一种miRNA‑21小分子及其用途的制作方法

本发明属于生物技术和医学领域，涉及一种rna小分子，具体来说是一种mirna-21小分子及其用途。

背景技术：

心肌梗死等缺血性心脏病发病率高，致残率和死亡率高，是危害人类健康的主要疾病之一。据统计，我国每年心肌梗死的新发生患者达50万，现患者为250万，其中1/2已经丧失劳动能力【中国心血管病报告，陈伟伟等著，中国大百科全书出版社，2014年】。心肌梗死患者即便通过直接冠状动脉介入(pci)及溶栓等再灌注治疗得到救治，其后期也往往发展为慢性心力衰竭，这是心肌梗死的主要并发症，严重影响其行动能力和生活质量【decarvalholp.等，long-termprognosisandriskheterogeneityofheartfailurecomplicatingacutemyocardialinfarction.amjcardiol.2015；115:872-878】。从心肌缺血凋亡坏死至后期的心力衰竭，需要经历多个事件过程，其病理过程大致可分为三个时期：急性炎症期、修复期和重构期【reedgw.等，acutemyocardialinfarction.lancet2017；389:197-210】。心肌梗死的急性炎症期(7天以内)主要表现为梗死区心肌的凋亡坏死、大量炎症细胞的浸润和炎症介质的分泌。心梗后5-7天开始进入修复期，梗死区域坏死组织逐渐被吸收，基质降解及肉芽组织形成，胶原沉积和心肌纤维化以及边缘区血管新生。心梗后数周后进入重构期，主要表现为梗死区瘢痕逐渐稳定，非梗死区的心肌细胞肥大及心肌反应性纤维化，心室扩张及心功能下降，发展为不良心脏重构，其结局就是心力衰竭。在这些病理过程中，心肌炎症损伤是至关重要的节点事件，过度的炎症反应会促进边缘区心肌细胞的凋亡，加强细胞外基质的降解，导致心脏破裂；持续的炎症反应会减少胶原沉积，导致瘢痕组织的张力强度减弱，从而引起心室扩张，因此心肌炎症损伤的反应强度失调会显著提高不良心脏重构及心力衰竭的发生率【frangogiannisng.等，theinflammatoryresponseinmyocardialinjury,repair,andremodelling.natrevcardiol2014；11:255-265】。

心肌梗死后炎症反应主要是由坏死心肌组织及细胞释放的内源性危险信号物质(damps)激活炎症细胞中的天然免疫应答体系而触发。心肌梗死所产生的坏死心肌细胞以及细胞外基质会释放多种内源性危险信号分子，包括hmgb1(highmobilitygroupbox-1)、热休克蛋白(heatshockproteins，hsps)60和70、以及核酸成分等，它们可以被浸润的免疫炎性细胞，主要是巨噬细胞和树突状细胞等)、内皮细胞以及心肌细胞表达的toll样受体(toll-likereceptors，tlrs)所识别【timmersl.等，theinnateimmuneresponseinreperfusedmyocardium.cardiovascres.2012；94:276-283；frantzs.等，cardiacmacrophagesandtheirroleinischaemicheartdisease.cardiovascres.2014；102:240-248】。这些toll样受体主要包括tlr2、tlr3、tlr4、tlr7和tlr9等，他们识别相应的内源性危险分子后，通过myd88接头蛋白活化下游信号通路，进而激活nf-κb和mapks等信号，诱导炎性细胞因子、趋化因子、黏附分子以及生长因子的表达，进一步募集炎性细胞到损伤局部，清除损伤组织和死亡细胞，促进血管生成等，但同时也引发局部组织炎症损伤【hat.等，toll-likereceptors:newplayersinmyocardialischemia/reperfusioninjury.antioxidredoxsignal.2011；15:1875-1893】。因此，控制心梗后组织的炎症损伤强度，对于防止发生不良心脏重构和提高心功能，具有关键性作用【arslanf.等，innateimmunesignalingincardiacischemia.natrevcardiol.2011；8:292-300】。

mirnas是一类由21～23个核苷酸构成的功能性非编码小分子，可通过结合靶基因信使rna来调节基因的表达，从而发挥生物学调节功能，包括调节固有免疫应答、心血管疾病的发生发展等。通过mirnas调节疾病相关基因的表达，从而达到防治疾病的目的，是目前研究工作的重点和热点。越来越多的证据表明：mirnas在调控固有免疫应答和炎症反应中发挥关键作用【sheedy,fj.等，addingfueltofire:micrornasasanewclassofmediatorsofinflammation.annrheumdis.2008；67suppl:iii50-iii55】。最近发现一些mirnas，如mir-1、mir-133、mirna-21、mir-320和mir-199a参与心血管疾病的发生发展过程【belevych,ae.等，microrna-1and-133increasearrhythmogenesisinheartfailurebydissociatingphosphataseactivityfromryr2complex.plosone.2011；6:e28324；han,m.等，micrornasinthecardiovascularsystem.curropincardiol.2011；26:181-189；bauersachs,j.等,mirna-21:acentralregulatoroffibrosisnotonlyinthebrokenheart.cardiovascres.2012；96:227-229】。mirna-21被报道在心肌纤维化和心肌细胞凋亡等病理变化过程中发挥着重要调控作用。mir-21通过抑制靶分子spry1表达促进erk-map激酶活性，从而促进心脏成纤维细胞的存活和生长因子分泌，从而在心力衰竭模型小鼠中加重间质纤维化和心脏肥大的程度【thumt.等，microrna-21contributestomyocardialdiseasebystimulatingmapkinasesignallinginfibroblasts.nature.2008；456:980-984】。mir-21对心肌细胞凋亡具有保护作用，一方面，mirna-21可以通过pten/akt信号通路抑制fasl的表达，从而抑制心肌缺血再灌注损伤后心肌细胞的凋亡；另一方面，mirna-21下调pdcd4的表达从而抑制h2o2诱导的心肌细胞死亡和凋亡【tuy.等，ischemicpostconditioning-mediatedmirna-21protectsagainstcardiacischemia/reperfusioninjuryviapten/aktpathway.plosone.2013；8:e75872；sayedd.等，microrna-21isadownstreameffectorofaktthatmediatesitsantiapoptoticeffectsviasuppressionoffasligand.jbiolchem.2010；285:20281-20290；chengy.等，microrna-21protectsagainsttheh(2)o(2)-inducedinjuryoncardiacmyocytesviaitstargetgenepdcd4.jmolcellcardiol.2009；47:5-14】。但目前为止，尚未见报道mirna-21对心梗后早期炎症的调控作用。

正是基于以上研究背景，本发明研究了mirna-21在小鼠心梗后早期炎症反应中的调控作用，发现mirna-21能够抑制心梗后早期的炎症反应，从而在心梗早期发挥抗炎作用。

技术实现要素：

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种mirna-21及其用途，所述的这种mirna-21及其用途要解决现有技术中的药物对于心梗后早期炎症的治疗和预防效果不佳的技术问题。

本发明提供了一种mirna-21小分子，其核苷酸序列如seqidno:1所示(5’-uagcuuaucagacugauguuga-3’)。

本发明还提供了上述的一种mirna-21在制备预防心肌梗死早期炎症或延缓心肌梗死早期炎症病程发展的药物中的应用。

本发明还提供了一种药物组合物，含有上述mirna-21序列。

进一步的，上述的药物组合物，还含有药学上可接受的载体或辅料。

本发明还提供了上述的一种药物组合物在制备预防心肌梗死早期炎症或延缓心肌梗死早期炎症病程发展的药物中的应用。

本发明的mirna-21在心肌梗死早期心梗边缘区心肌组织中表达显著增加；此外，本发明的mirna-21能抑制心肌梗死早期的炎症反应，从而发挥抗炎的作用。本发明的mirna-21可用于制备抑制心肌梗死早期炎症以及病程发展的药物。

附图说明

图1：小鼠心肌梗死后心梗边缘区心肌组织中mirna-21的表达情况(结果显示为平均值±标准差，n＝5；***，p<0.001)。

图2：mirna-21模拟物抑制心梗边缘区心肌组织中炎性细胞因子的产生(结果显示为平均值±标准差，n＝5；*，p<0.05；**，p<0.01)。

图3：mirna-21模拟物抑制心梗边缘区心肌组织中分离的cd11b阳性细胞中炎性细胞因子的产生(结果显示为平均值±标准差，n＝5；*，p<0.05)。

图4：过表达mirna-21的模拟物抑制小鼠细胞中damps诱导的炎性细胞因子的产生。其中图4a为过表达mirna-21的模拟物抑制小鼠细胞中rmhmgb1诱导的炎性细胞因子的产生；图4b过表达mirna-21的模拟物抑制小鼠细胞中rmhsp60诱导的炎性细胞因子的产生(结果显示为平均值±标准差，n＝6；**，p<0.01)。

实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人《分子克隆：实验室指南》(newyork：coldspringharborlaboratorypress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1：小鼠心肌梗死后心梗边缘区心肌组织中mirna-21的表达上调

小鼠(c57品系，雄性，8-10周龄，上海西普尔-必凯实验动物有限公司购买)，按照文献报道方法建立心肌梗死模型【tarnavski,o.等，mousecardiacsurgery:comprehensivetechniquesforthegenerationofmousemodelsofhumandiseasesandtheirapplicationforgenomicstudies.physiolgenomics.2004；16；349-360】，假手术组小鼠在建立心肌梗死模型时只穿线不结扎前降支。分别在心肌梗死后1天、2天、3天、5天、7天取小鼠心梗边缘区心肌组织。

组织总rna使用trizol(invitrogen公司)抽提。采用实时定量反转录pcr(qrt-pcr)方法对心梗边缘区心肌组织中mirna-21的表达进行了分析。qrt-pcr使用sybrrt-pcr试剂盒(takara公司)并在lightcycler480(roche公司)实时定量pcr仪上完成。

mirna-21rt引物为：5’-gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgactcaact-3’。

mirna-21定量pcr引物为5’-cggctagcttatcagactga-3’(上游)和5’-gtgcagggtccgaggt-3’(下游)。

内参照u6小核rna的反转录反应引物为5’-aacgcttcacgaatttgcgt-3’(即为u6定量pcr的下游引物)。

u6定量pcr引物为5’-ctcgcttcggcagcaca-3’(上游)和5’-aacgcttcacgaatttgcgt-3’(下游)。

mirna的相对定量使用2^-δδct法计算(u6为内参)【livak，kj.等，analysisofrelativegeneexpressiondatausingreal-timequantitativepcrandthe2-δδctmethod.methods.2001；25：402-408】。

小鼠心肌梗死后心梗边缘区心肌组织中mirna-21的表达情况如图1所示。结果显示：小鼠心肌梗死后心梗边缘区心肌组织中mirna-21的表达显著升高，在心肌梗死后3天到达最高值。

该结果表明：在小鼠心肌梗死边缘区心肌组织中mirna-21是心肌梗死后炎症的应答基因。

实施例2：mirna-21模拟物抑制小鼠心梗边缘区心肌组织中的炎性细胞因子的产生

小鼠(c57品系，雄性，8-10周龄，上海西普尔-必凯实验动物有限公司购买)，如实施例1所述制备小鼠心肌梗死模型，心梗边缘区局部注射携带mirna-21模拟物的腺病毒载体和对照腺病毒载体(上海和元生物技术有限公司合成)，分别在心肌梗死后3天、5天、7天取小鼠心梗正常区心肌组织和心梗边缘区心肌组织。

组织总rna使用trizol(invitrogen公司)抽提。采用实时定量反转录pcr(qrt-pcr)方法对心梗心肌组织中炎性细胞因子的表达进行了分析。qrt-pcr使用sybrrt-pcr试剂盒(takara公司)并在lightcycler480(roche公司)实时定量pcr仪上完成。

il-1β定量pcr引物为5’-ggtgtgtgacgttcccattagac-3’(上游)和5’-catggagaatatcacttgttggttga-3’(下游)。

il-6定量pcr引物为5’-tagtccttcctaccccaatttcc-3’(上游)和5’-ttggtccttagccactccttc-3’(下游)。

tnf-α定量pcr引物为5’-aagcctgtagcccacgtcgta-3’(上游)和5’-ggcaccactagttggttgtctttg-3’(下游)。

内参gapdh定量pcr引物为5’-aggtcggtgtgaacggatttg-3’(上游)和5’-tgtagaccatgtagttgaggtca-3’(下游)。

mrna的相对定量使用2^-δδct法计算(gapdh为内参)【livak，kj.等，analysisofrelativegeneexpressiondatausingreal-timequantitativepcrandthe2-δδctmethod.methods.2001；25：402-408】。

mirna-21模拟物对小鼠心梗心肌组织中的炎性细胞因子的产生情况如图2所示。结果显示：mirna-21模拟物能抑制小鼠心梗边缘区心肌组织中il-1β、il-6、tnf-α的产生。

该结果表明：mirna-21模拟物可抑制小鼠心梗边缘区心肌组织中炎性细胞因子的产生。

实施例3：mirna-21模拟物抑制心梗边缘区心肌组织中分离的cd11b阳性细胞中炎性细胞因子的产生

小鼠(c57品系，雄性，8-10周龄，上海西普尔-必凯实验动物有限公司购买)，如实施例1所述制备小鼠心肌梗死模型，心梗边缘区局部注射携带mirna-21模拟物的腺病毒载体和对照腺病毒载体(上海和元生物技术有限公司合成)，在心肌梗死后3天用磁珠细胞分选法(miltenyibiotec公司)分离心梗边缘区心肌组织中的cd11b阳性细胞。

cd11b阳性细胞总rna使用trizol(invitrogen公司)抽提。采用实时定量反转录pcr(qrt-pcr)方法对心梗边缘区心肌组织中的cd11b阳性细胞中炎性细胞因子的表达进行了分析。qrt-pcr使用sybrrt-pcr试剂盒(takara公司)并在lightcycler480(roche公司)实时定量pcr仪上完成。

il-1β定量pcr引物为5’-ggtgtgtgacgttcccattagac-3’(上游)和5’-catggagaatatcacttgttggttga-3’(下游)。

il-6定量pcr引物为5’-tagtccttcctaccccaatttcc-3’(上游)和5’-ttggtccttagccactccttc-3’(下游)。

tnf-α定量pcr引物为5’-aagcctgtagcccacgtcgta-3’(上游)和5’-ggcaccactagttggttgtctttg-3’(下游)。

内参gapdh定量pcr引物为5’-aggtcggtgtgaacggatttg-3’(上游)和5’-tgtagaccatgtagttgaggtca-3’(下游)。

mrna的相对定量使用2^-δδct法计算(gapdh为内参)【livak，kj.等，analysisofrelativegeneexpressiondatausingreal-timequantitativepcrandthe2-δδctmethod.methods.2001；25：402-408】。

mirna-21模拟物对心梗边缘区心肌组织中分离的cd11b阳性细胞中的炎性细胞因子的产生情况如图3所示。结果显示：mirna-21模拟物能抑制小鼠心梗边缘区心肌组织中分离的cd11b阳性细胞中il-1β、il-6、tnf-α的产生。

该结果表明：mirna-21模拟物可抑制小鼠心梗边缘区心肌组织中分离的cd11b阳性细胞中炎性细胞因子的产生。

实施例4：过表达mirna-21的模拟物抑制巨噬细胞中damps诱导的炎性细胞因子的产生

mirna-21模拟物(s:5’-uagcuuaucagacugauguuga-3’；a:5’-ucaacaucagucugauaagcua-3’)由广州锐博生物科技有限公司合成，模拟物对照由广州锐博生物科技有限公司提供。小鼠(c57品系，雌性，4-6周龄，上海西普尔-必凯实验动物有限公司购买)腹腔注射巯基乙酸盐(thioglycollate)(购自merck公司)2ml/只，两天后以无血清rpmi1640培养基冲洗腹腔，按照文献报道方法获得原代腹腔巨噬细胞【liu,x.等，intracellularmhcclassiimoleculespromotetlr-triggeredinnateimmuneresponsesbymaintainingactivationofthekinasebtk.natureimmunology.2011；12(5):416-424.】。巨噬细胞(5×10⁵个细胞/1mlrpmi1640培养基)使用interferin转染试剂(polyplus-transfection公司)转染mirna-21的模拟物及对照(终浓度为20nm)至巨噬细胞中。转染后48小时，细胞用0.1mg/ml重组rmhmgb1或者rmhsp60(购自cusabio公司)，刺激0、4、8小时后，收集细胞培养上清利用elisa(所用试剂盒购自r&d公司)检测炎性细胞因子蛋白水平。

elisa分析的结果如图4a、b所示。结果显示：过表达mirna-21的模拟物可减少小鼠巨噬细胞中rmhmgb1和rmhsp60诱导的il-1β、il-6、tnf-α的产生。

该结果表明：mirna-21模拟物可抑制巨噬细胞中damps诱导的炎性细胞因子的产生。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>上海市东方医院

<120>一种mirna-21小分子及其用途

<141>2017-11-16

<160>15

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

uagcuuaucagacugauguuga22

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