L‑苏氨酸高产基因工程菌及其应用的制作方法

技术领域：

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及利用基因工程技术改造大肠杆菌得到重组苏氨酸高产菌与利用高产菌发酵生产l-苏氨酸的应用。

背景技术：
：

苏氨酸共有4种异构体,天然存在并对机体有生理作用的是l-苏氨酸。苏氨酸是人体8种必需氨基酸之一，动物体内不能合成苏氨酸，必须通过饲料供应获取。苏氨酸是仅次于蛋氨酸、赖氨酸和色氨酸的第4种限制性氨基酸，在药品、食品、饲料、化妆品及化工领域应用广泛，市场需求量日益增加，对于人类与动物的健康和营养有重要的意义。

苏氨酸的生产方法主要有蛋白质水解提取法、化学合成法和微生物发酵法三种，最有效的生产苏氨酸的方法为微生物发酵法。用微生物发酵法生产l-苏氨酸，可以使用廉价的葡萄糖原料直接生产产品，此方法生产苏氨酸菌种特性专一，发酵液中其它氨基酸的含量很少，成本很低，环境污染小，有利于大规模的生产。目前用于l-苏氨酸发酵的主要生产菌株是谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)、黄色短杆菌(brevibacteriumflavum)和大肠杆菌(escherichiacoli),而大肠杆菌因繁殖速度快、生理周期短等生理生化性质研究比较深入而成为苏氨酸生产的最常用菌株。

大肠杆菌作为l-苏氨酸生产菌，在发酵培养过程中容易生成乙酸、精氨酸、缬氨酸、亮氨酸等代谢副产物，副产物的积累不仅造成碳源的浪费，在一定程度上还严重抑制了菌体生长及l-苏氨酸的合成。其中，乙酸的抑制效果最为明显。当乙酸积累到一定浓度时，不仅对细胞代谢造成不利影响，同时还严重影响外源基因的表达，从而大大降低了苏氨酸的合成。

乙酸的产生与细胞中的三羧酸循环(tca)和氧化磷酸化有关。在比生长速率较高时，大量糖类就会通过碳代谢流流入细胞。由于tca和氧化磷酸化能力有限，造成糖酵解过程中碳代谢流过量，为使碳代谢流平衡，菌体分泌大量氧化副产物，以乙酸为最。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(pepc)为催化磷酸烯醇式丙酮酸与二氧化碳反应生成草酰乙酸呈不可逆反应的酶，在细菌中广泛存在，能有效固定co2，改变菌体内emp、hmp以及tca的代谢流量，提高回补途径的代谢流量。

因此，提高l-苏氨酸的产量，首先需要一株适合工业化生产的优良高产菌株。

技术实现要素：
：

为了实现上述目的，本发明将通过减少副产物乙酸积累对l-苏氨酸生产的抑制以及提高回补途径的代谢流量构建一株适合工业化生产l-苏氨酸的基因工程菌。

所述基因工程菌是以大肠杆菌为宿主细胞，通过敲除tca循环负调控基因-编码赖氨酸乙酰转移酶的pka基因和tca循环转录调控因子arca基因的同时，过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因ppc构建的；

进一步地，所述宿主细胞为e.colithrd，保藏编号cgmccno.11074；

所述pka基因其核苷酸序列如序列表seqidno.1所示；

所述arca基因其核苷酸序列如序列表seqidno.2所示；

所述ppc基因其核苷酸序列如序列表seqidno.3所示；

本发明还提供上述基因工程菌的构建方法，具体如下：

(1)以e.colithrd为出发菌株，敲除基因pka，筛选出成功敲除pka基因的菌株e.colijlthrg；

进一步地，通过red同源重组技术敲除pka基因；

(2)再以菌株e.colijlthrg为基础，敲除基因arca，筛选出成功敲除pka基因和arca基因的菌株e.colijlthrgq；

进一步地，通过red同源重组技术敲除arca基因；

(3)将来自大肠杆菌mg1655的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因ppc与载体pdhk29连接，构建重组表达载体；

(4)将重组表达载体转化至e.colijlthrgq中，筛选出l-苏氨酸生产菌e.colijlthrgqq。

本发明还提供一种l-苏氨酸的生产方法，具体如下：

(1)将菌株e.colijlthrgqq进行活化和种子培养：

(2)发酵培养

将种子液按15％接种量接种至发酵培养基中，通气量初始值为1l/min，压力为0.02mpa，ph控制在7.0，温度37℃，溶氧维持在20％-35％；发酵开始6小时后以脉冲方式流加含有2g/l甜菜碱盐酸盐的80％葡萄糖溶液，维持发酵体系中葡萄糖浓度0.5g/l直至发酵结束，总发酵时间30h。

有益效果：

本发明通过同时敲除基因pka和arca，以减少乙酸的产生，并过表达e.coli磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc，从而进一步提高苏氨酸的产量。改造后菌株苏氨酸产量134.8g/l，出发菌种苏氨酸产量123.7g/l，提高了8.97％。

附图说明：

图1是基因pka上、下游同源臂与氯霉素抗性基因的扩增；

其中，1：1000bpmarker2：上游同源臂3：下游同源臂4：氯霉抗性基因

图2是pka上、下游同源臂与氯霉素片段的重叠；

其中，1:5000bpmarker2与3：重叠的目的片段

图3是pka上、下游同源臂与氯霉素基因的重叠片段导入e.colithrd的菌落pcr；

其中，1:5000bpmarker2、3、4目的片段成功导入e.colithrd的菌落pcr

图4是e.colijlthrg菌落pcr验证；

其中，1:5000bpmarker2为e.colijlthrg菌落pcr

图5是arca基因上、下游同源臂和氯霉素基因的重叠片段；

其中，1:5000bpmarker2与3：重叠的目的片段

图6是arca上、下游同源臂与氯霉素基因重叠片导入e.colijlthrg菌落pcr验证；

其中，1:5000bpmarker2、3、4为转化成功的菌落pcr

图7是e.colijlthrgq菌落pcr验证；

其中，1:5000bpmarker2为e.colijlthrgq菌落pcr

图8是pjw225-9质粒验证图；

其中，1:10000bpmarker2kpni/psti酶切验证

图9基因改造对菌株生物量的影响；

图10基因改造对l-苏氨酸产量的影响。

具体实施方式：

为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

实验操作未详述的，均根据实验室手册——如《分子克隆》进行操作。

实施例中使用到的引物序列及对应的序列表编号见下表：

实施例1l-苏氨酸高产基因工程菌的构建

(1)通过red同源重组技术敲除e.colithrd的pka基因

a.将质粒pkd46转化至大肠杆菌e.colithrd感受态细胞后，涂布于氨苄抗性lb平板上，30℃过夜培养。

b.抗性平板上的单菌落用质粒pkd46的上、下游引物(pkd46-up和pkd46-down)进行进行菌落pcr验证，筛选阳性重组子。pcr反应体系(15μl)：无菌水6.7μl，绿酶7.5μl，上游引物0.4μl，下游引物0.4μl。

c.将含pkd46质粒的阳性重组子培养至od600＝0.1-0.2时，添加1m的l-阿拉伯糖(使其终浓度为10-50mm)，继续培养至od600＝0.6-0.8时制备感受态细胞。

d.重叠pcr

①以pka-1和pka-2为引物，基因组dna为模板，扩增pka基因上游片段(seqidno.4所示)，以pka-3和pka-4为引物，基因组dna为模板，扩增pka基因下游片段(seqidno.5所示)，以pkd3-up和pkd3-down为引物，pkd3质粒的dna为模板，扩增氯霉抗性基因cm^r(seqidno.6所示)，纯化并回收上述三个基因片段(验证见图1)；

②以步骤①回收后的3个片段为模板，利用引物pka-1和pka-4，进行重叠pcr，pcr体系中各片段的摩尔浓度应为pka基因上游片段：cm^r：pka基因下游片段＝1:1:1-1:6:1范围内，且总量不超过10ng，最后回收目的条带获得包含有pka基因上游片段、cm^r和pka基因下游片段的重叠pcr片段(电泳图见图2)。

重叠pcr的反应体系：

e.将步骤d获得的重叠pcr片段电转化至步骤c获得的含pkd46的目的菌感受态细胞中，涂布于氯霉抗性lb平板上，37℃过夜培养。

f.抗性平板上的单菌落用鉴定引物(pka-1和pka-4)进行菌落pcr验证(见图3)，筛选阳性重组子。

g.挑取阳性重组子于含有氯霉素抗性的lb液体培养基中42℃培养之后，用分别含氯霉素和氨苄的平板进行对点，如果含氯霉素板上长了而含氨苄板上没长说明pkd46质粒丢失成功。挑选质粒pkd46丢失的菌株。

h.将质粒pcp20转化至上述质粒pkd46丢失的感受态细胞中，涂布于含氨苄霉素lb平板上，30℃过夜培养。挑取单菌落进行菌落pcr验证，引物为pcp20-up和pcp20-down。再以步骤g的方法丢掉质粒pcp20，得到菌株e.colijlthrg。

i.以pka-1和pka-4为引物进行e.colijlthrg菌落pcr验证(见图4)，最后甘油管保藏于-80℃冰箱。

(2)以菌株e.colijlthrg为基础敲除基因arca

采用步骤(1)同样的方法敲除arca基因，获得e.colijlthrgq菌株。仅重叠pcr时的退火温度不同，为58℃；arca基因上、下游片段的扩增引物分别为arca-1、arca-2和arca-3、arca-4。arca基因上游片段(seqidno.7所示)，arca基因下游片段(seqidno.8所示)。验证图分别为图5、6。e.colijlthrgq菌落pcr验证(见图7)。

(3)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc的过表达

a.基因获取及克隆

提取大肠杆菌mg1655基因组dna，以基因组dna为模板，jl224f0和jl224r0为引物，pcr扩增磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc基因cds区2652bp(seqidno.3所示)，目的基因两侧加入kpni/psti酶切位点，电泳验证，切胶回收上述pcr产物，并纯化，测序验证，再克隆至pmd19-tsimple载体，热转化至e.colijm109感受态细胞中，涂布平板，37℃过夜培养。挑选阳性菌落植菌，提取质粒并命名为pjw224-3，保藏备用。

b.pjw224-3质粒中ppc亚克隆至pdhk29载体

将pjw224-3使用kpni/psti酶切电泳，切胶回收2.65kb片段，命名为insertdna。将insertdna与pdhk29载体(4.2kbp、kan抗性)连接后，热转化至e.colijm109感受态细胞中，涂布平板，37℃过夜培养。挑取单菌落提取质粒，使用kpni/psti酶切验证，验证正确的连接质粒命名为pjw225-9(见图8)。

c.磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc转入菌株e.colijlthrgq

提取质粒pjw225-9，并转入大肠杆菌e.colijlthrgq感受态细胞，涂布于含100μg/ml氨苄霉素的lb固体培养基上，37℃培养12h，挑取出含目的氨苄霉素抗性的菌，筛选出菌株e.colijlthrgqq。

实施例2采用e.colijlthrgqq制备苏氨酸的方法

(1)活化菌种培养

①将e.colijlthrgqq的斜面菌种接入活化斜面培养基中进行活化，在温度37℃条件下静置培养14-16h后获初级菌种；

②将初级菌种进行二次活化，在温度37℃静置培养，时间周期8h，经镜检菌体健壮无杂菌即获活化菌种。

(2)高产苏氨酸发酵液制取

①种子液培养：将二次活化的四支斜面用无菌蒸馏水清洗到含有3l种子培养基的5l发酵罐中，培养条件为37℃，ph为7.0，溶氧控制在20％-40％，温度可以通过循环加热装置自动调节，通过氨水来调节ph，通过转速，压力以及通气量来控制溶氧，培养种子生长至od600为12-14，经镜检菌体健壮无杂菌即可获得种子液。

②按15％的接种量将种子液接入含有3l发酵培养基的5l发酵罐中进行发酵培养，通气量初始值为1l/min，压力为0.02mpa，ph控制在7.0，温度控制在37℃，转速不断提高使溶氧维持在20％-35％。同样，温度可以通过循环加热装置自动调节，ph使用流加氨水控制，溶氧通过空气流量，压力以及转速进行调节。进入发酵阶段6小时后以脉冲方式流加含有2g/l甜菜碱盐酸盐的80％葡萄糖溶液，维持发酵体系中葡萄糖浓度0.5g/l直至发酵结束，总发酵时间为30h。

利用柱前衍生法高效液相色谱(hplc)测定发酵液中l-苏氨酸含量。

结果如图10所示，37℃下发酵30h，e.colijlthrgqq菌株l-苏氨酸产量为134.8g/l，以出发菌株e.colithrd为对照，采用上述同样的方法发酵生产l-苏氨酸，30h后l-苏氨酸产量达到123.7g/l，工程菌较出发菌产量提高8.97％。而图9的结果则显示，基因改造前后生产菌株的生长曲线未发生明显改变，说明上述基因改造并未对菌体的正常生长产生影响。

所用培养基为如下：

活化斜面培养基(g/l)：蔗糖1.0，蛋白胨10.0，酵母粉5.0，牛肉膏10.0，nacl5.0，琼脂20.0，ph7.0，121℃，灭菌20min；

种子培养基(g/l)：葡萄糖35，玉米浆(20°be)30ml/l，酵母粉3，mgso4·7h2o0.5，mnso410mg/l，feso4·7h2o10mg/l，kh2po41.5，柠檬酸2.0，硫酸铵2.0，ph7.0，115℃，灭菌15min；

发酵培养基(g/l)：葡萄糖20，mnso410mg/l，mgso4·7h2o1.0，feso4·7h2o30mg/l，kh2po42.0，柠檬酸1.0，玉米浆(20°be)12ml/l，甜菜碱0.5，ph7.0，115℃，灭菌15min。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

序列表

<110>吉林大学

<120>l-苏氨酸高产基因工程菌及其应用

<130>1

<141>2017-11-09

<160>24

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2661

<212>dna

<213>e.colithrd

<400>1

atgagtcagcgaggactggaagcactactgcgaccaaaatcgatagcggtaattggcgcg60

tcgatgaaacccaatcgcgcaggttacctgatgatgcgtaacctgctggcgggaggcttt120

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<210>2

<211>717

<212>dna

<213>e.colithrd

<400>2

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<210>3

<211>2652

<212>dna

<213>大肠杆菌mg1655()

<400>3

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<400>4

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