本发明属于生物领域，具体涉及一种微生物油脂的提取方法。
背景技术：
：微生物油脂（microbialoil）又称单细胞油脂（singlecelloil，sco），是由酵母、霉菌、细菌和藻类等产油微生物利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂为碳源、氮源、辅以无机盐在一定条件下生产的油脂。相对于动植物油脂，微生物油脂生产周期短，不受季节与气候限制，原料来源广，基本不占用额外耕地资源，易于实现规模生产，被认为是很有潜力的新型油脂资源。长期以来，微生物油脂作为一种重要的油脂原料，一直是生物化工重要的研究对象。微生物油脂可以用作食品上重要油脂的替代品（如可可脂等），还可以提供有益人类健康的各类功能性油脂，最近，微生物油脂还被用于生物柴油的原料。总体而言，微生物油脂的油脂脂肪酸组成决定了微生物油脂的用途。通过现代分子生物学手段可以改变菌株油脂的结构与组成，但基因改造一般周期较长，且对于油脂微生物，有效的生物分子信息不多。因此，寻找一种简单、高效、周期短的微生物油脂改造方法十分重要。油脂积累量能超过细胞干重的20%的微生物，即称为产油微生物(oleaginousmicroorganisms)。产油微生物油脂积累过程是一个高度依赖生长环境的生物过程，尤其是营养可得性。早期研究表明，产油微生物在培养基中的碳源过量而其它营养元素不足的条件下能将多余的碳源储存为胞内油脂，这些限制性营养元素包括氮、磷、锌、铁和镁等。至今为止，氮源限制是促发微生物积累油脂的最普遍手段，通常采用较高的c/n比来实现。如当培养基中的c/n比从83.5上升到133.5时，深黄被孢霉的油脂含量从原来的50.0％增加到56.0％，刺孢小克银汉霉（cunninghamellaechinulata）的油脂含量从36.0％增加到47.0％。此外，也有人尝试采用磷元素限制或者硫元素限制等方式，提高微生物积累油脂的能力。例如吴思国等在研究圆红冬孢酵母积累油新方法，采用磷元素限制的方式，调控微生物油脂的含量，结果表明，当c/p从72上升到9552时微生物油脂的含量从21.2％上升到62.1％；采用硫元素限制方式能够取得类似结果，当c/s从150上升到18310时微生物油脂的含量从20.8％到55.8％。目前微生物油脂的获得方式是将微生物菌种通过发酵得到获得大量微生物，然后进行预处理，通过有机溶剂提取、脱溶得到微生物毛油或是采用水热法在碱性条件下通过高温高压进行细胞破壁、得到油脂或是利用产油微生物转化高糖植物菊芋，获取微生物油脂等。这些方法虽然都能获取到微生物油脂，但是像水热法所得产油微生物溶浆通过离心进行油水分离，但由于得到的产油微生物溶浆为含有微生物渣的乳状液，油相和水相混合均匀，难以分离，通过离心进行油水分离能耗较高、油脂提取率较低。因此，发明出一种高效提取微生物油脂的方法是一件非常有必要的事。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题：针对目前产油微生物溶浆通过离心进行油水分离，但由于得到的产油微生物溶浆为含有微生物渣的乳状液，油相和水相混合均匀，难以分离，通过离心进行油水分离能耗较高、油脂提取率较低的问题，提供一种微生物油脂的提取方法。为解决上述技术问题，本发明采用如下所述的技术方案是：一种微生物油脂的提取方法，其特征在于，该制备方法包括如下步骤：（1）生物乙醇废水-木薯粉水解液的制备：取木薯粉与生物乙醇废水混合均匀，得生物乙醇废水-木薯粉混合液，将生物乙醇废水-木薯粉混合液的ph调至6.0，并在90~95℃糊化，得生物乙醇废水-木薯粉糊化液，将生物乙醇废水-木薯粉糊化液的ph调至6.5，向乙醇废水-木薯粉糊化液加入氯化钙溶液和α-淀粉酶，搅拌，得生物乙醇废水-木薯粉反应酶液，向生物乙醇废水-木薯粉反应酶液中加入糖化酶，搅拌，离心，取上清液，得生物乙醇废水-木薯粉水解液；（2）取圆红冬孢酵母菌接种至yepd液体培养基中培养，得圆红冬孢酵母活化菌液，离心，取菌丝体，用生理盐水洗涤菌丝体1~2次，得洗涤后菌丝体，将洗涤后菌丝体接种至生物乙醇废水中培养，得废水培养液，将废水培养液接种至生物乙醇废水中培养，重复培养4~5次，得富集乙醇废水培养液，将富集乙醇废水培养液用质量分数为0.9%的生理盐水稀释至10-6的稀释级，得稀释后废水培养液，将稀释后废水培养液涂布于yepd平板培养基上培养，挑选菌落圆且菌径最大的单菌落，得到驯化圆红冬孢酵母菌，将驯化圆红冬孢酵母菌接种于yepd种子培养基中培养，得驯化菌株培养液，将驯化菌株培养液接种于生物乙醇废水-木薯粉水解液中培养，得培养液，作为u型提取生物油脂结构中内外两层中间物质；（3）内层内壁材料：将naoh和尿素的水溶液按质量比7：12混合均匀，得混合溶液，将混合溶液置于低温冷却循环泵中预冷至-12℃，得预冷混合溶液，按质量比3：1向预冷的混合溶液中加入纤维素粉末，在-12℃下搅拌10~15min，得均匀的纤维素溶液，向均匀的纤维素溶液中按质量比10：3加入peg400，搅拌混合均匀，得致孔纤维素溶液，9000r/min离心10min，取上清，得均匀透明的铸膜液，用刮刀将铸膜液均匀涂抹在内层的内壁上，浸没在凝固浴中凝固再生10min，得湿态的纤维素分离膜；（4）将u型提取生物油脂结构中内外两层中间物质置于提取器内外层的中间，产生的微生物油脂通过内层外壁的多孔不锈钢到达内层的内壁的湿态的纤维素分离膜，微生物油脂通过湿态的纤维素分离膜分离，即可提取微生物油脂。所述步骤（1）中生物乙醇废水的预处理：取自某木薯生物乙醇厂蒸馏釜底液，将取得的废水静置1~2h，5000r/min离心10min，过滤，取上清液，去固体残渣。所述步骤（1）中木薯粉按质量比1:4与生物乙醇废水混合；乙醇废水-木薯粉糊化液与氯化钙溶液和α-淀粉酶的质量比为5：3：2；生物乙醇废水-木薯粉反应酶液与糖化酶的质量比为3：1。所述步骤（2）中菌种保藏：圆红冬孢酵母菌4~5℃保藏于yepd斜面培养基上；圆红冬孢酵母菌按质量比1：9接种至yepd液体培养基中，28~33℃培养18~28h；菌丝体的接种量为质量分数10%，28~33℃、180r/min培养2~3天；驯化菌株培养液培养条件为28~33℃、180r/min培养28h；按质量分数10%的接种量将驯化菌株培养液接种于生物乙醇废水-木薯粉水解液28~33℃培养3~5天。所述步骤（3）中纤维素预处理：用高速粉碎机将纤维素粉碎成粉末后，在55~60℃真空烘箱中干燥24h，得纤维素粉末，放置于干燥器中保存。所述步骤（3）中naoh和尿素的水溶液的质量比为7：12；预冷的混合溶液与纤维素粉末的质量比为3：1；均匀的纤维素溶液与peg400的质量比为10：3。所述步骤（4）中生物油脂提取器结构：为u型结构，共设置内外两层，底部密封，顶部开放；外层材料：密封性不锈钢；内层外壁材料：多孔不锈钢。本发明与其他方法相比，有益技术效果是：（1）本发明以生物乙醇废水为原料生产微生物油脂，筛选获得适应有机废水环境的产油菌株，由于废水碳源浓度偏低、碳氮比过小，营养组成不利于产油微生物积累油脂，但如果将有机废水与含碳源丰富的其他廉价原料混合处理，既可以得到较高的油脂含量，也可以实现废水的资源化处理，提高排出单位废水的产能，降低有机废水的处理负荷，鉴于此，本发明通过在高浓度生物乙醇废水中将高产油脂酵母圆红冬孢酵母菌反复驯化，获得能够高效降解生物乙醇废水化学需氧量的产油菌株，将廉价碳源木薯粉生产微生物油脂和高浓度有机废水降解过程整合，以生物乙醇废水为水源制备生物乙醇废水-木薯粉水解液培养基，提高了产油效率高和生物乙醇废水化学需氧量降解率；（2）本发明通过设计u型结构反应器，将驯化菌株培养液与生物乙醇废水-木薯粉水解液的混合液置于内外层的中间，产生的微生物油脂通过内层外壁的多孔不锈钢到达内层的内壁的湿态的纤维素分离膜，利用naoh和尿素溶剂体系溶解纤维素，并向纤维素溶液中添加一定比例的致孔剂peg400，在凝固浴中分相再生成膜，再生纤维素分离膜具备良好的机械性能，但断面结构致密，纯水通量较低，产油微生物溶浆为含有微生物渣的乳状液，纤维素分离膜靠自身孔径的筛分机理来分离乳化油，而溶解油则由分离膜表面与油滴的相互排斥作用达到截留效果，纤维素分离膜表面亲水性好，疏油，与油滴间的排斥作用使其很难通过膜孔以达到乳状液中油脂与含有微生物渣的溶液分离。具体实施方式菌种：圆红冬孢酵母菌，购于中国普通微生物菌种保藏管理中心。种子培养基组成及菌种保藏：圆红冬孢酵母菌4~5℃保藏于yepd斜面培养基上，种子培养基为yepd液体培养基。生物乙醇废水：取自某木薯生物乙醇厂蒸馏釜底液，将取得的废水静置1~2h，5000r/min离心10min，过滤，取上清液，去固体残渣，备用。生物油脂提取器结构：为u型结构，共设置内外两层，底部密封，顶部开放。外层材料：密封性不锈钢；内层外壁材料：多孔不锈钢。纤维素预处理：用高速粉碎机将纤维素粉碎成粉末后，在55~60℃真空烘箱中干燥24h，得纤维素粉末，放置于干燥器中保存。致孔剂：peg400，购于江苏海安石油化工厂。一种微生物油脂的提取办法，包括如下步骤：（1）取木薯粉按质量比1:4与生物乙醇废水混合均匀，得生物乙醇废水-木薯粉混合液，将生物乙醇废水-木薯粉混合液的ph调至6.0，并在90~95℃糊化30min，得生物乙醇废水-木薯粉糊化液，将生物乙醇废水-木薯粉糊化液的ph调至6.5，在68~70℃条件下，按质量比5：3：2向乙醇废水-木薯粉糊化液加入氯化钙溶液和α-淀粉酶，搅拌2~3h，得生物乙醇废水-木薯粉反应酶液，按质量比3：1向生物乙醇废水-木薯粉反应酶液中加入糖化酶，65℃下搅拌3~4h，4000r/min离心10min，取上清液，得生物乙醇废水-木薯粉水解液；（2）取圆红冬孢酵母菌按质量比1：9接种至yepd液体培养基中，28~33℃培养18~28h，得圆红冬孢酵母活化菌液，5000r/min离心10min，取菌丝体，用生理盐水洗涤菌丝体1~2次，得洗涤后菌丝体，将洗涤后菌丝体按质量分数10%的接种量接种至生物乙醇废水中，28~33℃、180r/min培养2~3天，得废水培养液，按质量分数为10%的接种量将废水培养液接种至生物乙醇废水中培养2~3天，重复培养4~5次，得富集乙醇废水培养液，将富集乙醇废水培养液用质量分数为0.9%的生理盐水稀释至10-6的稀释级，得稀释后废水培养液，将稀释后废水培养液涂布于yepd平板培养基上，28~33℃培养2~3天，挑选菌落圆且菌径最大的单菌落，得到驯化圆红冬孢酵母菌，将驯化圆红冬孢酵母菌接种于yepd种子培养基中，28~33℃、180r/min培养28h，得驯化菌株培养液，按质量分数10%的接种量将驯化菌株培养液接种于生物乙醇废水-木薯粉水解液28~33℃培养3~5天，得培养液，作为u型提取生物油脂结构中内外两层中间物质；（3）内层内壁材料：将naoh和尿素的水溶液按质量比7：12混合均匀，得混合溶液，将混合溶液置于低温冷却循环泵中预冷至-12℃，得预冷混合溶液，按质量比3：1向预冷的混合溶液中加入纤维素粉末，在-12℃下搅拌10~15min，得均匀的纤维素溶液，向均匀的纤维素溶液中按质量比10：3加入peg400，搅拌混合均匀，得致孔纤维素溶液，9000r/min离心10min，取上清，得均匀透明的铸膜液，用刮刀将铸膜液均匀涂抹在内层的内壁上，浸没在凝固浴中凝固再生10min，得湿态的纤维素分离膜；（4）将u型提取生物油脂结构中内外两层中间物质置于提取器内外层的中间，产生的微生物油脂通过内层外壁的多孔不锈钢到达内层的内壁的湿态的纤维素分离膜，微生物油脂通过湿态的纤维素分离膜分离，即可提取微生物油脂。实例1菌种：圆红冬孢酵母菌，购于中国普通微生物菌种保藏管理中心。种子培养基组成及菌种保藏：圆红冬孢酵母菌4℃保藏于yepd斜面培养基上，种子培养基为yepd液体培养基。生物乙醇废水：取自某木薯生物乙醇厂蒸馏釜底液，将取得的废水静置1h，5000r/min离心10min，过滤，取上清液，去固体残渣，备用。生物油脂提取器结构：为u型结构，共设置内外两层，底部密封，顶部开放。外层材料：密封性不锈钢；内层外壁材料：多孔不锈钢。纤维素预处理：用高速粉碎机将纤维素粉碎成粉末后，在55℃真空烘箱中干燥24h，得纤维素粉末，放置于干燥器中保存。致孔剂：peg400，购于江苏海安石油化工厂。一种微生物油脂的提取办法，包括如下步骤：（1）取木薯粉按质量比1:4与生物乙醇废水混合均匀，得生物乙醇废水-木薯粉混合液，将生物乙醇废水-木薯粉混合液的ph调至6.0，并在90℃糊化30min，得生物乙醇废水-木薯粉糊化液，将生物乙醇废水-木薯粉糊化液的ph调至6.5，在68℃条件下，按质量比5：3：2向乙醇废水-木薯粉糊化液加入氯化钙溶液和α-淀粉酶，搅拌2h，得生物乙醇废水-木薯粉反应酶液，按质量比3：1向生物乙醇废水-木薯粉反应酶液中加入糖化酶，65℃下搅拌3h，4000r/min离心10min，取上清液，得生物乙醇废水-木薯粉水解液；（2）取圆红冬孢酵母菌按质量比1：9接种至yepd液体培养基中，28℃培养18h，得圆红冬孢酵母活化菌液，5000r/min离心10min，取菌丝体，用生理盐水洗涤菌丝体1次，得洗涤后菌丝体，将洗涤后菌丝体按质量分数10%的接种量接种至生物乙醇废水中，28℃、180r/min培养2天，得废水培养液，按质量分数为10%的接种量将废水培养液接种至生物乙醇废水中培养2天，重复培养4次，得富集乙醇废水培养液，将富集乙醇废水培养液用质量分数为0.9%的生理盐水稀释至10-6的稀释级，得稀释后废水培养液，将稀释后废水培养液涂布于yepd平板培养基上，28℃培养2天，挑选菌落圆且菌径最大的单菌落，得到驯化圆红冬孢酵母菌，将驯化圆红冬孢酵母菌接种于yepd种子培养基中，28℃、180r/min培养28h，得驯化菌株培养液，按质量分数10%的接种量将驯化菌株培养液接种于生物乙醇废水-木薯粉水解液28℃培养3天，得培养液，作为u型提取生物油脂结构中内外两层中间物质；（3）内层内壁材料：将naoh和尿素的水溶液按质量比7：12混合均匀，得混合溶液，将混合溶液置于低温冷却循环泵中预冷至-12℃，得预冷混合溶液，按质量比3：1向预冷的混合溶液中加入纤维素粉末，在-12℃下搅拌10min，得均匀的纤维素溶液，向均匀的纤维素溶液中按质量比10：3加入peg400，搅拌混合均匀，得致孔纤维素溶液，9000r/min离心10min，取上清，得均匀透明的铸膜液，用刮刀将铸膜液均匀涂抹在内层的内壁上，浸没在凝固浴中凝固再生10min，得湿态的纤维素分离膜；（4）将u型提取生物油脂结构中内外两层中间物质置于提取器内外层的中间，产生的微生物油脂通过内层外壁的多孔不锈钢到达内层的内壁的湿态的纤维素分离膜，微生物油脂通过湿态的纤维素分离膜分离，即可提取微生物油脂。实例2菌种：圆红冬孢酵母菌，购于中国普通微生物菌种保藏管理中心。种子培养基组成及菌种保藏：圆红冬孢酵母菌5℃保藏于yepd斜面培养基上，种子培养基为yepd液体培养基。生物乙醇废水：取自某木薯生物乙醇厂蒸馏釜底液，将取得的废水静置2h，5000r/min离心10min，过滤，取上清液，去固体残渣，备用。生物油脂提取器结构：为u型结构，共设置内外两层，底部密封，顶部开放。外层材料：密封性不锈钢；内层外壁材料：多孔不锈钢。纤维素预处理：用高速粉碎机将纤维素粉碎成粉末后，在60℃真空烘箱中干燥24h，得纤维素粉末，放置于干燥器中保存。致孔剂：peg400，购于江苏海安石油化工厂。一种微生物油脂的提取办法，包括如下步骤：（1）取木薯粉按质量比1:4与生物乙醇废水混合均匀，得生物乙醇废水-木薯粉混合液，将生物乙醇废水-木薯粉混合液的ph调至6.0，并在95℃糊化30min，得生物乙醇废水-木薯粉糊化液，将生物乙醇废水-木薯粉糊化液的ph调至6.5，在70℃条件下，按质量比5：3：2向乙醇废水-木薯粉糊化液加入氯化钙溶液和α-淀粉酶，搅拌3h，得生物乙醇废水-木薯粉反应酶液，按质量比3：1向生物乙醇废水-木薯粉反应酶液中加入糖化酶，65℃下搅拌4h，4000r/min离心10min，取上清液，得生物乙醇废水-木薯粉水解液；（2）取圆红冬孢酵母菌按质量比1：9接种至yepd液体培养基中，33℃培养28h，得圆红冬孢酵母活化菌液，5000r/min离心10min，取菌丝体，用生理盐水洗涤菌丝体2次，得洗涤后菌丝体，将洗涤后菌丝体按质量分数10%的接种量接种至生物乙醇废水中，33℃、180r/min培养3天，得废水培养液，按质量分数为10%的接种量将废水培养液接种至生物乙醇废水中培养3天，重复培养5次，得富集乙醇废水培养液，将富集乙醇废水培养液用质量分数为0.9%的生理盐水稀释至10-6的稀释级，得稀释后废水培养液，将稀释后废水培养液涂布于yepd平板培养基上，33℃培养3天，挑选菌落圆且菌径最大的单菌落，得到驯化圆红冬孢酵母菌，将驯化圆红冬孢酵母菌接种于yepd种子培养基中，33℃、180r/min培养28h，得驯化菌株培养液，按质量分数10%的接种量将驯化菌株培养液接种于生物乙醇废水-木薯粉水解液33℃培养5天，得培养液，作为u型提取生物油脂结构中内外两层中间物质；（3）内层内壁材料：将naoh和尿素的水溶液按质量比7：12混合均匀，得混合溶液，将混合溶液置于低温冷却循环泵中预冷至-12℃，得预冷混合溶液，按质量比3：1向预冷的混合溶液中加入纤维素粉末，在-12℃下搅拌15min，得均匀的纤维素溶液，向均匀的纤维素溶液中按质量比10：3加入peg400，搅拌混合均匀，得致孔纤维素溶液，9000r/min离心10min，取上清，得均匀透明的铸膜液，用刮刀将铸膜液均匀涂抹在内层的内壁上，浸没在凝固浴中凝固再生10min，得湿态的纤维素分离膜；（4）将u型提取生物油脂结构中内外两层中间物质置于提取器内外层的中间，产生的微生物油脂通过内层外壁的多孔不锈钢到达内层的内壁的湿态的纤维素分离膜，微生物油脂通过湿态的纤维素分离膜分离，即可提取微生物油脂。实例3菌种：圆红冬孢酵母菌，购于中国普通微生物菌种保藏管理中心。种子培养基组成及菌种保藏：圆红冬孢酵母菌4℃保藏于yepd斜面培养基上，种子培养基为yepd液体培养基。生物乙醇废水：取自某木薯生物乙醇厂蒸馏釜底液，将取得的废水静置1.5h，5000r/min离心10min，过滤，取上清液，去固体残渣，备用。生物油脂提取器结构：为u型结构，共设置内外两层，底部密封，顶部开放。外层材料：密封性不锈钢；内层外壁材料：多孔不锈钢。纤维素预处理：用高速粉碎机将纤维素粉碎成粉末后，在57℃真空烘箱中干燥24h，得纤维素粉末，放置于干燥器中保存。致孔剂：peg400，购于江苏海安石油化工厂。一种微生物油脂的提取办法，包括如下步骤：（1）取木薯粉按质量比1:4与生物乙醇废水混合均匀，得生物乙醇废水-木薯粉混合液，将生物乙醇废水-木薯粉混合液的ph调至6.0，并在93℃糊化30min，得生物乙醇废水-木薯粉糊化液，将生物乙醇废水-木薯粉糊化液的ph调至6.5，在69℃条件下，按质量比5：3：2向乙醇废水-木薯粉糊化液加入氯化钙溶液和α-淀粉酶，搅拌2.5h，得生物乙醇废水-木薯粉反应酶液，按质量比3：1向生物乙醇废水-木薯粉反应酶液中加入糖化酶，65℃下搅拌3.5h，4000r/min离心10min，取上清液，得生物乙醇废水-木薯粉水解液；（2）取圆红冬孢酵母菌按质量比1：9接种至yepd液体培养基中，30℃培养23h，得圆红冬孢酵母活化菌液，5000r/min离心10min，取菌丝体，用生理盐水洗涤菌丝体1次，得洗涤后菌丝体，将洗涤后菌丝体按质量分数10%的接种量接种至生物乙醇废水中，30℃、180r/min培养2.5天，得废水培养液，按质量分数为10%的接种量将废水培养液接种至生物乙醇废水中培养2.5天，重复培养4次，得富集乙醇废水培养液，将富集乙醇废水培养液用质量分数为0.9%的生理盐水稀释至10-6的稀释级，得稀释后废水培养液，将稀释后废水培养液涂布于yepd平板培养基上，30℃培养2.5天，挑选菌落圆且菌径最大的单菌落，得到驯化圆红冬孢酵母菌，将驯化圆红冬孢酵母菌接种于yepd种子培养基中，30℃、180r/min培养28h，得驯化菌株培养液，按质量分数10%的接种量将驯化菌株培养液接种于生物乙醇废水-木薯粉水解液31℃培养4天，得培养液，作为u型提取生物油脂结构中内外两层中间物质；（3）内层内壁材料：将naoh和尿素的水溶液按质量比7：12混合均匀，得混合溶液，将混合溶液置于低温冷却循环泵中预冷至-12℃，得预冷混合溶液，按质量比3：1向预冷的混合溶液中加入纤维素粉末，在-12℃下搅拌13min，得均匀的纤维素溶液，向均匀的纤维素溶液中按质量比10：3加入peg400，搅拌混合均匀，得致孔纤维素溶液，9000r/min离心10min，取上清，得均匀透明的铸膜液，用刮刀将铸膜液均匀涂抹在内层的内壁上，浸没在凝固浴中凝固再生10min，得湿态的纤维素分离膜；（4）将u型提取生物油脂结构中内外两层中间物质置于提取器内外层的中间，产生的微生物油脂通过内层外壁的多孔不锈钢到达内层的内壁的湿态的纤维素分离膜，微生物油脂通过湿态的纤维素分离膜分离，即可提取微生物油脂。对照例：北京市某公司的一种提取微生物油脂的方法。分别采取本发明的提取微生物油脂的方法与对照例的提取微生物油脂的方法对微生物进行提取，采用连续提取法测试其油脂提取率，测试结果见表1。表1：测试项目实例1实例2实例3对照例油脂提取率%51566121~27综合上述，采用本发明的微生物油脂方法油脂提取率更好，值得推广使用。当前第1页12