一株防治灰霉病的放线菌菌株及其应用的制作方法

本发明属于农作物病害防治技术领域，特别涉及一株防治灰霉病的放线菌菌株及其应用。

背景技术：

作物灰霉病是由灰葡萄孢(botrytiscinerea)引起的一种世界性真菌病害，在全国各地普遍发生。其病原菌寄主范围十分广泛，能够侵染包括番茄、黄瓜、辣椒、草莓、葡萄等约200多种作物，不仅在植株生长期间发生严重，而且在采后的贮藏、运输过程中也发生严重。目前，灰霉病菌对传统杀菌剂的抗药性是农业生产上的最棘手的问题之一。其次，近些年大量化学农药的使用导致农产品出口受限、抗药性、环境污染等问题，还给生态环境、人类健康等造成严重威胁。目前，开发新型高效、广谱、低毒、环保的杀菌剂一直是农作物病害防治的难点和热点。因此，研发出可替代化学杀菌剂的生物源杀菌剂用灰霉菌的防治已刻不容缓。

放线菌(actinomycetes)是一类具有重要经济价值和实用价值的微生物，种类丰富，广泛分布于自然界中。土壤拮抗放线菌具有对环境友好、效果持久、针对性强等优点，展现出良好的应用前景。因此从番茄根际土壤中分离获得对番茄灰霉菌具有拮抗作用的放线菌，对该病害的防治具有重要意义，符合农业的可持续发展要求。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一株放线菌，该放线菌发酵液可抑制多种植物病原真菌及细菌，可用于开发新型高效、广谱、低毒、环保的生物农药。

本发明的再一目的在于提供所述的放线菌的发酵产物的制备方法。

本发明的又一目的在于提供通过所述的放线菌的发酵方法获得发酵产物。

本发明的另一目的在于提供所述的放线菌和/或其发酵产物在抑制病原菌方面的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一株放线菌，命名为焊灰直丝链霉菌(streptomyceschungwhensis)la-5，保藏编号为cctccno：m2017683，于2017年11月13日保藏在位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。

该菌株是发明人在山西运城市平陆县蔬菜大棚采集的土壤中分离得到的一株放线菌。

所述的放线菌的形态学特征为：在高氏一号培养基上，生长良好，培养10天后菌落扁平并呈现黑褐色，孢子丝颜色黑灰色，产咖啡色可溶性色素，菌落背面呈棕黑色；扫描电镜下观察，孢子为短圆柱形，表面光滑、链生；轴长约0.6μm，径长约1.0μm。

所述的放线菌的生理生化特征：该菌株能使明胶液化，能水解淀粉，纤维素上能够生长、产生硫化氢；能利用鼠李糖、甘露糖、蔗糖、d-果糖、d-木糖以及d-葡萄糖；不能利用肌醇、阿拉伯糖、山梨醇、棉籽糖和甘露醇。

所述的放线菌的16srdna基因特征：其16srdna序列如seqidno.1的核苷酸序列所示，序列长度为1391bp。

经形态学特征、培养特征观察和分子生物学(菌株经培养后提取dna，扩增并测定16srdna的序列，构建系统发育树分析)研究鉴定，将该菌株归属于焊灰直丝链霉菌(streptomyceschungwhensis)。

所述的放线菌发酵产物的制备方法，包括如下步骤：

(1)种子液的制备：将活化后的放线菌接种于发酵培养基，28℃下160～180rpm培养48～60h，得到种子液；

(2)发酵培养：以10％(v/v)的接种量接种于发酵培养基，装瓶量60ml/250ml，于28℃，180r/min条件下摇床培养7天，得到所述的放线菌发酵产物。

所述的发酵培养基为：可溶性淀粉20g，酵母粉1g，nacl0.5g，k2hpo40.5g，mgso40.5g，feso40.01g，水1000ml，ph7.2～7.4。

所述的活化的方式优选为：于28℃～30℃条件下，在高氏一号培养基培养，直至菌丝和孢子生长成熟。

所述的高氏一号培养基的配方优选为：kno31g，k2hpo40.5g，mgso40.5g，nacl0.5g，feso40.01g，可溶性淀粉20g，琼脂粉15g，蒸馏水1000ml，ph7.2～7.4；于115～121℃灭菌30min。

通过所述的制备方法制备得到的发酵产物。

所述的放线菌和/或其发酵产物具有抑制多种植物病原菌的生物活性。

所述的植物病原菌包括植物病原真菌和/或植物病原细菌。

所述的农作物病原菌包括灰霉病菌(botrytiscinerea)、黄瓜枯萎病菌(fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)、瓜果腐霉菌(pythiumaphanidermatum)、辣椒疫霉菌(phytophthoracapsici)、棉花枯萎病(fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum)、苹果炭疽病菌(colletotrichumgloeosporioides)、玉米叶斑病菌(mycosphaerellamaydis)、立枯丝核菌(rhizoctoniasolani)、番茄青枯病菌(pseudomanassolanacearum)、花椰菜软腐病菌(erwiniacarotovorasubsp.carotovora)、马铃薯黑胫病菌(erwiniacarotovorasubsp.atroseptica)、细菌性流胶病菌(pseudomonassyringaepv.syringae)中的一种或至少两种。

所述的放线菌和/或其发酵产物在制备植物病害微生物杀菌剂中的应用。

一种防治植物病害的微生物杀菌剂，含有所述的放线菌和/或其发酵产物。

所述的微生物杀菌剂的使用方法优选为喷雾。

所述的植物病害优选为灰霉病。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明提供一种新的放线菌菌株la-5。该菌株抗菌谱广，对多种植物病原真菌及细菌具有一定的抑制作用。该菌株发酵液不但对灰霉病菌、黄瓜枯萎病菌、棉花枯萎病菌、瓜果腐霉菌、立枯丝核菌等真菌有较好的抑制作用，还对花椰菜软腐病菌、番茄青枯病菌等病原细菌具有一定的生物活性。该菌株可作为研制高效、广谱、低毒、环保的微生物杀菌剂的生物材料。

(2)本发明还提供了菌株la-5具有杀菌活性的发酵液的制备条件。发酵条件：28℃，180r/min，培养7d；培养基组成为：可溶性淀粉20g，酵母粉1g，nacl0.5g，k2hpo40.5g，mgso40.5g，feso40.01g，水1000ml，ph7.2～7.4。

(3)本发明生防放线菌la-5分离自蔬菜大棚番茄根际土壤，与土壤生态和谐相容，有利于充分发挥菌株的优势。该生防放线菌菌株培养条件简单，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。

附图说明

图1是本发明所述的放线菌菌株la-5的菌落形态图。

图2是本发明所述的放线菌菌株la-5孢子照片图；其中，a为光学显微镜下的孢子形态，b为扫描电镜下孢子形态。

图3是本发明所述放线菌菌株la-5对番茄灰霉菌平板抑菌效果图。

图4是本发明所述放线菌菌株la-5发酵液对番茄灰霉菌抑制效果图。

图5是本发明所述放线菌菌株la-5与相关菌株依据16srdna序列构建的系统发育树图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中所用培养基配方如下：

高氏一号培养基：kno31g，k2hpo40.5g，mgso40.5g，nacl0.5g，feso40.01g，可溶性淀粉20g，琼脂粉15g，蒸馏水1000ml，ph7.2～7.4；

察氏培养基：蔗糖30g、nano32g、k2hpo41g、feso40.01g、琼脂15g、mgso4·7h2o0.5g、kcl0.5g、蒸馏水1000ml，ph7.2～7.4；

葡萄糖天门冬素琼脂培养基：葡萄糖10g、琼脂15g、k2hpo40.5g、天门冬素0.5g、蒸馏水1000ml，ph7.2～7.4；

淀粉铵琼脂培养基：(nh4)2so42g、caco33g、k2hpo41g、淀粉10g、mgso41g、琼脂15g、nacl1g，蒸馏水1000ml；

葡萄糖酵母膏培养基：葡萄糖10g、酵母膏10g、牛肉膏4g、蛋白胨4g、nacl2.5g，蒸馏水1000ml；

pda培养基：马铃薯浸汁(取200g马铃薯切成小块，置1000ml水中煮1小时，然后过滤取滤液，再用水稀释到总体积1000ml)、琼脂15g、葡萄糖10g、ph值7.2～7.4；

燕麦琼脂培养基：燕麦粉20g、迹量盐溶液1ml(mgso4·7h2o0.1g、mncl2·4h2o0.1g、znso4·7h2o0.1g，蒸馏水1000ml)、琼脂18％，用蒸馏水补充至1000ml；

na培养基：牛肉膏3g、酵母膏1g、蛋白胨5g、葡萄糖10g，琼脂15g蒸馏水定容至1000ml，ph为7.2～7.4。

实施例1菌株la-5的分离和鉴定

1.土壤样品的采集

从山西省运城市平陆县某蔬菜种植大棚采集番茄地块5～10cm深处的根围土壤，分装标记后带回实验室，自然风干后待用。

2.放线菌的分离

采用平板稀释法进行分离。将风干土样用研钵磨碎，称取10g倒入装有90ml无菌水的三角瓶中，28℃，180r/min震荡30min后静置5分钟，得到原液。取原液1ml并以10倍梯度稀释，分别配制成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的悬浮液，吸取不同浓度的悬浮液各0.2ml加到高氏一号培养基(含30mg/l的k2gro7)平板上，均匀涂布后置于28℃培养观察，5～7天后挑取不同的单菌落划线纯化。将纯化后的菌株转接到高氏一号斜面培养基上培养，4℃保存备用，共分离得到15株放线菌。经过实施例3中的平皿拮抗和抑菌圈实验，筛选得到具有广泛抗菌谱的放线菌株la-5。

3.菌株la-5的鉴定

(1)形态特征观察

菌株la-5在大多数培养基上生长良好(见表1)，在高氏一号培养基上菌落扁平状，黑褐色，孢子丝颜色黑灰色，培养10天后产咖啡色可溶性色素(图1)，菌落背面呈棕黑色；光学显微镜下基丝不断裂、气生菌丝形成孢子丝，孢子丝直、柔曲；在扫描电镜下观察，孢子为短圆柱形，表面光滑、链生；轴长约0.6μm，径长约1.0μm(图2)。

表1la-5菌株的培养特征

注:+++表示生长很好，++表示生长良好，+表示可以生长

(2)生理生化特征

参考lechevalie的方法(lechevalieretal，1980)测定菌株的明胶液化、淀粉水解、牛奶的凝固与胨化、纤维素水解、碳源利用等特性。

该菌株能使明胶液化，能水解淀粉，纤维素上能够生长、产生硫化氢；能利用鼠李糖、甘露糖、蔗糖、d-果糖、d-木糖以及d-葡萄糖；不能利用肌醇、阿拉伯糖、山梨醇、棉籽糖和甘露醇。

(3)采用16srdna基因测序法对菌株la-5进行分子鉴定

16srdna序列测定委托上海生工生物工程股份有限公司进行。

具体测序方法如下：用溶菌酶法从新鲜菌体中提取基因组dna，采用通用引物(27f和1492r)进行16srdna扩增，pcr产物经检测后测序，16srdna序列如下所示：

gctcctccccacaagggggttgggccaccggcttcgggtgttaccgactttcgtgacgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcagcaatgctgatctgcgattactagcaactccgacttcatggggtcgagttgcagaccccaatccgaactgagacaggctttttgagattcgctccgcctcgcggcttcccagctcattgtacctgccattgtagcacgtgtgcagcccaagacataaggggcatgatgacttgacgtcgtccccaccttcctccgagttgaccccggcagtctcctgtgagtccccatcaccccgaagggcatgctggcaacacagaacaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacagccatgcaccacctgtcacccgaccacaaggggggccgtatctctacggctttccgggcgatgtcaagccttggtaaggttcttcgcgttgcgtcgaattaagccacatgctccgctgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagttttagccttgcggccgtactccccaggcggggaacttaatgcgttagctgcggcaccgacgacgtggaatgtcgccaacacctagttcccaccgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtcagtaatggcccagagatccgccttcgccaccggtgttcctcctgatatctgcgcatttcaccgctacaccaggaattccgatctcccctaccacactctagcctgcccgtatcgactgcagacccggggttaagccccgggctttcacaaccgacgtgacaagccgcctacgagctctttacgcccaataattccggacaacgcttgcgccctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccggcgcttcttctgcaggtaccgtcacttgcgcttcttccctgctgaaagaggtttacaacccgaaggccgtcatccctcacgcggcgtcgctgcatcaggctttcgcccattgtgcaatattccccactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccggtcgccctctcaggccggctacccgtcgtcgccttggtgagcttctacctcaccaactagctgataggccgcgggctcatcctgcaccgccggagctttcaaccttctcccatgcgagagaaagtgtcatccggtattagaccccgtttccagggcttgtcccagagtgcagggcagattgcccacgtgttactcacccgttcgccactaatccaccccgaagggcttcatcgttcgactgca

菌株la-5的16srdna核苷酸全序列总长为1391bp。将所得序列提交到genbank数据库进行blast分析比对，发现与la-5同源性较高的菌株均属于链霉菌属，选取12个典型菌株的16srdna序列用mega6.0软件构建系统发育树。结果表明，菌株la-5与焊灰直丝链霉菌streptomyceschungwhensis属于同一分支(图5)。

将菌株la-5命名焊灰直丝链霉菌(streptomyceschungwhensis)la-5，该菌株于2017年11月13日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型生物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2017683。

实施例2la-5菌株的发酵

(1)将上述菌株接种于高氏一号斜面培养基，于28℃～30℃条件下培养，直至菌丝和孢子生长成熟；

(2)将斜面上的菌丝和孢子接入发酵培养基，28℃下160～180rpm培养48～60h得到放线菌la-5种子液；

所述的发酵培养基组成为：可溶性淀粉20g，酵母粉1g，nacl0.5g，k2hpo40.5g，mgso40.5g，feso40.01g，水1000ml，ph7.2～7.4。

(3)放线菌la-5的发酵：接种量10％(v/v)、装瓶量60ml/250ml、28℃，180r/min，培养7d，制成浓度为10⁸cfu/ml的la-5菌株发酵液，发酵培养基同步骤(2)。

实施例3菌株la-5的抑菌活性测定

采用平板对峙培养法，将菌株la-5对病原真菌作拮抗测定，首先在pda培养基平板中央接入待测病原真菌7mm菌饼，在菌落周边2cm处均匀点接上菌株放线菌菌饼，26℃下培养3天后查看抑菌效果，实验结果表明菌株la-5对番茄灰霉病菌(该菌株已在文献“王美琴,贺运春,刘慧平,等.内生环状芽孢杆菌jcxy8对番茄灰霉病的防病机制研究[j].中国生态农业学报,2010,18(1):98-101.”中公开)、黄瓜枯萎病菌(该菌株已在文献“focvel1influencesasexualproduction,filamentousgrowth,biofilmformation,andvirulenceinfusariumoxysporumf.sp.cucumerinum.frontiersinplantscience,2015,6:312.”中公开)、瓜果腐霉菌(该菌株已在文献“伽师甜瓜猝倒病生防放线菌的筛选.西北农林科技大学学报(自然科学版),2009,37(05):144-148”中公开)、辣椒疫霉菌(该菌株已在文献“characterizationofnecrosis-inducingnlpproteinsinphytophthoracapsici.bmcplantbiology,2014,14(1):126”中公开)、棉花枯萎病(该菌株已在文献“生防菌与化肥和杀菌剂混用对棉花枯萎病的防病促生作用.西北农林科技大学学报(自然科学版),2016,44(07):165-172.”中公开)、苹果炭疽病菌(该菌株已在文献“农杆菌介导苹果炭疽病菌的遗传转化及转化子鉴.中国农业科学,2013,46(09):1799-1807.”中公开)、玉米叶斑病菌(该菌株已在文献“解淀粉芽孢杆菌b9601-y2对玉米叶斑病的防治效.玉米科学,2017,25(02):130-135.”中公开)、立枯丝核菌(该菌株已在文献“一株抗玉米纹枯病内生细菌的分离鉴定及其抗病促生作用.微生物学通报,2008,(08):1240-1245.”中公开)有较好的拮抗作用；以番茄灰霉菌为例，抑菌效果如图3所示。

然后采用滤纸条法测定la-5菌株发酵液对番茄灰霉菌的抑制作用。将50ml发酵7天、10⁸cfu/ml的la-5菌株发酵液(实施例2制得)置于50ml离心管中，8000r/min离心取上清，然后用微孔滤膜(0.22μm)抽滤除菌，得无菌发酵液，置于灭菌容器中4℃保藏备用。用发酵液浸润无菌滤纸条，充分干燥后对称贴在pda培养基中，培养皿圆心位置接种番茄灰霉菌菌饼，以无菌水作为对照。3天后发现，实验组菌落狭长，生长受阻，对照组无明显影响(图4)。

对于病原细菌的活性测定：供试菌株包括番茄青枯病菌(该菌株已在文献“番茄青枯病内生拮抗细菌的筛选.植物病理学报,2003,(04):364-367.”中公开)、花椰菜软腐病菌(该菌株已在文献“胡萝卜软腐欧氏杆菌胡萝卜亚种游动性突变体的筛选.植物病理学报,2000,(02):176-180.”中公开)、马铃薯黑胫病菌(该菌株已在文献“广东马铃薯黑胫病的病原鉴定.植物病理学报,2015,45(05):449-454.”中公开)、细菌性流胶病菌(pseudomonassyringaepv.syringae，该菌株已在文献“徐丽,王甲威,陈新,等.甜樱桃流胶病原菌的分子鉴定和致病性检测[j].植物病理学报,2015,45(4):350-355.”中公开，即对应该文献中的菌株p.syringaepv.syringae)。吸取1ml病原细菌悬液加入50℃左右的na培养基中并摇匀，迅速倒入培养皿中，待培养基凝固。将直径约6mm的滤纸片灭菌后蘸取无菌发液，晾干贴在培养基上，每个皿中可贴滤纸片5个，重复3次，以未加任何滤液的滤纸片作为空白对照。30℃培养，培养1～2d，观察边缘清晰出现的抑菌圈并记录大小，实验结果表明la-5发酵液对供试病原细菌有一定的抑制活性(表2)。

表2放线菌la-5发酵液抑菌效果

实施例4菌株la-5的生物活性及其应用

1.采用菌丝生长速率法(慕立义，1994)，26℃培养箱内将供试病原真菌菌株在培养基平板上培养5～7天后，用打孔器在菌落边缘打取直径7mm菌饼。取上述无菌发酵液按照1:19的比例加入50℃的pda培养基中，混匀倒入培养皿。冷却后接种病原菌菌饼，以不加发酵液的pda平板上生长的供试病原真菌为对照。每个处理重复4次，26℃培养5天，待对照组菌落长满平板时，用十字交叉法测量菌落直径，根据公式a,b计算菌株的平均菌丝生长抑制率，结果如表3所示。

(a)菌落直径(mm)＝测量直径－菌饼直径

(b)菌丝生长抑制率＝[(对照菌落直径－处理菌落直径)/对照菌落直径]×

100％

表3la-5菌株发酵液对8种病原真菌抑菌效果

2.菌株la-5发酵液对番茄灰霉病的防治效果

利用组织法测定la-5发酵液对番茄灰霉病的防治效果。

第一组实验：选取直径约5cm、大小相似、生长健康的番茄果实30个，平均分为3小组，分别先以la-5菌株无菌发酵液、2％(有效成分)丙烷脒水剂1500倍液、50％(有效成分)咯菌腈可湿性粉剂4000倍液作为保护剂对番茄喷雾处理，喷雾量以刚好均匀、不产生滴液为宜。待晾干后用10⁶个/ml番茄灰霉菌孢子悬浮液接种果实微创伤口，接种量以喷雾均匀不产生滴液为宜。

第二组实验：颠倒接种和喷雾顺序，先接种10⁶个/ml病原菌孢子悬浮液24小时后喷洒上述同浓度的发酵液和农药作为治疗组，两组实验均以无菌水作为对照(ck)，设置三个重复，5天后测量并记录病斑面积，计算防效。结果如表4所示，表明菌株la-5发酵液对番茄灰霉病具有较好的防治效果。

表4la-5发酵液对番茄灰霉菌的保护和治疗防效

根据本实施例结果表明，本发明所述的菌株la-5经过液体发酵培养，其发酵液中含有抑制常见农作物病原菌的物质，对灰霉菌和部分土传真菌(如黄瓜枯萎病菌、瓜果腐霉菌、立枯丝核菌、黄瓜枯萎病菌)菌丝抑制率均超过80％，能够显著减轻病害的发生，有望开发成为一种新型的防治农作物病害的微生物药剂。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>运城学院

<120>一株防治灰霉病的放线菌菌株及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1391

<212>dna

<213>焊灰直丝链霉菌(streptomyceschungwhensis)

<400>1

gctcctccccacaagggggttgggccaccggcttcgggtgttaccgactttcgtgacgtg60

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