技术问题本发明的目的是提供用于检测传染性肌肉坏死病毒(imnv)的遗传标志物和pna探针。本发明的另一个目的是提供用于检测传染性肌肉坏死病毒(imnv)的组合物和试剂盒，其包含用于检测传染性肌肉坏死病毒(imnv)的引物和上述pna探针。本发明的又一个目的是提供用于确定虾是否感染了所述病毒的方法，其包括使用引物生成单链遗传标志物序列片段，然后根据pna探针的杂交将上述pna探针与生成的单链遗传标志物序列片段杂交以获得tm值。技术方案为实现上述目的，本发明提供用于检测传染性肌肉坏死病毒(imnv)的遗传标志物，其包含由seqidno:1表示的核苷酸序列。本发明还提供用于检测传染性肌肉坏死病毒(imnv)的pna探针，其互补性地结合上述遗传标志物，并且包含由seqidno:3表示的核苷酸序列。本发明还提供用于检测传染性肌肉坏死病毒(imnv)的组合物和试剂盒，其包含由seqidno:2序列表示的核苷酸序列和上述pna探针。本发明还提供用于检测传染性肌肉坏死病毒(imnv)的方法，其包括以下步骤：a)从样本中提取靶核酸；b)使用来自靶核酸的传染性肌肉坏死病毒(imnv)的基因核苷酸序列作为模板和包含由seqidno:2序列表示的核苷酸序列的引物生成单链遗传标志物序列片段；c)将包含由seqidno:3表示的核苷酸序列的pna探针与生成的单链遗传标志物序列片段杂交；d)当增加由步骤(c)得到的pna探针杂交产物的温度时，获得温度依赖性溶解曲线；和e)通过分析步骤(d)中获得的溶解曲线并确定解链温度来检测传染性肌肉坏死病毒(imnv)。有益效果本发明的有益效果在于通过选择用于检测传染性肌肉坏死病毒(imnv)的遗传标志物并使用特异性针对遗传标志物的引物和肽核酸，以简单、快速和准确的方式检测传染性肌肉坏死病毒(imnv)，因此可早日阻止被认为是对虾养殖威胁最大的病毒的感染和传播。附图说明图1是显示常规meltingarray方法各步骤和本发明的meltingarray各步骤的技术特征的概念视图。图2是显示与常规meltingarray方法相比，通过本发明的meltingarray方法展现出的效果的示意图。图3显示包含本发明的传染性肌肉坏死病毒(imnv)的遗传标志物、引物和肽核酸的共有序列。图4显示根据oie标准通过用于检测传染性肌肉坏死病毒(imnv)的pcr技术获得的扩增产物的结果。图5显示根据使用引物和肽核酸检测传染性肌肉坏死病毒(imnv)的方法获得的扩增曲线图和解链曲线图。图6显示比较根据oie标准通过pcr检测传染性肌肉坏死病毒(imnv)的结果和使用本发明的引物和肽核酸检测传染性肌肉坏死病毒(imnv)的结果之间敏感性的结果。图7显示通过比对genbank中注册的各种传染性肌肉坏死病毒基因的核酸序列获得的共有序列。图8显示根据使用引物和对照核酸检测传染性肌肉坏死病毒(imnv)的方法获得的扩增曲线图和解链曲线图。具体实施方式除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。通常，以下将描述的本文所使用的命名和实验方法是本领域中熟知并且通常使用的那些。本发明的发明人试图开发如下方法，其在没有测序步骤的情况下或在测序步骤之前，通过确定特异性针对所述病毒的遗传标志物的pcr扩增产物是否特异性/非特异性扩增，来检测传染性肌肉坏死病毒(imnv)，即一种在世界动物卫生组织(oie)水生动物卫生法典中描述的传染性病毒，并且检测感染病毒的个体(例如，虾)。结果是，使用具有特异性针对传染性肌肉坏死病毒(imnv)的核苷酸序列的标志物，以及对应于所述标志物的病毒检测引物和肽核酸探针(pna探针)，可以简单、快速和准确的方式检测传染性肌肉坏死病毒(imnv)。更具体地，本发明涉及组合物和试剂盒(包含meltingarray)的用途，其包含以下使其可检测传染性肌肉坏死病毒(imnv)的组分(1)和(2)，使其可检测传染性肌肉坏死病毒(imnv)：(1)低聚物混合物，其包含用于检测的pna探针(seqidno:3)和用于检测的引物(seqidno:2)，它们特异性针对传染性肌肉坏死病毒(imnv)；和(2)单链生成缓冲液(ssg缓冲液)，其用于使用引物产生的pcr扩增产物作为模板产生单链dna，并且使pna探针与单链dna杂交。因此，在一方面，本发明涉及用于检测传染性肌肉坏死病毒(imnv)的遗传标志物，其包含由seqidno:1表示的核苷酸序列。在另一方面，本发明涉及用于检测传染性肌肉坏死病毒(imnv)的引物，其包含由seqidno:2表示的核苷酸序列。在又一方面，本发明涉及用于检测传染性肌肉坏死病毒(imnv)的pna探针，其包含由seqidno:3表示的核苷酸序列。在本发明中，pna探针可具有附着于两端的报道基因(reporter)和荧光猝灭剂(fluorescencequencher)。荧光猝灭剂可猝灭报道基因的荧光。报道基因可以是选自下组的一种或多种：fam(6-羧基荧光素)、德克萨斯红(texasred)、hex(2',4',5',7'-四氯-6-羧基-4,7-二氯荧光素)、joe、cy3和cy5。猝灭剂可以是选自下组的一种或多种：tamra(6-羧基四甲基-罗丹明)、bhq1、bhq2和dabcyl，但不限于此，并且优选地，dabcyl(fam-标记的)可用作猝灭剂。肽核酸(pna)是具有由肽键代替磷酸键连接的核酸核苷酸的dna类似物，并且在1991年由nielsen等首先合成。pna通过化学方法人工合成，但尚未在自然体系中发现。pna是一种识别基因的物质，如lna(锁核酸)或mna(吗啉代核酸)。它具有由聚酰胺组成的主链。pna的优点在于非常优异的亲和力和选择性，并且对核酸酶具有高稳定性，使其没有被现有限制性内切酶剪切。此外，pna有利地是热和化学上高度稳定的，使其容易存储并且不容易降解。pna通过它与具有与其互补的核苷酸序列的天然核酸杂交形成双螺旋(duplex)。当它们的长度相等时，pna/dna双螺旋比dna/dna双螺旋更稳定，并且pna/rna双螺旋比dna/rna双螺旋更稳定。此外，当pna具有使双螺旋不稳定的单碱基错配时，pna检测snp(单核苷酸多态性)的能力比天然核酸的能力更好。此外，pna-dna结合亲和力远远高于dna-dna结合亲和力，并且因此，即使存在一个核苷酸错配，也有约10至15℃的熔点差异。使用结合亲和力的这种差异，可检测snp(单核苷酸多态性)和in/del核苷酸变化。虽然本发明的pna核苷酸序列的长度没有特别限制，但是其可被构建为具有12至18-mer的长度，从而取决于病毒的种类含有特定的核苷酸序列(例如，核苷酸变异或单核苷酸多态性(snp))。在本发明中，pna探针可通过调节pna探针的长度而设计成具有所需的tm值，并且即使在pna探针具有相同长度的情况下，tm值仍可通过改变核苷酸序列来调节。此外，因为pna探针具有比dna探针更高的结合亲和力，所以它具有更高的tm值。因此，pna探针可设计成具有比dna探针更短的长度，使其甚至可检测相邻的核苷酸变异或snp。在常规hrm(高分辨率解链)方法中，来自靶核酸的tm值差异低至约0.5℃，并且因此需要额外的分析程序或温度的微小变化和修正，并且由于此原因，当两个或更多个核苷酸变异或snp出现时，难以进行分析。然而，本发明的pna探针不受pna探针序列和snp影响，并且因此使其可以简单和方便的方式进行分析。如本发明所述，当pna探针包含13个核苷酸时，优选的是，pna探针在序列中间含有对应于病毒的核苷酸变异或snp位点的一种或多种核苷酸。此外，pna探针在核苷酸序列的中间部分可具有包括对应于病毒的核苷酸变异或snp位点的序列的结构修饰，从而进一步增加来自与其完美匹配的靶核酸的解链温度(tm)的差异。在另一方面，本发明涉及用于检测传染性肌肉坏死病毒(imnv)的组合物和试剂盒，其包含上述引物和上述pna探针。本发明的试剂盒可任选地包括进行靶核酸扩增反应(例如，pcr反应)需要的试剂，诸如缓冲液、dna聚合酶辅助因子，和脱氧核糖核苷酸-5-三磷酸。或者，本发明的试剂盒还可包括各种多核苷酸分子、逆转录酶、各种缓冲液和试剂、以及抑制dna聚合酶活性的抗体。此外，在试剂盒中，用于特定反应的试剂的最佳量可由获得本文所述的公开内容的本领域技术人员容易地确定。通常，本发明的试剂盒可制造为包含上述成分的独立包装或隔室。当使用试剂盒时，靶核酸中的单核苷酸突变和由核苷酸缺失或插入引起的突变可通过分析使用pna获得的解链曲线来检测，从而检测传染性肌肉坏死病毒(imnv)。本发明比较分析对应于根据oie标准用于检测传染性肌肉坏死病毒(imnv)的pcr产物的基因核苷酸序列，并且将由seqidno:3表示的pna探针与使用由seqidno:2表示的检测引物合成的单链pcr扩增产物杂交，从而获得解链曲线，并且从解链曲线确定解链温度(tm)。结果是，本发明的发明人可检测传染性肌肉坏死病毒(imnv)，并且确定虾是否感染了病毒。因此，在进一步的方面，本发明涉及用于检测传染性肌肉坏死病毒(imnv)的方法，其包括以下步骤：(a)从样本中提取靶核酸；(b)使用来自靶核酸的传染性肌肉坏死病毒(imnv)的基因核苷酸序列作为模板和包含由seqidno:2序列表示的核苷酸序列的引物生成单链遗传标志物序列片段；(c)将包含由seqidno:3表示的核苷酸序列的pna探针与生成的单链遗传标志物序列片段杂交；(d)当增加由步骤(c)得到的pna探针杂交产物的温度时，获得温度依赖性溶解曲线；和(e)通过分析步骤(d)中获得的溶解曲线以确定解链温度来检测传染性肌肉坏死病毒(imnv)。本发明的方法可进一步包括在步骤(b)中添加单链生成缓冲液(ssg缓冲液)，以便生成单链遗传标志物序列片段。在本发明中，单链生成缓冲液可包含dna聚合酶、dntp(脱氧核苷酸)和稳定剂，其中dna聚合酶可以是taq聚合酶，但不限于此。在本发明中，步骤(b)可包括使用常规引物对扩增遗传标志物核苷酸序列，然后使用扩增的产物作为模板生成单链遗传标志物序列片段。可以添加taqman探针以便获得扩增曲线。在本发明中，扩增可通过实时pcr(聚合酶链式反应)方法进行。本文使用的术语“样本”指包括各种样本。优选地，使用本发明的方法分析生物样本。更优选地，样本可以是与本文所述的病毒物种混合的样本，或来自感染了病毒的个体(例如，虾等)的样本。可分析起源于植物、动物、人、真菌、细菌和病毒的生物样本。当分析起源于哺乳动物和人的样本时，其可来源于特定的组织或器官。组织的典型实例包括结缔组织、皮肤、肌肉或神经组织。器官的典型实例包括眼睛、脑、肺、肝脏、脾脏、骨髓、胸腺、心脏、淋巴、血液、骨骼、软骨、胰腺、肾脏、胆囊、胃、小肠、睾丸、卵巢、子宫、直肠、神经系统以及腺体和内部血管。要分析的生物样本包括来源于生物来源的任何细胞、组织或液体，或可通过本发明充分分析的任何其他介质。生物样本还包括从生产用于人和/或动物消耗的食品获得的样本。此外，要分析的生物样本包括体液样本，其包括但不限于，血液、血清、血浆、淋巴液、母乳、尿液、粪便、眼液、唾液、精液、脑提取液(例如，磨碎的脑)、脊髓液、阑尾、脾脏和扁桃体提取液，但不限于此。本文使用术语“靶核酸”、“合成dna”或“人工合成的寡核苷酸”指要检测的核酸序列(其含有核苷酸变异或snp)。靶核酸包含编码具有生理和生物功能的蛋白的“靶基因”的核酸序列的特定区域，并且与引物或探针在退火、杂交或扩增条件下退火或杂交。本文使用的术语“杂交”指互补的单链核酸形成双链核酸。当两条核酸链之间的互补完美(完美匹配)时，或当一些错配残基存在时，可发生杂交。杂交需要的互补程度可取决于杂交条件改变，具体可通过温度控制。在本发明中，解链曲线分析可通过荧光解链曲线分析(fmca)方法进行。本发明的包含报道基因和猝灭剂的pna探针在其与靶核酸杂交后生成荧光信号。随着温度增加，pna探针与靶核酸在它们的合适解链温度快速解链，并且因此猝灭荧光信号。通过分析根据温度变化从荧光信号获得的高分辨率解链曲线，可检测核苷酸修饰的存在或缺乏(其包括核苷酸变异或snp)。如果pna探针与靶核酸的核苷酸序列完美匹配，则其显示预期解链温度(tm)值，但是如果pna探针与其中存在核苷酸突变的靶核酸错配，则显示比预期值更低的解链温度(tm)值。本文使用的术语“核苷酸变异”指相对于参考序列的靶核酸的核苷酸序列的改变(例如，一个或多个核苷酸的置换、缺失或插入，以及单核苷酸多态性(snp))。本发明的pna探针可通过解链曲线分析来分析靶核酸的核苷酸序列的变化，诸如靶核酸的snp或靶核酸的置换、缺失或插入。本发明的pna探针可具有附着于两端的报道基因和荧光猝灭剂。荧光猝灭剂可猝灭报道基因的荧光。报道基因可以是选自下组的一种或多种：fam(6-羧基荧光素)、德克萨斯红、hex(2',4',5',7'-四氯-6-羧基-4,7-二氯荧光素)、joe、cy3和cy5。猝灭剂可以是选自下组的一种或多种：tamra(6-羧基四甲基-罗丹明)、bhq1、bhq2和dabcyl，但不限于此，并且优选地，dabcyl(fam-标记的)可用作猝灭剂。tm值还可取决于pna探针的核苷酸序列和与其互补的dna的核苷酸序列之间的差异改变，并且因此基于此变化的应用的发展容易实现。pna探针使用不同于用于taqman探针的水解方法的杂交方法分析，并且具有与pna探针的功能相似功能的探针包括分子信标探针(beaconprobes)和蝎型探针(scorpionprobes)。使用pna探针分析的特定核苷酸序列(例如，核苷酸变异或snp)可使用以下物质充分实现：pcr的正向/反向引物组(primerset)(根据针对常规引物对的国际兽疫局(officeofinternationalepizootics)(oie)标准)和包含识别特定核苷酸序列的(一种或多种)核苷酸的探针，以及使用通过引物组作为模板扩增的遗传标志物核苷酸序列生成单链遗传标志物序列片段的引物。pcr可使用常规方法进行，并且完成pcr之后，需要解链过程。每当解链温度增加0.5℃时，测量荧光的强度以获得tm值。具体地，一般的实时pcr体系广为人知，并且具有的优点在于不需要购买额外的程序，诸如hrm(高分辨率解链)程序或微小温度变化。本发明的解链曲线是分析靶核酸dna或rna所形成的双链核酸和探针的方法。此方法被称为“解链曲线分析”，因为其通过例如tm分析或双链核酸解链曲线的分析而进行。使用与要检测的靶标的特定核苷酸序列(包括核苷酸变异或snp)互补的探针，形成靶单链dna和探针的杂种(双链dna)。随后，加热所形成的杂种，并且基于信号的变化，诸如吸光度，检测由于温度增加造成的杂种的解离(解链)。基于检测的结果，确定tm值，以便可确定特定核苷酸序列的存在或缺失。随着形成的杂种的同源性增加，tm值增加。由于此原因，由要检测的靶标的特定核苷酸序列形成的杂种的tm值和与其互补的探针被事先确定(用于评价的参考值)，并且测量由要检测的样本的靶单链dna形成的杂种的tm值和探针(测量值)。如果测量值大约等于参考值，则可确定的是探针匹配，即，特定核苷酸序列存在于靶dna。如果测量值低于参考值，则探针错配，即，没有突变存在于靶dna。本发明的荧光解链曲线是使用荧光物质分析解链曲线的方法，并且更具体地，可通过使用含有荧光物质的探针分析解链曲线。荧光物质可以是报道基因或猝灭剂，并且优选地可以是嵌入式荧光物质。在本发明的实时聚合酶链式反应(pcr)方法中，荧光物质在pcr期间嵌合在双链dna双螺旋中，并且温度随扩增增加，以解链dna双链从而减少存在于dna双链之间的荧光物质的量。可分析所得解链曲线图案，尤其是dna解链(变性)的温度(tm)，从而基于特定核苷酸序列的存在或缺失(其包括核苷酸变异或snp)检测和/或辩别病毒的类型。图1是显示常规meltingarray方法各步骤和本发明的meltingarray各步骤的技术特征的概念视图，并且图2是显示与常规meltingarray方法相比，本发明的meltingarray方法显示出的效果的示意图。如本文所示，pna探针可杂交靶核酸，然后生成荧光信号。随着温度升高，pna探针在其合适的解链温度(tm)从靶核酸中迅速解链出来，并且因此猝灭荧光信号。根据本发明，通过从荧光信号获得的高分辨率荧光解链曲线分析(fmca)作为该温度变化的结果，可检测靶核酸的存在或缺乏以及核苷酸序列的差异。如果本发明的pna探针与靶核酸的核苷酸序列完美地匹配，则其显示预期的解链温度(tm)值，但是如果pna探针与其中存在核苷酸突变的靶核酸错配，则其显示低于预期值的解链温度(tm)值。如果没有靶核酸，则pna探针不显示解链温度(tm)值。实施例以下，将参考实施例详细描述本发明。对本领域普通技术人员将显而易见的是，这些实施例仅用作说明的目的，并且不被解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将通过所附权利要求及其等同物来定义。实施例1：构建用于检测传染性肌肉坏死病毒(imnv)的遗传标志物，以及特异性针对所述病毒的引物和pna探针为获得特异性针对传染性肌肉坏死病毒(imnv)的遗传标志物，分析如下表1显示的11个病毒核苷酸序列，其注册在美国国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation)(ncbi)的核苷酸数据库(db)中。基于分析的结果，获得包含特异性针对传染性肌肉坏死病毒(imnv)的遗传标志物的共有序列。用于共有序列的iub编码名称汇总在下表2中。表1ncbi编号1gi|686484099|gb|kj556923.1|:5227-55542gi|675273514|gb|ay570982.3|:5227-55543gi|648823001|gb|kj636788.1|:2664-29914gi|887496831|gb|kt003689.1|:4768-50955gi|648822990|gb|kj636784.1|:2664-29916gi|751662875|gb|kj636783.2|:5227-55547gi|124303516|gb|ef061744.1|:4584-49118gi|751662874|gb|kj636782.2|:5230-55579gi|648822998|gb|kj636787.1|:2664-299110gi|648822993|gb|kj636785.1|:2664-299111gi|619810684|gb|kf836757.1|:5227-5554表2混合的碱基编码名称a+grc+tya+cmg+tkg+csa+twa+t+chg+a+tdg+t+cbg+a+cva+g+c+tn分析传染性肌肉坏死病毒(imnv)的共有序列，并且结果是，选择由5'-tggacgactgctg-3'(seqidno:1)表示的核苷酸序列作为用于检测传染性肌肉坏死病毒(imnv)的遗传标志物。此外，作为用于产生遗传标志物的单链dna的引物，构建由seqidno:2表示的引物，并且作为用于杂交遗传标志物的探针，构建由seqidno:3表示的pna探针。图3是显示包含传染性肌肉坏死病毒(imnv)的核苷酸序列的一部分、由此获得的遗传标志物、引物和pna探针的核苷酸序列的视图。在图3中，与pna探针杂交的遗传标志物区域由蓝色表示。表3使用如上表3所示的核苷酸序列、报道基因和猝灭剂构建pna探针。使用panagene(韩国)的hplc纯化方法合成pna探针。通过质谱分析合成的探针的纯度。避免探针不必要的二级结构以有效结合靶核酸。实施例2：优化用于检测传染性肌肉坏死病毒(imnv)的meltingarray试剂盒使用实施例1中构建的pna探针和引物，获得传染性肌肉坏死病毒(imnv)的核酸样本的扩增曲线和解链曲线。分析所获得的曲线以验证pcr产物，从而优化传染性肌肉坏死病毒(imnv)的检测。在本文中，使用根据oie(国际兽疫局)标准用于病毒检测的引物组(常规引物对，表4)。表4分类seqidno:序列(5'->3')用于检测的引物(f)seqidno:4ggcacatgctcagagaca用于检测的引物(r)seqidno:5agcgctgagtccagtcttg使用cfx96实时系统(bio-rad,usa)进行meltingarray反应。为了从pcr产物生成单链靶核酸，使用单链生成缓冲液(ssg缓冲液)和与探针的结合链互补的单个引物。ssg缓冲液的组合物含有2xntaq-hot(0.2单位/μl)、ntaq-hot缓冲液(含有4mmmgcl2)、dntp混合物(a、t、g和c；各0.4mm)和稳定剂。用于meltingarray反应的反应物组合物示于下表5。在制作meltingarray试剂盒的预混液(mastermix)之后，添加1～3ul的pcr产物进行分析。表5组合物含量2xssg缓冲液10μl低聚物混合(pna探针、引物)1.5μl模板(模板、pcr产物)1～3μl蒸馏水高达20μl表6显示反应物的杂交反应条件。具体地，表6显示从pcr产物产生单链dna的步骤、变性步骤，以及杂交pna探针和增加杂交产物温度的方法。表6结果是，如图5中可见，传染性肌肉坏死病毒(imnv)可在63至69℃的tm值通过分析使用pna探针获得的解链曲线来检测。实施例3：检查用于检测传染性肌肉坏死病毒(imnv)的meltingarray试剂盒的敏感性将根据oie标准使用用于病毒检测的引物组获得的各1、0.5、0.25和0.125μl的pcr产物加载到2％琼脂糖凝胶上，并且通过meltingarray试剂盒分析。结果是，如在图6中可见，当将pcr产物加载到琼脂糖凝胶上时，使用pna探针获得的解链曲线中的清晰解链峰(meltingpeak)出现高达0.25μl，在此处可检测到条带，这表示本发明的meltingarray试剂盒足够敏感。此外，显示可通过本发明的meltingarray试剂盒检测pcr产物浓度，在此处可足够检测琼脂糖凝胶上的条带。实施例4：检查本发明的pna探针的传染性肌肉坏死病毒检测特异性比对在genbank中注册的各种传染性肌肉坏死病毒的核酸序列以获得共有序列(图7)。检查共有序列的传染性肌肉坏死病毒检测特异性。为此，另外合成三种不同的共有序列(对照)，并且检查这些共有序列对检测传染性肌肉坏死病毒的影响。使用通过比对传染性肌肉坏死病毒基因的核酸序列获得的共有序列构建的探针示于下表7。探针的构建和使用探针检测感染性坏死病毒的试验根据实施例1至3中描述的方法进行。表7结果是，seqidno:6和seqidno:8的对照探针显示两个峰，这表明对照探针也与非特异性核苷酸序列反应，并且因此不适合于检测传染性肌肉坏死病毒。此外，seqidno:7的对照探针显示通常如单峰那样出现的峰。然而，该峰不是尖峰，而是在50℃左右弯曲的峰，其55℃的峰重叠，其与非特异性核苷酸序列反应，并且因此，双峰如单峰那样出现。这表明seqidno:7的对照探针也不适合于检测传染性肌肉坏死病毒(图8)。从上述结果，可见各种病毒基因的所有共有序列显然不是检测传染性肌肉坏死病毒特定的，并且仅本发明的pna探针特异性结合传染性肌肉坏死病毒，而没有非特异性结合，并且因此针对检测传染性肌肉坏死病毒是特异性的。尽管已经参考具体特征详细描述本发明，对本领域技术人员将显而易见的是，本说明书仅用于优选的实施方式，并且不限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将通过所附权利要求及其等同物来定义。序列表<110>大韩民国(国立水产科学院)<120>检测传染性肌肉坏死病毒的遗传标志物及使用该遗传标志物检测传染性肌肉坏死病毒的方法<130>pf-b1947<150>10-2016-0132022<151>2016-10-12<160>5<170>patentinversion3.5<210>1<211>13<212>dna<213>人工序列<220><223>imnv的遗传标记<400>1tggacgactgctg13<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>2agcgctgagtccagtcttg19<210>3<211>13<212>dna<213>人工序列<220><223>pna探针<400>3cagcagtcgtcca13<210>4<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>常规引物(正向)<400>4ggcacatgctcagagaca18<210>5<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>常规引物(反向)<400>5agcgctgagtccagtcttg19<210>6<211>15<212>dna<213>人工序列<220><223>用于比较的pna探针1<400>6cattcaagtgggcac15<210>7<211>15<212>dna<213>人工序列<220><223>用于比较的pna探针2<400>7gagacaacgtgtata15<210>8<211>14<212>dna<213>人工序列<220><223>用于比较的pna探针3<400>8gcaatcacaagttg14当前第1页12