基于纳米金功能化树枝状聚酰胺胺的便携式DNA生物传感器的制作方法

本发明涉及一种生物传感器，特别涉及一种基于纳米金功能化树枝状聚酰胺胺的便携灵敏检测dna的生物传感器。

背景技术：

dna检测已普遍用于病原体分析、遗传疾病诊断和法医检测。在过去十年中，基于捕获dna和靶dna之间杂交的生物传感器已实现无需靶dna扩增就能够直接、灵敏、快速地检测dna。目前，这些开发用于dna检测的各种传感技术主要涉及荧光、比色、电化学、表面等离子共振以及表面增强拉曼光谱等方法。这些方法虽然相对于常规dna检测方法高度灵敏且高效，但所用检测仪器昂贵或需要复杂的仪器与操作。一些比色或荧光方法虽可以通过肉眼检测dna，但它们只能实现定性或半定量检测，并且颜色观察可能会因不同人员而异，或受到周围环境光线对比度的影响。因此，开发简单、便携、低成本且能定量检测dna的方法具有重要意义。

为了应对这一挑战，本发明利用个人血糖仪作为检测终端进行便携式定量dna检测。血糖仪因其便携性，快速测定，低成本和操作简单等特点而受到了广泛关注。目前，基于个人血糖仪的生物传感器已经实现了多种非血糖目标物的检测，如铀离子、腺嘌呤核苷三磷酸、可卡因、干扰素-γ、心脏生物标志物肌红蛋白等分析物的检测。然而，大多数血糖仪利用dna蔗糖酶缀合物作为中介以实现将非血糖目标物识别转化为葡萄糖释放，从而实现其对非血糖目标物的检测。dna蔗糖酶缀合物通过巯基修饰的蔗糖酶与氨基修饰的dna共价连接而形成，这限制了dna上结合酶的量，进一步影响酶的放大效率。因此增加dna分子上酶结合的比例将能够大大提高dna检测的灵敏度。

纳米技术的出现为通过信号放大策略检测生物分子开辟了新的途径。金纳米粒子是一种稳定的纳米材料，拥有很好的生物相容性，它可以与很多生物分子共轭结合并且不改变这些分子的性质和活性。本发明将dna与蔗糖酶共同固定在纳米金功能化树枝状聚酰胺胺表面，以纳米金功能化树枝状聚酰胺胺为中介，间接增加了dna分子上酶结合的比例。通过充分利用纳米金功能化树枝状聚酰胺胺与个人血糖仪二者的优点，开发出一种简单、灵敏且能便携检测dna的生物传感器。

技术实现要素：

本发明的目的是开发出一种简单、灵敏且能便携检测dna的生物传感器。

具体技术方案如下：

一种基于纳米金功能化树枝状聚酰胺胺的便携式dna生物传感器，其制备方法包括以下步骤：

(1)、纳米金功能化树枝状聚酰胺胺的制备将新鲜制备的haucl4溶液(10ml，20mmol/l)与2ml超纯水加入12.5ml树枝状聚酰胺胺溶液中，此混合溶液搅拌1小时。然后将新鲜制备并储存于4摄氏度中的nabh4(500ul，1mol/l)迅速加入到上述溶液中，并充分搅拌反应30分钟。当溶液的颜色从浅黄色变为红褐色时说明纳米金功能化树枝状聚酰胺已经形成。在这个过程中，吸附于树枝状聚酰胺胺上的三化合价金离子被还原为零化合价的金原子。随后，透析除去杂质和游离的金纳米颗粒。最后将以上制备的纳米金功能化树枝状聚酰胺胺分散于5ml超纯水中，并置于棕色瓶4摄氏度储存。

(2)、蔗糖酶与dna修饰的纳米金功能化树枝状聚酰胺胺的制备利用蔗糖酶上的半胱氨酸或赖氨酸残基与金纳米粒子间的相互作用，以及dna上的巯基基团与金纳米粒子间的相互作用制备蔗糖酶与dna修饰的纳米金功能化树状大分子。蔗糖酶(30ul，1.0mg/ml)加入到22ul纳米金功能化树枝状聚酰胺胺(稀释18倍，终浓度为0.048mmol/l)与178ulpbs(0.01mol/l，ph7.4)共200ul的混合液中，并于4摄氏度条件下孵育30分钟。随后10ul1.0umol/l信号核酸(溶液含有10mmol/ltris-hcl，10mmol/ltcep，0.1mol/lnacl，ph7.4)加入到上述混合液中，并于同样的条件下孵育12小时(信号核酸与蔗糖酶加入量的体积比为1∶3)。

(3)、捕获核酸修饰磁珠的制备取30ul4mg/ml的链霉亲和素磁珠溶液，用pbs缓冲液洗涤三次。然后将4ul100umol/l的磁珠结合核酸加至上述磁珠溶液中，于37摄氏度下孵育30分钟，然后磁分离，洗去过量的磁珠结合核酸；紧接着4ul100umol/l的捕获核酸加入磁珠中，并于37摄氏度下反应30分钟，磁分离，除去未结合的捕获核酸。最终将制备的捕获核酸修饰磁珠分散于120ulpbs溶液中。

(4)、上述制备的磁珠溶液去除缓冲液后，加入60ul的蔗糖酶与dna修饰的纳米金功能化树枝状聚酰胺胺，混合液于37摄氏度下反应30分钟。经磁分离后去除未结合的复合物(用pbs缓冲液清洗三次)，最后将功能化磁珠分散于60ul的pbs溶液中。取10ul此功能化磁珠溶液，经磁分离后加入10ul待检的dna样品，并于37摄氏度孵育90分钟。磁分离后，取7ul上清液与3ul2mol/l蔗糖(终浓度0.6mol/l)混合，并于37摄氏度孵育8小时。最终取2ul反应后的混合液用于血糖仪检测。这样就建立起基于纳米金功能化树枝状聚酰胺胺的便携式dna生物传感器体系。

所述步骤(1)中所用nabh4最好是500ul1mol/l。

所述步骤(2)中信号核酸与蔗糖酶加入量的体积比最好是1∶3。

所述步骤(2)中纳米金功能化树枝状聚酰胺胺浓度最好是0.048mmol/l。

所述步骤(4)中加入蔗糖酶与dna修饰的纳米金功能化树枝状聚酰胺胺37摄氏度下反应时间最好是30分钟。

所述步骤(4)中与待检dna样品孵育时间最好是90分钟。

所述步骤(4)中所用蔗糖终浓度最好是0.6mol/l。

所述步骤(4)中上清液与蔗糖于37摄氏度下孵育时间最好是8小时。

本发明利用血糖仪建立了一种基于纳米金功能化树枝状聚酰胺胺的便携灵敏检测dna的生物传感器。其检测原理为将磁珠结合核酸通过亲和素-生物素作用固定于链酶亲和素修饰的磁珠表面，捕获核酸通过碱基互补配对与磁珠结合核酸部分结合，形成dna双链。蔗糖酶通过其半胱氨酸以及赖氨酸残基，而信号核酸通过其巯基基团分别与金纳米粒子相互作用，共同结合在纳米金功能化树枝状聚酰胺胺表面，形成蔗糖酶修饰的纳米金功能化树枝状聚酰胺胺。蔗糖酶修饰的纳米金功能化树枝状聚酰胺胺通过信号核酸与捕获核酸杂交结合，从而把修饰有蔗糖酶的纳米金功能化树枝状聚酰胺胺固定在磁珠表面。当代检dna存在的条件下，其与捕获核酸特异性结合，将蔗糖酶修饰的纳米金功能化树枝状聚酰胺胺置换下来，经磁分离后，上清液中存在的蔗糖酶催化底物蔗糖产生可直接检测的葡萄糖信号，从而实现血糖仪对dna的定量检测。

纳米金功能化树枝状聚酰胺胺的成功合成对此传感器的制备起着至关重要的作用，本发明采用透射电镜、电化学阻抗谱和紫外可见吸收光谱对其进行了形态学表征。如附图1所示，纳米金功能化树枝状聚酰胺胺的透射结果显示，其平均尺寸约3nm。采用电化学阻抗谱对合成的纳米金功能化树枝状聚酰胺胺进行表征，可见裸金电极其电荷转移值比较大(附图2曲线c)；当裸金电极上修饰树枝状聚酰胺胺后，由于树枝状聚酰胺胺具有很强的电子传递能力，其电荷转移值几乎成一条直线(曲线a)；而当纳米金功能化树枝状聚酰胺胺固定在裸金电极上时，其电荷转移值稍有增加，位于单纯的树枝状聚酰胺胺与裸金电极之间(曲线b)。同时，采用紫外可见吸收光谱对树枝状聚酰胺胺与纳米金功能化树枝状聚酰胺胺进行表征(附图3)。单纯的纳米金功能化树枝状聚酰胺胺特征性吸收峰在283nm处，当金纳米粒子原位还原在树枝状聚酰胺胺上形成纳米金功能化树枝状聚酰胺胺后，其特征性吸收峰由单峰变成了双峰，分别是286nm与520nm。这些结果都表明金纳米粒子在树枝状聚酰胺胺上已经还原成功。

为了证明蔗糖酶已经牢固地结合在纳米金功能化树枝状聚酰胺胺表面，仅有信号核酸修饰的纳米金功能化树枝状聚酰胺胺和蔗糖酶、信号核酸共同修饰的纳米金功能化树枝状聚酰胺胺分别与捕获核酸修饰磁珠混合孵育，紧接着将所得的磁珠分别与蔗糖一起孵育并用于血糖仪检测。正如附图4所示，纳米金功能化树枝状聚酰胺胺结合的磁珠并不能产生血糖信号，因为纳米金功能化树枝状聚酰胺胺在无酶的情况下不能催化蔗糖产生葡萄糖。然而，蔗糖酶修饰的纳米金功能化树枝状聚酰胺胺结合的磁珠能产生明显的血糖信号(2.5mmol/l，条图b)，表明纳米金功能化树枝状聚酰胺胺中引入蔗糖酶可以诱导蔗糖酶水解反应。

同时，本专利就传感策略的可行性进行了证明。琼脂糖凝胶电泳用以证实靶dna与捕获核酸杂交并释放出信号核酸(附图5)。磁珠结合核酸与捕获核酸杂交后产生了条带1，此产物进一步与信号核酸杂交后产生新的条带2，条带2中的杂交产物与靶dna反应，产生新的条带3。电泳结果显示靶dna能与磁珠结合核酸、捕获核酸和信号核酸形成的杂交产物反应。实验中所用到的单链dna浓度都是4umol/l，双链dna浓度都是2umol/l。为了进一步证明传感策略的可行性，利用本专利所制备传感器分别对低中高三个dna浓度水平进行了检测。如附图6所示，在无靶dna时，几乎无血糖信号产生(条图a)，当靶dna浓度为10pmol/l与1000pmol/l时，能观察到明显的血糖信号(条图b与c)。以上结果表明该传感策略具有检测靶dna的能力。

信号核酸与蔗糖酶的比例在该方法的检测性能方面起着重要的作用，因为信号核酸浓度过高，结合的蔗糖酶量就会很少，相应的产生信号就比较低，而如果信号核酸浓度过低，结合在磁珠上的信号核酸比较少，检测的血糖信号同样也会较低，因此对信号核酸与蔗糖酶的比例进行研究尤为必要。如附图7所示，随着信号核酸与蔗糖酶浓度的比例增加，血糖信号急剧增加，在比例为1∶3时信号最大，超过此比例血糖信号下降，因此1∶3为最佳信号核酸与蔗糖酶浓度的比例。

由于纳米金功能化树枝状聚酰胺胺的浓度决定了其表面结合蔗糖酶的量，因此研究了其在稀释5倍至100倍浓度下的检测能力。如附图8所示，当其稀释倍数约为18倍时，达到最大的血糖信号，因此稀释18倍(此时纳米金功能化树枝状聚酰胺胺的浓度是0.048mmol/l)的纳米金功能化树枝状聚酰胺胺为其最佳浓度。过低或过高浓度的纳米金功能化树枝状聚酰胺胺均不会产生高血糖信号。过高浓度的纳米金功能化树枝状聚酰胺胺也许限制了信号核酸或蔗糖酶在金纳米粒子表面的结合。

捕获核酸修饰的磁珠与蔗糖酶修饰的纳米金功能化树枝状聚酰胺胺孵育时间对信号产生的影响如附图9所示。从图中可以看出，孵育时间在起初30分钟呈上升趋势，当孵育时间达到30分钟时，信号达到最大并处于稳定状态，所以我们选择捕获核酸修饰的磁珠与蔗糖酶修饰的纳米金功能化树枝状聚酰胺胺的最佳孵育时间为30分钟。

靶dna的孵育时间对该检测方法的最终结果也有很大的影响，如附图10所示，孵育90分钟时有一个最大峰，因此90分钟作为靶dna最佳孵育时间。

如附图11所示，蔗糖浓度在0.2-0.6mol/l时，血糖信号增加，而蔗糖浓度过高时基本不变，因此，0.6mol/l作为蔗糖的最佳浓度。

本发明对靶dna的单碱基突变与双碱基突变进行了试验。如附图12所示，与靶dna存在时产生的高血糖信号相比，单碱基突变与双碱基突变均观察到比较低的血糖信号，这表明了该传感策略的优秀特异性。

本发明对该传感策略的重复性进行了试验。方法如下：取三个浓度水平的dna待检样品(1pmol/l，10pmol/l，100pmol/l)，每个浓度测三次，每次测试用一个试纸条，并计算相对标准偏差。测试结果如附图13所示，以上三个浓度水平的dna待检样品相对标准偏差分别为4.2％，4.7％，3.3％。结果表明该传感策略具有比较满意的重复性。

本发明对该传感器的稳定性进行了试验。将放置不同时间的蔗糖酶修饰的纳米金功能化树枝状聚酰胺胺结合磁珠直接与蔗糖在37摄氏度条件下孵育1个小时，取其上清液用于血糖仪检测。如附图14所示，试验结果表明，当在4℃下储存时，基于纳米金功能化树枝状聚酰胺胺的便携灵敏检测dna的生物传感器至少可储存一周而不影响其性能。

为了评估该传感策略对靶dna的分析性能，我们用一系列不同浓度的靶dna对本策略进行了研究。根据0.1pm到10nm不同浓度的靶dna检测到的结果，如附图15所示，从图中可以看出，随着靶dna浓度的增加，信号也跟着增加，当靶dna浓度在0.5pm至1nm范围时，信号的增加与靶dna浓度的对数有比较好的线性关系，其回归方程为y(mm)＝12.012+2.056logc(nm)，相关系数为0.995，检测限为0.26pm，y代表血糖信号，

c代表靶dna的浓度。

本专利利用血糖仪建立了一种基于纳米金功能化树枝状聚酰胺胺的便携灵敏检测dna的生物传感器。以纳米金功能化树枝状聚酰胺胺上可以结合更多酶性分子这一特点，实现了酶性放大。该传感策略检测便携、灵敏度高，拥有低的检测限0.26pmol/l和宽的检测范围0.5pmol/l到1000pmol/l。同时，我们提出的这种检测策略，只需要改变捕获核酸如适配体核酸，就可以实现其他生物分子的检测。结果表明，该dna生物传感器在疾病诊断方面具有潜在的应用价值。

附图说明

图1是纳米金功能化树枝状聚酰胺胺的投射电镜图

图2是纳米金功能化树枝状聚酰胺胺与树枝状聚酰胺胺的电化学阻抗谱

图3是纳米金功能化树枝状聚酰胺胺与树枝状聚酰胺胺的紫外图谱

图4是蔗糖酶结合到纳米金功能化树枝状聚酰胺胺表面的证明

图5是2.5％的琼脂糖凝胶电泳图

图6是在不同浓度待检dna水平下的血糖信号

图7是蔗糖酶与信号核酸比例对血糖信号的影响

图8是纳米金功能化树枝状聚酰胺胺的浓度对血糖信号的影响

图9是捕获核酸修饰的磁珠与蔗糖酶修饰的纳米金功能化树枝状聚酰胺胺孵育时间对血糖信号的影响

图10是靶dna的孵育时间对血糖信号的影响

图11是所用蔗糖浓度对血糖信号的影响

图12是传感策略的特异性试验

图13是在不同浓度的待检dna水平下传感策略的重复性试验

图14是蔗糖酶修饰的纳米金功能化树枝状聚酰胺胺结合磁珠的稳定性试验

图15是不同浓度靶dna的血糖响应信号

具体实施方式

制备基于纳米金功能化树枝状聚酰胺胺的便携式dna生物传感器，按以下步骤操作：

(1)、纳米金功能化树枝状聚酰胺胺的制备将新鲜制备的haucl4溶液(10ml，20mmol/l)与2ml超纯水加入12.5ml树枝状聚酰胺胺溶液中，此混合溶液搅拌1小时。然后将新鲜制备并储存于4摄氏度中的nabh4(500ul，1mol/l)迅速加入到上述溶液中，并充分搅拌反应30分钟。当溶液的颜色从浅黄色变为红褐色时说明纳米金功能化树枝状聚酰胺已经形成。在这个过程中，吸附于树枝状聚酰胺胺上的三化合价金离子被还原为零化合价的金原子。随后，透析除去杂质和游离的金纳米颗粒。最后将以上制备的纳米金功能化树枝状聚酰胺胺分散于5ml超纯水中，并置于棕色瓶4摄氏度储存。

(2)、蔗糖酶与dna修饰的纳米金功能化树枝状聚酰胺胺的制备利用蔗糖酶上的半胱氨酸或赖氨酸残基与金纳米粒子间的相互作用，以及dna上的巯基基团与金纳米粒子间的相互作用制备蔗糖酶与dna修饰的纳米金功能化树状大分子。蔗糖酶(30ul，1.0mg/ml)加入到22ul纳米金功能化树枝状聚酰胺胺(稀释18倍，终浓度为0.048mmol/l)与178ulpbs(0.01mol/l，ph7.4)共200ul的混合液中，并于4摄氏度条件下孵育30分钟。随后10ul1.0umol/l信号核酸(溶液含有10mmol/ltris-hcl，10mmol/ltcep，0.1mol/lnacl，ph7.4)加入到上述混合液中，并于同样的条件下孵育12小时(信号核酸与蔗糖酶加入量的体积比为1∶3)。

(3)、捕获核酸修饰磁珠的制备取30ul4mg/ml的链霉亲和素磁珠溶液，用pbs缓冲液洗涤三次。然后将4ul100umol/l的磁珠结合核酸加至上述磁珠溶液中，于37摄氏度下孵育30分钟，然后磁分离，洗去过量的磁珠结合核酸；紧接着4ul100umol/l的捕获核酸加入磁珠中，并于37摄氏度下反应30分钟，磁分离，除去未结合的捕获核酸。最终将制备的捕获核酸修饰磁珠分散于120ulpbs溶液中。

(4)、上述制备的磁珠溶液去除缓冲液后，加入60ul的蔗糖酶与dna修饰的纳米金功能化树枝状聚酰胺胺，混合液于37摄氏度下反应30分钟。经磁分离后去除未结合的复合物(用pbs缓冲液清洗三次)，最后将功能化磁珠分散于60ul的pbs溶液中。取10ul此功能化磁珠溶液，经磁分离后加入10ul待检的dna样品，并于37摄氏度孵育90分钟。磁分离后，取7ul上清液与3ul2mol/l蔗糖(终浓度0.6mol/l)混合，并于37摄氏度孵育8小时。最终取2ul反应后的混合液用于血糖仪检测。这样就建立起基于纳米金功能化树枝状聚酰胺胺的便携式dna生物传感器体系。