预防或治疗犬瘟热的寡聚核酸组合及其应用的制作方法

本发明涉及生物医药领域，具体涉及预防或治疗犬瘟热的寡聚核酸组合及其应用。

背景技术：

犬瘟热是由犬瘟热病毒(caninedistempervirus，cdv)引起的急性、高度接触传染性疾病，呈世界性分布，自然感染宿主种类广泛，且可在不相关的动物种类间交叉感染，现已扩展到了食肉目的所有8个科、偶蹄目猪科和灵长目的猕猴属和鳍足目海豹科等多种动物，且有不断扩大的趋势，在人的变形性骨炎患者体内也检测到了cdv的核酸分子。cdv是负链单股不分节段的rna病毒，与麻疹病毒、牛瘟病毒、海豹病毒等在分类学上同属于副粘病毒科麻疹病毒属，其基因组长约16kb。研究表明，cdv的融合蛋白(由f基因编码)和血凝素蛋白(由h基因编码)是宿主免疫系统的主要目的抗原，是产生中和抗体的重要抗原之一；核衣壳蛋白(由n基因编码)是保守性较强的免疫原性蛋白。融合蛋白、血凝素蛋白和核衣壳蛋白在犬瘟热的免疫预防方面起重要作用。

目前主要通过接种犬瘟热弱毒疫苗，来防御犬瘟热的爆发。但由于cdv的基因变异，普通疫苗很难具有广适性。而且目前cdv疫苗的管理不严谨，市场上疫苗质量良莠不齐，各厂家使用的疫苗毒株也不尽相同，这种情况下cdv发生变异和重组的频率可能会加快，易出现新的基因型，出现上述情况后，又会进一步导致疫苗抗体效价下降快，抗原特异性降低。对cdv各结构蛋白结构和功能的研究进展显示，选择合适的高度保守或特异性的序列作为抗原表位，开发基因工程药物是预防和治疗犬瘟热的发展趋势之一。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是如何预防或治疗犬瘟热。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种寡聚核酸组合。

本发明所提供的寡聚核酸组合，可为寡聚核酸ngene-119、寡聚核酸ngene-1321、寡聚核酸ngene-476、寡聚核酸ngene-749、寡聚核酸ngene-316、寡聚核酸ngene-541、寡聚核酸ngene-1091、寡聚核酸ngene-435、寡聚核酸ngene-927、寡聚核酸fgene-866、寡聚核酸fgene-1825、寡聚核酸fgene-792、寡聚核酸fgene-685、寡聚核酸fgene-1279、寡聚核酸fgene-485、寡聚核酸hgene-416、寡聚核酸hgene-1447、寡聚核酸hgene-1664、寡聚核酸hgene-492、寡聚核酸hgene-947、寡聚核酸hgene-1488、寡聚核酸hgene-1373、寡聚核酸hgene-1332和寡聚核酸hgene-794中的24种、任23种、任22种、任21种、任20种、任19种、任18种、任17种、任16种、任15种、任14种、任13种、任12种、任11种、任10种、任9种、任8种、任7种、任6种、任5种、任4种、任3种、任2种或任1种。

所述寡聚核酸ngene-119、所述寡聚核酸ngene-1321、所述寡聚核酸ngene-476、所述寡聚核酸ngene-749、所述寡聚核酸ngene-316、所述寡聚核酸ngene-541、所述寡聚核酸ngene-1091、所述寡聚核酸ngene-435、所述寡聚核酸ngene-927、所述寡聚核酸fgene-866、所述寡聚核酸fgene-1825、所述寡聚核酸fgene-792、所述寡聚核酸fgene-685、所述寡聚核酸fgene-1279、所述寡聚核酸fgene-485、所述寡聚核酸hgene-416、所述寡聚核酸hgene-1447、所述寡聚核酸hgene-1664、所述寡聚核酸hgene-492、所述寡聚核酸hgene-947、所述寡聚核酸hgene-1488、所述寡聚核酸hgene-1373、所述寡聚核酸hgene-1332和所述寡聚核酸hgene-794均为具有粘末端的双链dna分子。

所述寡聚核酸ngene-119由序列表中的序列1所示单链dna分子和序列表的序列2所示的单链dna分子组成。

所述寡聚核酸ngene-1321由序列表中的序列3所示单链dna分子和序列表的序列4所示单链dna分子组成。

所述寡聚核酸ngene-476由序列表中的序列5所示单链dna分子和序列表的序列6所示单链dna分子组成。

所述寡聚核酸ngene-749由序列表中的序列7所示单链dna分子和序列表的序列8所示单链dna分子组成。

所述寡聚核酸ngene-316由序列表中的序列9所示单链dna分子和序列表的序列10所示单链dna分子组成。

所述寡聚核酸ngene-541由序列表中的序列11所示单链dna分子和序列表的序列12所示单链dna分子组成。

所述寡聚核酸ngene-1091由序列表中的序列13所示单链dna分子和序列表的序列14所示单链dna分子组成。

所述寡聚核酸ngene-435由序列表中的序列15所示单链dna分子和序列表的序列16所示单链dna分子组成。

所述寡聚核酸ngene-927由序列表中的序列17所示单链dna分子和序列表的序列18所示单链dna分子组成。

所述寡聚核酸fgene-866由序列表中的序列19所示单链dna分子和序列表的序列20所示单链dna分子组成。

所述寡聚核酸fgene-1825由序列表中的序列21所示单链dna分子和序列表的序列22所示单链dna分子组成。

所述寡聚核酸fgene-792由序列表中的序列23所示单链dna分子和序列表的序列24所示单链dna分子组成。

所述寡聚核酸fgene-685由序列表中的序列25所示单链dna分子和序列表的序列26所示单链dna分子组成。

所述寡聚核酸fgene-1279由序列表中的序列27所示单链dna分子和序列表的序列28所示单链dna分子组成。

所述寡聚核酸fgene-485由序列表中的序列29所示单链dna分子和序列表的序列30所示单链dna分子组成。

所述寡聚核酸hgene-416由序列表中的序列31所示单链dna分子和序列表的序列32所示单链dna分子组成。

所述寡聚核酸hgene-1447由序列表中的序列33所示单链dna分子和序列表的序列34所示单链dna分子组成。

所述寡聚核酸hgene-1664由序列表中的序列35所示单链dna分子和序列表的序列36所示单链dna分子组成。

所述寡聚核酸hgene-492由序列表中的序列37所示单链dna分子和序列表的序列38所示单链dna分子组成。

所述寡聚核酸hgene-947由序列表中的序列39所示单链dna分子和序列表的序列40所示单链dna分子组成。

所述寡聚核酸hgene-1488由序列表中的序列41所示单链dna分子和序列表的序列42所示单链dna分子组成。

所述寡聚核酸hgene-1373由序列表中的序列43所示单链dna分子和序列表的序列44所示单链dna分子组成。

所述寡聚核酸hgene-1332由序列表中的序列45所示单链dna分子和序列表的序列46所示单链dna分子组成。

所述寡聚核酸hgene-794由序列表中的序列47所示单链dna分子和序列表的序列48所示单链dna分子组成。

上述寡聚核酸组合中，所述寡聚核酸ngene-119、所述寡聚核酸ngene-1321、所述寡聚核酸ngene-476、所述寡聚核酸ngene-749、所述寡聚核酸ngene-316、所述寡聚核酸ngene-541、所述寡聚核酸ngene-1091、所述寡聚核酸ngene-435、所述寡聚核酸ngene-927、所述寡聚核酸fgene-866、所述寡聚核酸fgene-1825、所述寡聚核酸fgene-792、所述寡聚核酸fgene-685、所述寡聚核酸fgene-1279、所述寡聚核酸fgene-485、所述寡聚核酸hgene-416、所述寡聚核酸hgene-1447、所述寡聚核酸hgene-1664、所述寡聚核酸hgene-492、所述寡聚核酸hgene-947、所述寡聚核酸hgene-1488、所述寡聚核酸hgene-1373、所述寡聚核酸hgene-1332或所述寡聚核酸hgene-794的核苷酸序列均可进行如下(a1)－(a4)中至少一种修饰：

(a1)3′末端和/或5′末端的修饰；

(a2)连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；

(a3)核糖的2′-oh的修饰；

(a4)碱基的修饰。

上述寡聚核酸组合中，所述(a1)中，所述3′末端和/或5′末端的修饰”具体可为5′末端p修饰、5′巯基、5′末端nh2修饰、5′末端chol修饰、5′末端me-dc修饰、5′末端tet修饰、5′末端biotin修饰、3′末端nh2修饰、3′末端chol修饰、3′末端bhq-1修饰、3′末端dabcyl修饰、5′末端c6s-s修饰或3′末端c6s-s修饰。

上述寡聚核酸组合中，所述(a2)中，所述“连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰”具体可为磷酸二酯键中的氧被硫取代。

上述寡聚核酸组合中，所述(a3)中，所述“核糖的2′-oh的修饰”具体可为甲氧基取代修饰、氟取代修饰或者脱氧修饰。

上述寡聚核酸组合中，所述(a1)中，所述“3′末端和/或5′末端的修饰”为3′末端进行胆固醇修饰和5′末端进行磷酸化修饰。

上述任一所述寡聚核酸组合具体可为组合一；所述组合一为所述寡聚核酸ngene-119、所述寡聚核酸ngene-476、所述寡聚核酸ngene-749、所述寡聚核酸ngene-435和所述寡聚核酸ngene-927。所述组合一中，所述寡聚核酸ngene-119、所述寡聚核酸ngene-476、所述寡聚核酸ngene-749、所述寡聚核酸ngene-435和所述寡聚核酸ngene-927的摩尔比可为1:1:1:1:1。

上述任一所述寡聚核酸组合具体可为组合二；所述组合二为所述寡聚核酸fgene-485、所述寡聚核酸fgene-685、所述寡聚核酸fgene-792和所述寡聚核酸fgene-1279。所述组合二中，所述寡聚核酸fgene-485、所述寡聚核酸fgene-685、所述寡聚核酸fgene-792和所述寡聚核酸fgene-1279的摩尔比可为1:1:1:1。

上述任一所述寡聚核酸组合具体可为组合三；所述组合三为所述寡聚核酸hgene-416、所述寡聚核酸hgene-947、所述寡聚核酸hgene-1373、所述寡聚核酸hgene-1447和所述寡聚核酸hgene-1664。所述组合三中，所述寡聚核酸hgene-416、所述寡聚核酸hgene-947、所述寡聚核酸hgene-1373、所述寡聚核酸hgene-1447和所述寡聚核酸hgene-1664的摩尔比可为1:1:1:1:1。

上述任一所述寡聚核酸组合具体可为组合四；所述组合四为所述寡聚核酸hgene-119、所述寡聚核酸fgene-485和所述寡聚核酸hgene-416。所述组合四中，所述寡聚核酸hgene-119、所述寡聚核酸fgene-485和所述寡聚核酸hgene-416的摩尔比可为1:1:1。

上述任一所述寡聚核酸组合具体可为所述寡聚核酸ngene-119、所述寡聚核酸ngene-1321、所述寡聚核酸ngene-476、所述寡聚核酸ngene-749、所述寡聚核酸ngene-316、所述寡聚核酸ngene-541、所述寡聚核酸ngene-1091、所述寡聚核酸ngene-435、所述寡聚核酸ngene-927、所述寡聚核酸fgene-866、所述寡聚核酸fgene-1825、所述寡聚核酸fgene-792、所述寡聚核酸fgene-685、所述寡聚核酸fgene-1279、所述寡聚核酸fgene-485、所述寡聚核酸hgene-416、所述寡聚核酸hgene-1447、所述寡聚核酸hgene-1664、所述寡聚核酸hgene-492、所述寡聚核酸hgene-947、所述寡聚核酸hgene-1488、所述寡聚核酸hgene-1373、所述寡聚核酸hgene-1332或所述寡聚核酸hgene-794。

编码上述任一所述寡聚核酸组合的dna分子也属于本发明的保护范围。

含有编码上述任一所述寡聚核酸组合的dna分子的表达盒、重组载体或重组菌也属于本发明的保护范围。

上述任一所述寡聚核酸组合、编码上述任一所述寡聚核酸组合的dna分子、或、含有编码上述任一所述寡聚核酸组合的dna分子的表达盒、重组载体或重组菌在如下(b1)－(b5)任一种的应用也属于本发明的保护范围：

(b1)抑制犬瘟热病毒复制；

(b2)制备用于治疗犬瘟热的药物；

(b3)抑制犬瘟热病毒生长；

(b4)制备用于预防犬瘟热发生或传播的药物；

(b5)促进犬瘟热病毒死亡或灭活。

上述应用中，所述(b1)中，抑制犬瘟热病毒复制的药物可为抑制犬瘟热病毒核酸复制的药物。

上述应用中，所述犬瘟热可为犬瘟热病毒引起的疾病。

上述应用中，所述犬瘟热病毒可具体为犬瘟热弱毒cdv3-cl株。犬瘟热弱毒cdv3-cl株具体可为吉林特研生物技术有限责任公司的产品，产品名称为水貂犬瘟热活疫苗。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种药物。

本发明所提供的药物，具有如下(b1)－(b5)功能中至少一种，其活性成分为上述任一所述寡聚核酸组合、编码上述任一所述寡聚核酸组合的dna分子、或、含有编码上述任一所述寡聚核酸组合的dna分子的表达盒、重组载体或重组菌；

(b1)抑制犬瘟热病毒复制；

(b2)制备用于治疗犬瘟热的药物；

(b3)抑制犬瘟热病毒生长；

(b4)制备用于预防犬瘟热发生或传播的药物；

(b5)促进犬瘟热病毒死亡或灭活。

上述药物中，所述(b1)中，抑制犬瘟热病毒复制的药物可为抑制犬瘟热病毒核酸复制的药物。

上述药物中，所述犬瘟热可为犬瘟热病毒引起的疾病。

上述药物中，所述犬瘟热病毒可具体为犬瘟热弱毒cdv3-cl株。犬瘟热弱毒cdv3-cl株具体可为吉林特研生物技术有限责任公司的产品，产品名称为水貂犬瘟热活疫苗。

上述药物中，所述药物还可包括药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体可为lipofectamine2000；所述药物中，所述寡聚核酸组合和所述lipofectamine2000的配比为(20-60)pmol：1μl。所述lipofectamine2000可为thermofisher-invitrogen公司的产品，货号为11668-027。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种抑制犬瘟热病毒复制的方法。

本发明所提供的抑制犬瘟热病毒复制的方法，包括如下步骤：在受体中表达上述任一所述寡聚核酸组合。

上述方法中，抑制犬瘟热病毒复制可为抑制犬瘟热病毒核酸复制。

上述方法中，所述受体可为感染犬瘟热病毒的受体细胞。

上述方法中，所述犬瘟热病毒可具体为犬瘟热弱毒cdv3-cl株。犬瘟热弱毒cdv3-cl株具体可为吉林特研生物技术有限责任公司的产品，产品名称为水貂犬瘟热活疫苗。

上述方法中，所述受体细胞可为vero细胞。所述vero细胞可为中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库的产品，产品目录号为gno10。

上述方法中，所述“在受体中表达上述任一所述寡聚核酸组合”具体可为重组质粒pcdna3.1－n和上述任一所述寡聚核酸组合共转染受体、重组质粒pcdna3.1－f和上述任一所述寡聚核酸组合共转染受体或重组质粒pcdna3.1－h和上述任一所述寡聚核酸组合共转染受体。所述受体可为293t细胞。所述293t细胞可为中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库的产品，货号为gnhu17。

所述重组质粒pcdna3.1－n为将载体pcdna3.1+的限制性内切酶hindⅲ和ecorⅰ识别序列间的片段替换为序列表中序列49自5’末端起第12至1583位所示的dna分子，得到的重组质粒。

所述重组质粒pcdna3.1－h为将载体pcdna3.1+的限制性内切酶hindⅲ和ecorⅰ识别序列间的片段替换为序列表中序列50自5’末端起第12至1835位所示的dna分子，得到的重组质粒。

所述重组质粒pcdna3.1－f为将载体pcdna3.1+的限制性内切酶hindⅲ和ecorⅰ识别序列间的片段替换为序列表中序列51自5’末端起第12至2000位所示的dna分子，得到的重组质粒。

实验证明，上述组合一、组合二、组合三和组合四均可抑制感染犬瘟热弱毒cdv3-cl株的复制；组合一可抑制感染犬瘟热弱毒cdv3-cl株的vero细胞中n基因的相对表达量；组合二可抑制感染犬瘟热弱毒cdv3-cl株的vero细胞中f基因的相对表达量，组合三可抑制感染犬瘟热弱毒cdv3-cl株的vero细胞中h基因的相对表达量，组合四可抑制感染犬瘟热弱毒cdv3-cl株的vero细胞中n基因、f基因和h基因的相对表达量。因此，利用本发明提供的寡聚核酸组合，可抑制犬瘟热病毒复制，对预防或治疗犬瘟热具有重要的应用价值。

附图说明

图1为n基因的相对表达量。

图2为f基因的相对表达量。

图3为h基因的相对表达量。

图4为实施例3中光学显微镜的观察结果。

图5为实施例3中n基因、f基因或h基因的相对表达量的检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

10×pfubuffer(含mg²⁺)和pfudnapolymerase均为takara公司的产品，产品目录号分别为9151a和rr001b。dna凝胶回收试剂盒为生工生物工程(上海)股份有限公司的产品，产品目录号为sk8131。载体pcdna3.1+为thermofisher公司的产品，产品目录号为v79020。dmem培养基和fbs均为gibco公司的产品。opti-mem培养基为gibco公司的产品，产品目录号为#31985-070。lipofectamine2000为thermofisher-invitrogen公司产品，货号为11668-027。293t细胞为中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库的产品，货号为gnhu17。犬瘟热弱毒cdv3-cl株为吉林特研生物技术有限责任公司的产品，产品名称为水貂犬瘟热活疫苗。vero细胞为中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库的产品，产品目录号为gno10。

实施例1、修饰的寡聚核酸的制备

由上海吉玛制药技术有限公司合成表1所示的正义链和反义链。

用去离子水将正义链稀释，得到正义链稀释液。用去离子水将反义链稀释，得到反义链稀释液。取正义链稀释液和相应的反义链稀释液，进行退火反应，形成寡聚核酸。将各个寡聚核酸的3′末端进行胆固醇修饰，5′末端进行磷酸化修饰，得到修饰的寡聚核酸。

本实施例共制备表1所示的28个寡聚核酸。各个寡聚核酸中的a、g、c和u依次表示腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸和尿嘧啶核糖核苷酸，t表示胸腺嘧啶脱氧核苷酸。

阴性对照寡聚核酸1和阴性对照寡聚核酸2的核苷酸序列均为随机序列。

表1

实施例2、实施例1制备的修饰的寡聚核酸对cdv的n基因、f基因和h基因的相对表达量的影响

一、重组质粒的构建

1、重组质粒pcdna3.1－n的构建

(1)根据cdv的n基因的核苷酸序列(sequenceid:gb|eu409838.1|或genebank：eu409838.1)，设计并由上海吉玛制药技术有限公司合成序列表中序列49所示的dna片段。序列49自5’末端起第1至11位为保护性碱基和限制性内切酶hindⅲ的识别序列，第12至1583位为n基因的核苷酸序列，第1584至1594位为保护性碱基和限制性内切酶ecorⅰ的识别序列。

(2)用限制性内切酶hindⅲ和ecorⅰ双酶切步骤(1)合成的dna片段，用dna凝胶回收试剂盒回收酶切产物。

(3)用限制性内切酶hindⅲ和ecorⅰ双酶切载体pcdna3.1+，用dna凝胶回收试剂盒回收约5400bp的载体骨架。

(4)将酶切产物和载体骨架进行连接，获得重组质粒pcdna3.1－n。

根据测序结果，对重组质粒pcdna3.1－n进行结构描述如下：将载体pcdna3.1+的限制性内切酶hindⅲ和ecorⅰ识别序列间的片段替换为序列表中序列49自5’末端起第12至1583位所示的dna分子。重组质粒pcdna3.1－n含有cdv的n基因的核苷酸序列，表达核衣壳蛋白(genebank：abz79285.1)。

2、重组质粒pcdna3.1－h的构建

(1)根据cdv的h基因的核苷酸序列(genebank：hq128601.1)，设计并由上海吉玛制药技术有限公司合成序列表中序列50所示的dna片段。序列50自5’末端起第1至11位为保护性碱基和限制性内切酶hindⅲ的识别序列，第12至1835位为n基因的核苷酸序列，第1836至1846位为保护性碱基和限制性内切酶ecorⅰ的识别序列。

(2)用限制性内切酶hindⅲ和ecorⅰ双酶切步骤(1)合成的dna片段，用dna凝胶回收试剂盒回收酶切产物。

(3)用限制性内切酶hindⅲ和ecorⅰ双酶切载体pcdna3.1+，用dna凝胶回收试剂盒回收约5400bp的载体骨架。

(4)将酶切产物和载体骨架进行连接，获得重组质粒pcdna3.1－h。

根据测序结果，对重组质粒pcdna3.1－h进行结构描述如下：将载体pcdna3.1+的限制性内切酶hindⅲ和ecorⅰ识别序列间的片段替换为序列表中序列50自5’末端起第12至1835位所示的dna分子。重组质粒pcdna3.1－h含有cdv的h基因的核苷酸序列，表达血凝素蛋白(genebank：adv76478.1)。

3、重组质粒pcdna3.1－f的构建

(1)根据cdv的f基因的核苷酸序列(genebank：eu327874.1)，设计并由上海吉玛制药技术有限公司合成序列表中序列51所示的dna片段。序列51自5’末端起第1至11位为保护性碱基和限制性内切酶hindⅲ的识别序列，第12至2000位为n基因的核苷酸序列，第2001至2011位为保护性碱基和限制性内切酶ecorⅰ的识别序列。

(2)用限制性内切酶hindⅲ和ecorⅰ双酶切步骤(1)合成的dna片段，用dna凝胶回收试剂盒回收酶切产物。

(3)用限制性内切酶hindⅲ和ecorⅰ双酶切载体pcdna3.1+，用dna凝胶回收试剂盒回收约5400bp的载体骨架。

(4)将酶切产物和载体骨架进行连接，获得重组质粒pcdna3.1－f。

根据测序结果，对重组质粒pcdna3.1－f进行结构描述如下：将载体pcdna3.1+的限制性内切酶hindⅲ和ecorⅰ识别序列间的片段替换为序列表中序列51自5’末端起第12至2000位所示的dna分子。重组质粒pcdna3.1－f含有cdv的f基因的核苷酸序列，表达融合蛋白(genebank：aby49137.1)。

二、实施例1制备的修饰的寡聚核酸对cdv的n基因、f基因和h基因的相对表达量的影响

1、实施例1制备的修饰的寡聚核酸对cdv的n基因的相对表达量的影响

(1)将实施例1制备的修饰的寡聚核酸(ngene-119、ngene-1321、ngene-476、ngene-316、ngene-541、ngene-1091、ngene-435、ngene-927、ngene-749、对照寡聚核酸1、对照寡聚核酸2、阴性对照寡聚核酸1或阴性对照寡聚核酸2)，用depc水分别溶解至20μmmol/l，得到修饰的寡聚核酸溶液。

(2)取处于对数生长期的293t细胞，用胰酶消化，然后用含10％(体积百分比)fbs的dmem培养基中培养，获得浓度为5×10⁶个/ml的细胞悬浮液。

(3)完成步骤(2)后，将所述细胞悬浮液接种于6孔板，每孔接种1ml(约5×10⁶个293t细胞)，然后置于37℃、5％co2培养箱中培养18h，使293t细胞贴壁。

(4)完成步骤(3)后，将所述6孔板中的培养基更换为500μlopti-mem培养基，然后加入5μg重组质粒pcdna3.1－n和10μl步骤(1)获得的修饰的寡聚核酸溶液，进行共转染(共转染过程中，转染试剂为lipofectamine2000，培养基为opti-mem培养基，共转染的步骤参考lipofectamin2000说明书)，然后置于37℃、5％co2培养箱中孵育5h。

(5)完成步骤(4)后，将所述6孔板中的培养基更换为新的opti-mem培养基，置于37℃、5％co2培养箱中继续培养24h；然后用胰酶消化，加入1ml的100mm、ph7.0的pbs缓冲液洗涤一次，1000rpm离心3min，得到沉淀。沉淀即为重组质粒pcdna3.1－n和步骤(1)获得的修饰的寡聚核酸溶液共转染后的293t细胞组，简称n-1293t细胞组。

按照步骤(5)的方法，将24h替换为48h，其它步骤均不变，得到n-2293t细胞组。

按照步骤(5)的方法，将24h替换为72h，其它步骤均不变，得到n-3293t细胞组。

(6)提取n293t细胞组(n-1293t细胞组、n-2293t细胞组或n-3293t细胞组)的总rna，然后用逆转录酶进行反转录(反应程序为：26℃30min；42℃30min；85℃10min)，得到cdna，向上述cdna加入ddh2o稀释，得到cdna浓度为1000ng/μl的模板溶液。

(7)以步骤(6)得到的模板溶液为模板，通过荧光定量pcr检测n293t细胞组中n基因的相对表达量(以b-actin基因为内参基因)。

鉴定n基因的引物为5’-aggtaatcccaagcatcaactctgt-3’和5’-ttcgacccttcgtctacaattttg-3’。鉴定b-actin基因的引物为actin-f：5’-ccctggcacccagcac-3’和actin-r：5’-gccgatccacacggagtac-3’。

n－1293t细胞组中，将重组质粒pcdna3.1－n和阴性对照寡聚核酸1共转染后的293t细胞组中n基因的相对表达量作为1，重组质粒pcdna3.1－n和其它寡聚核酸共转染后的293t细胞组中n基因的相对表达量的部分结果见图1中a。n－2293t细胞组中，将重组质粒pcdna3.1－n和阴性对照寡聚核酸1共转染后的293t细胞组中n基因的相对表达量作为1，重组质粒pcdna3.1－n和其它寡聚核酸共转染后的293t细胞组中n基因的相对表达量的部分结果见图1中b。n－3293t细胞组中，将重组质粒pcdna3.1－n和阴性对照寡聚核酸1共转染后的293t细胞组中n基因的相对表达量作为1，重组质粒pcdna3.1－n和其它寡聚核酸共转染后的293t细胞组中n基因的相对表达量的部分结果见图1中c。图1中，ngene为转染阴性对照寡聚核酸1，ngene-119为转染ngene-119，ngene-1321为转染ngene-1321，ngene-476为转染ngene-476，ngene-316为转染ngene-316，ngene-541为转染ngene-541，ngene-1091为转染ngene-1091，ngene-435为转染ngene-435，ngene-927为转染ngene-927。

结果表明，本发明所提供的ngene-119、ngene-1321、ngene-476、ngene-316、ngene-541、ngene-1091、ngene-435、ngene-927和ngene-749均可使n基因的相对表达量降低，即干扰效率高；且干扰时间越长，干扰效率越高。对照寡聚核酸1、对照寡聚核酸2、阴性对照寡聚核酸1或阴性对照寡聚核酸2不能使n基因的相对表达量降低，即不能对n基因形成干扰。

2、实施例1制备的修饰的寡聚核酸对cdv的f基因的相对表达量的影响

(1)将实施例1制备的修饰的寡聚核酸(fgene-866、fgene-1825、fgene-792、fgene-685、fgene-1279、fgene-485、对照寡聚核酸1、对照寡聚核酸2、阴性对照寡聚核酸1或阴性对照寡聚核酸2)，用depc水分别溶解至20μmmol/l，得到修饰的寡聚核酸溶液。

(2)同步骤1中(2)。

(3)同步骤1中(3)。

(4)完成步骤(3)后，将所述6孔板中的培养基更换为500μlopti-mem培养基，然后加入5μg重组质粒pcdna3.1－f和10μl步骤(1)获得的修饰的寡聚核酸溶液，进行共转染(共转染过程中，转染试剂为lipofectamine2000，培养基为opti-mem培养基，共转染的步骤参考lipofectamin2000说明书)，然后置于37℃、5％co2培养箱中孵育5h。

(5)完成步骤(4)后，将所述6孔板中的培养基更换为新的opti-mem培养基，置于37℃、5％co2培养箱中继续培养24h；然后用胰酶消化，加入1ml的100mm、ph7.0的pbs缓冲液洗涤一次，1000rpm离心3min，得到沉淀。沉淀即为重组质粒pcdna3.1－f和步骤(1)获得的修饰的寡聚核酸溶液共转染后的293t细胞组，简称f-1293t细胞组。

按照步骤(5)的方法，将24h替换为48h，其它步骤均不变，得到f-2293t细胞组。

按照步骤(5)的方法，将24h替换为72h，其它步骤均不变，得到f-3293t细胞组。

(6)提取f293t细胞组(f-1293t细胞组、f-2293t细胞组或f-3293t细胞组)的总rna，然后用逆转录酶进行反转录(反应程序为：26℃30min；42℃30min；85℃10min)，得到cdna，向上述cdna加入ddh2o稀释，得到cdna浓度为1000ng/μl的模板溶液。

(7)以步骤(6)得到的模板溶液为模板，通过荧光定量pcr检测f293t细胞组中f基因的相对表达量(以b-actin基因为内参基因)。

鉴定f基因的引物为5’-gcaaactagccacagatcggataac-3’和5’-tcgctccttgggtgacactctc-3’。鉴定b-actin基因的引物为actin-f：5’-ccctggcacccagcac-3’和actin-r：5’-gccgatccacacggagtac-3’。

f－1293t细胞组中，将重组质粒pcdna3.1－f和阴性对照寡聚核酸1共转染后的293t细胞组中f基因的相对表达量作为1，重组质粒pcdna3.1－f和其它寡聚核酸共转染后的293t细胞组中f基因的相对表达量的部分结果见图2中a。f－2293t细胞组中，将重组质粒pcdna3.1－f和阴性对照寡聚核酸1共转染后的293t细胞组中f基因的相对表达量作为1，重组质粒pcdna3.1－f和其它寡聚核酸共转染后的293t细胞组中f基因的相对表达量的部分结果见图2中b。f－3293t细胞组中，将重组质粒pcdna3.1－f和阴性对照寡聚核酸1共转染后的293t细胞组中f基因的相对表达量作为1，重组质粒pcdna3.1－f和其它寡聚核酸共转染后的293t细胞组中f基因的相对表达量的部分结果见图2中c。

结果表明，本发明所提供的fgene-866、fgene-1825、fgene-792、fgene-685、fgene-1279和fgene-485均可使f基因的相对表达量降低，即干扰效率高；且干扰时间越长，干扰效率越高。对照寡聚核酸1、对照寡聚核酸2、阴性对照寡聚核酸1或阴性对照寡聚核酸2不能使f基因的相对表达量降低，即不能对f基因形成干扰。

3、实施例1制备的修饰的寡聚核酸对cdv的h基因的相对表达量的影响

(1)将实施例1制备的修饰的寡聚核酸(hgene-416、hgene-1447、hgene-1664、hgene-492、hgene-947、hgene-1488、hgene-1373、hgene-1332、hgene-794、对照寡聚核酸1、对照寡聚核酸2、阴性对照寡聚核酸1或阴性对照寡聚核酸2)，用depc水分别溶解至20μmmol/l，得到修饰的寡聚核酸溶液。

(2)同步骤1中(2)。

(3)同步骤1中(3)。

(4)完成步骤(3)后，将所述6孔板中的培养基更换为500μlopti-mem培养基，然后加入5μg重组质粒pcdna3.1－h和10μl步骤(1)获得的修饰的寡聚核酸溶液，进行共转染(共转染过程中，转染试剂为lipofectamine2000，培养基为opti-mem培养基，共转染的步骤参考lipofectamin2000说明书)，然后置于37℃、5％co2培养箱中孵育5h。

(5)完成步骤(4)后，将所述6孔板中的培养基更换为新的opti-mem培养基，置于37℃、5％co2培养箱中继续培养24h；然后用胰酶消化，加入1ml的100mm、ph7.0的pbs缓冲液洗涤一次，1000rpm离心3min，得到沉淀。沉淀即为重组质粒pcdna3.1－h和步骤(1)获得的修饰的寡聚核酸溶液共转染后的293t细胞组，简称h-1293t细胞组。

按照步骤(5)的方法，将24h替换为48h，其它步骤均不变，得到h-2293t细胞组。

按照步骤(5)的方法，将24h替换为72h，其它步骤均不变，得到h-3293t细胞组。

(6)提取h293t细胞组(h-1293t细胞组、h-2293t细胞组或h-3293t细胞组)的总rna，然后用逆转录酶进行反转录(反应程序为：26℃30min；42℃30min；85℃10min)，得到cdna，向上述cdna加入ddh2o稀释，得到cdna浓度为1000ng/μl的模板溶液。

(7)以步骤(6)得到的模板溶液为模板，通过荧光定量pcr检测h293t细胞组中h基因的相对表达量(以b-actin基因为内参基因)。

鉴定h基因的引物为5’-gcagagtattccccctatccgtatc-3’和5’-actccgtctgagatagcggttagc-3’。鉴定b-actin基因的引物为actin-f：5’-ccctggcacccagcac-3’和actin-r：5’-gccgatccacacggagtac-3’。

h－1293t细胞组中，将重组质粒pcdna3.1－h和阴性对照寡聚核酸1共转染后的293t细胞组中h基因的相对表达量作为1，重组质粒pcdna3.1－h和其它寡聚核酸共转染后的293t细胞组中h基因的相对表达量的部分结果见图3中a。h－2293t细胞组中，将重组质粒pcdna3.1－h和阴性对照寡聚核酸1共转染后的293t细胞组中h基因的相对表达量作为1，重组质粒pcdna3.1－h和其它寡聚核酸共转染后的293t细胞组中h基因的相对表达量的部分结果见图3中b。h－3293t细胞组中，将重组质粒pcdna3.1－h和阴性对照寡聚核酸1共转染后的293t细胞组中h基因的相对表达量作为1，重组质粒pcdna3.1－h和其它寡聚核酸共转染后的293t细胞组中h基因的相对表达量的部分结果见图3中c。

结果表明，本发明所提供的hgene-416、hgene-1447、hgene-1664、hgene-492、hgene-947、hgene-1488、hgene-1373、hgene-1332和hgene-794均可使h基因的相对表达量降低，即干扰效率高；且干扰时间越长，干扰效率越高。对照寡聚核酸1、对照寡聚核酸2、阴性对照寡聚核酸1或阴性对照寡聚核酸2不能使h基因的相对表达量降低，即不能对h基因形成干扰。

实施例3、实施例1制备的修饰的寡聚核酸对感染犬瘟热弱毒cdv3-cl株的vero细胞病毒复制抑制作用

一、干扰组合物的制备

1、干扰组合物1

取实施例1制备的ngene-119、ngene-476、ngene-749、ngene-435和ngene-927，按照1:1:1:1:1的摩尔比进行混合，得到干扰组合物1。

2、干扰组合物2

取实施例1制备的fgene-485、fgene-685、fgene-792和fgene-1279，按照1:1:1:1的摩尔比进行混合，得到干扰组合物2。

3、干扰组合物3

取实施例1制备的hgene-416、hgene-947、hgene-1373、hgene-1447和hgene-1664，按照1:1:1:1:1的摩尔比进行混合，得到干扰组合物3。

4、干扰组合物4

取实施例1制备的hgene-119、fgene-485和hgene-416，按照1:1:1的摩尔比进行混合，得到干扰组合物4。

5、干扰组合物5

取实施例1制备的对照寡聚核酸1、对照寡聚核酸2、阴性对照寡聚核酸1和阴性对照寡聚核酸2，按照1:1:1:1的摩尔比进行混合，得到干扰组合物5。

二、干扰组合物对感染犬瘟热弱毒cdv3-cl株的vero细胞复制的抑制作用

1、用犬瘟热弱毒cdv3-cl株侵染vero细胞，得到感染犬瘟热弱毒cdv3-cl株的vero细胞。

2、取感染犬瘟热弱毒cdv3-cl株的vero细胞，置于dmem培养基中培养，获得浓度为5×10⁶个/ml的细胞悬浮液。

3、完成步骤2后，将所述细胞悬浮液接种于6孔板，每孔接种1ml(约5×10⁶个感染犬瘟热弱毒cdv3-cl株的vero细胞)，然后置于37℃、5％co2培养箱中培养24h，使感染犬瘟热弱毒cdv3-cl株的vero细胞贴壁。

4、完成步骤3后，将所述6孔板中的培养基更换为500μlopti-mem培养基，然后加入5μg步骤一制备的干扰组合物1，进行转染(转染过程中，转染试剂为lipofectamine2000，培养基为opti-mem培养基，共转染的步骤参考lipofectamin2000说明书)，然后置于37℃、5％co2培养箱中孵育5h，得到细胞培养物1。

按照上述步骤，将干扰组合物1分别替换为干扰组合物2、干扰组合物3、干扰组合物4和干扰组合物5，其它步骤均不变，得到细胞培养物2、细胞培养物3、细胞培养物4和细胞培养物5。

取vero细胞，置于dmem培养基中培养，获得浓度为5×10⁶个/ml的细胞悬浮液；将所述细胞悬浮液接种于6孔板，每孔接种1ml(约5×10⁶个vero细胞)，然后置于37℃、5％co2培养箱中培养24h，使vero细胞贴壁；将所述6孔板中的培养基更换为500μlopti-mem培养基，然后加入干扰组合物5，进行转染(转染过程中，转染试剂为lipofectamine2000，培养基为opti-mem培养基，共转染的步骤参考lipofectamin2000说明书)，然后置于37℃、5％co2培养箱中孵育5h，得到细胞培养物6，作为空白对照。

在光学显微镜下观察细胞培养物1、细胞培养物2、细胞培养物3、细胞培养物4、细胞培养物5或细胞培养物6中的细胞病变情况。

部分实验结果见图4(a为细胞培养物6，即干扰组合物5转染vero细胞；b为细胞培养物1，即干扰组合物1转染感染犬瘟热弱毒cdv3-cl株的vero细胞；c为细胞培养物2，即干扰组合物2转染感染犬瘟热弱毒cdv3-cl株的vero细胞；d为细胞培养物3，即干扰组合物3转染感染犬瘟热弱毒cdv3-cl株的vero细胞；e为细胞培养物5，即干扰组合物5转染感染犬瘟热弱毒cdv3-cl株的vero细胞)。结果表明，干扰组合物1、干扰组合物2、干扰组合物3和干扰组合物4均可抑制感染犬瘟热弱毒cdv3-cl株的vero细胞病毒复制。

提取细胞培养物(细胞培养物1、细胞培养物2、细胞培养物3、细胞培养物4或细胞培养物6)的总rna，然后用逆转录酶进行反转录，得到cdna，向上述cdna加入ddh2o稀释，得到cdna浓度为1000ng/μl的模板溶液。以该模板溶液为模板，通过荧光定量pcr检测细胞培养物中n基因、f基因或h基因的相对表达量(以hactb基因为内参基因)。鉴定n基因的引物为5’-aggtaatcccaagcatcaactctgt-3’和5’-ttcgacccttcgtctacaattttg-3’。鉴定h基因的引物为5’-gcagagtattccccctatccgtatc-3’和5’-actccgtctgagatagcggttagc-3’。鉴定f基因的引物为5’-gcaaactagccacagatcggataac-3’和5’-tcgctccttgggtgacactctc-3’。鉴定hactb基因的引物为5’-ccctggcacccagcac-3’和5’-gccgatccacacggagtac-3’。

将细胞培养物6中n基因的相对表达量作为1，细胞培养物1中n基因的相对表达量见图5。将细胞培养物6中f基因的相对表达量作为1，细胞培养物1中f基因的相对表达量见图5。将细胞培养物6中h基因的相对表达量作为1，细胞培养物1中h基因的相对表达量见图5。

结果表明，干扰组合物1可抑制感染犬瘟热弱毒cdv3-cl株的vero细胞中n基因的相对表达量，干扰组合物2可抑制感染犬瘟热弱毒cdv3-cl株的vero细胞中f基因的相对表达量，干扰组合物3可抑制感染犬瘟热弱毒cdv3-cl株的vero细胞中h基因的相对表达量，干扰组合物4可抑制感染犬瘟热弱毒cdv3-cl株的vero细胞中n基因、f基因和h基因的相对表达量。