本发明属于多肽液相合成技术领域，具体涉及一种维洛丝肽(五肽-3)的液相合成方法。
背景技术：
维洛丝肽是一种五胜肽，又称五肽-3或vialox，由甘氨酸、脯氨酸、精氨酸和丙氨酰氨连接而成，属于一种神经递质抑制类胜肽，能通过抑制乙酰胆碱受体过度释放，局部阻断神经传递肌肉收缩讯息，使脸部肌肉放松，达到抚平皱纹、使皮肤光滑、紧致的目的。维洛丝肽的研制成功是抗皱活性胜肽类化合物的一个重大突破，其应用广泛，特别适合应用于表情肌集中的部位如眼角、脸部、额头等。
经过几十年的发展，随着市场需求的逐年增加和极具潜力的多肽类产品的开发，带来了巨大的经济和社会效益。我国化妆品在生产和销售方面取得良好的发展，虽取得了长足的进步，然仍面临着生产工艺落后、研发缺乏创新性等问题。因而开发一种新型高效的液相规模化合成方法成了急需解决的技术难题。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于提供一种成本低廉且对环境友好、易于规模化的维洛丝肽的液相合成方法。
解决上述技术问题所采用的技术方法由下述步骤组成：
1、以四氢呋喃为溶剂，将boc-gly-oh、n-羟基丁二酰亚胺、n,n’-二环己基碳酰亚胺在0～15℃下反应3～5小时，过滤除去不溶物，向滤液中加入h-pro-ome·hcl和碳酸氢钠水溶液，在15～25℃下反应8～12小时，分离纯化，得到boc-gly-pro-ome。
2、以二氯甲烷或四氢呋喃为溶剂，在-15～-10℃下，将boc-pro-oh或fmoc-pro-oh和氯甲酸异丁酯、有机碱反应10～45分钟，再与h-ala-nh2反应1小时，然后升至室温反应6～8小时，分离纯化，得到boc-pro-ala-nh2或fmoc-pro-ala-nh2，然后用氯化氢的乙酸乙酯溶液脱除boc保护基得到h-pro-ala-nh2·hcl或用三氟乙酸(tfa)的四氢呋喃溶液脱除boc保护基得到h-pro-ala-nh2·tfa，或用哌啶的四氢呋喃溶液或浓氨水溶液脱除fmoc保护基，得到h-pro-ala-nh2。
3、以二氯甲烷为溶剂，在-15～-5℃下，将fmoc-arg(pbf)-oh、1-羟基苯并三唑、有机碱和n-乙基-n′-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐反应30～60分钟，再与h-pro-ala-nh2或h-pro-ala-nh2·hcl或h-pro-ala-nh2·tfa反应30～60分钟，然后升至室温反应6～8小时，分离纯化，得到fmoc-arg(pbf)-pro-ala-nh2。
4、用哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶液脱除fmoc-arg(pbf)-pro-ala-nh2的fmoc保护基，然后与boc-gly-pro-ome在室温下反应12～24小时，分离纯化，得到boc-gly-pro-arg(pbf)-pro-ala-nh2，再用三氟乙酸溶液脱保护、盐酸成盐，得到h-gly-pro-arg-pro-ala-nh2·hcl，经离子交换后得维洛丝肽。
上述步骤1中，优选boc-gly-oh、n-羟基丁二酰亚胺、n,n’-二环己基碳酰亚胺、h-pro-ome·hcl、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.1～1.3:1.5～2.0:1.2～1.5:2.5～4.0。
上述步骤2中，优选boc-pro-oh或fmoc-pro-oh、氯甲酸异丁酯、有机碱、h-ala-nh2的摩尔比为1:1.05～1.2:2.5～4.0:1.1～1.3。
上述步骤3中，优选fmoc-arg(pbf)-oh、1-羟基苯并三唑、有机碱、n-乙基-n′-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、h-pro-ala-nh2或h-pro-ala-nh2·hcl或h-pro-ala-nh2·tfa的摩尔比应为1:1.0～1.05:2.5～5.0:1.0～1.05:1.1～1.3，其中所述的有机碱优选n-甲基吗啡啉、n,n-二异丙基乙胺、n-甲基吡咯烷酮中任意一种。
上述步骤4中优选fmoc-arg(pbf)-pro-ala-nh2、boc-gly-pro-ome的摩尔比为1:1.3～1.6。
本发明采用“2+“1+2””的片段法，先将fmoc-arg(pbf)-oh和h-pro-ala-nh2或h-pro-ala-nh2·hcl或h-pro-ala-nh2·tfa缩合生成fmoc-arg(pbf)-pro-ala-nh2，然后与哌啶作用脱除fmoc保护基后再与boc-gly-pro-ome反应，生成全保护五肽，经三氟乙酸脱保护、盐酸成盐后得h-gly-pro-arg-pro-ala-nh2·hcl，经离子交换得维洛丝肽。本发明通过脱保护胺酯交换采用“一锅法”合成维洛丝肽，相比较传统的固相合成以逐个延长肽链的方式可明显提高反应产率，避免高成本、高毒性溶剂如n,n-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜等的大量使用，减少了甲醇、异丙醇等溶剂的大量使用，具有易于规模化、中间体纯度高无需柱层析、原辅料用量少、成本低廉且对环境友好等特点。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
1、向500ml三口瓶中加入17.5g(0.1mol)boc-gly-oh和200ml四氢呋喃，搅拌溶解后降温至0～5℃，加入13.8g(0.12mol)n-羟基丁二酰亚胺搅拌10分钟后加入32.8g(0.15mol)n,n’-二环己基碳酰亚胺，保持5～15℃反应4小时后，过滤，向滤液中加入19.8g(0.12mol)h-pro-ome·hcl和100ml3mol/l碳酸氢钠水溶液，在15～25℃下搅拌反应8小时，停止反应，反应液减压脱除溶剂后倒入200ml水中，用乙酸乙酯萃取(100ml×3次)，有机相用0.5mol/l盐酸洗涤至水相ph＝3～4，有机相用200ml饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥12小时，过滤，减压脱除溶剂，得到27.2g白色固体，即boc-gly-pro-ome，收率95％。
2、向500ml三口瓶中加入21.5g(0.1mol)boc-pro-oh和150ml二氯甲烷，搅拌溶解后降温至-15～-10℃，加入33ml(0.30mol)n-甲基吗啡啉，然后缓慢滴加14ml(0.108mol)氯甲酸异丁酯，保持此温度反应30分钟；将11g(0.124mol)h-ala-nh2溶解于50ml二氯甲烷后缓慢加入上述三口瓶中，在-15～-10℃下反应1小时后自然升温至室温反应6小时，停止反应，将反应液倒入300ml水中，静置分液，水相用100ml二氯甲烷萃取一次，萃取后的二氯甲烷相用0.5mol/l盐酸洗涤一次，再用100ml饱和氯化钠水溶液洗涤，减压脱除溶剂，得到25g白色固体，即boc-pro-ala-nh2，收率87.7％。将得到的boc-pro-ala-nh2加入200ml4mol/l氯化氢的乙酸乙酯溶液中，在0～10℃下搅拌反应2小时后过滤，固体用乙酸乙酯洗涤后40℃真空干燥，得到h-pro-ala-nh2·hcl。
3、向1000ml三口瓶中加入32.4g(0.05mol)fmoc-arg(pbf)-oh和300ml二氯甲烷，搅拌溶解后降温至-15℃，加入6.8g(0.05mol)1-羟基苯并三唑和10g(0.10mol)n-甲基吗啡啉，搅拌15分钟后加入9.6g(0.05mol)n-乙基-n′-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，在-15～-10℃下反应45分钟；将13.3g(0.06mol)h-pro-ala-nh2·hcl、15g(0.15mol)n-甲基吗啡啉溶于100ml二氯甲烷后滴加到三口瓶中，在-10～-5℃下反应1小时后自然升温至室温搅拌反应6小时，停止反应，将反应液倒入500ml水中，静置分液，水层用200ml二氯甲烷萃取，萃取后的二氯甲烷相依次经1mol/l的盐酸洗涤、饱和氯化钠溶液洗涤、无水硫酸钠干燥后过滤，滤液减压脱除溶剂，得到34.7g白色固体，即fmoc-arg(pbf)-pro-ala-nh2，收率85％。
4、向1000ml三口瓶中加入20g(0.03mol)fmoc-arg(pbf)-pro-ala-nh2和100ml体积浓度为20％的哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶液，室温搅拌反应1小时后，加入50ml含12.9g(0.045mol)boc-gly-pro-ome的n,n-二甲基甲酰胺溶液，室温搅拌反应24小时，停止反应，将反应液倒入300ml水中搅拌，加入柠檬酸使得体系有大量白色固体析出，过滤，水洗，真空干燥后用乙酸乙酯打浆两次，固体过滤后真空干燥，得到15g白色固体boc-gly-pro-arg(pbf)-pro-ala-nh2，收率72.2％。然后将boc-gly-pro-arg(pbf)-pro-ala-nh2加入200ml三氟乙酸与三异丙基硅烷、水的体积比为90:5:5的混合液中，室温搅拌反应1小时后减压脱除溶剂，浓缩液倒入200ml丙酮中，搅拌下滴加浓盐酸至有大量白色固体析出，过滤，固体用丙酮洗涤，真空干燥，得到白色固体h-gly-pro-arg-pro-ala-nh2·hcl。
将h-gly-pro-arg-pro-ala-nh2·hcl加入到50ml水中，离子交换除盐酸(以体积分数为2％的乙酸水溶液恒流，检测波长210nm，流速10ml/min，色谱柱规格：5cm×45cm，填料deae)，最后冷冻干燥，得到8g白色固体，即维洛斯肽，收率66％、纯度大于85％。
实施例2
1、向500ml三口瓶中加入17.5g(0.1mol)boc-gly-oh和250ml四氢呋喃，搅拌溶解后降温至0～10℃，加入14.9g(0.13mol)n-羟基丁二酰亚胺搅拌10-15分钟后加入39.4g(0.18mol)n,n’-二环己基碳酰亚胺，保持5～10℃反应3小时后，过滤，向滤液中加入21.45g(0.13mol)h-pro-ome·hcl和120ml3mol/l碳酸氢钠水溶液，在15～25℃下搅拌反应11小时，停止反应，反应液减压脱除溶剂后倒入200ml水中，用乙酸乙酯萃取(100ml×3次)，有机相用0.5mol/l盐酸洗涤至水相ph＝3～4，有机相用200ml饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥12小时，过滤，减压脱除溶剂，得到27.0g白色固体，即boc-gly-pro-ome，收率94.3％。
2、向500ml三口瓶中加入16.85g(50mmol)fmoc-pro-oh和200ml二氯甲烷，搅拌溶解后降温至-15～-10℃，加入25.8g(200mmol)n,n-二异丙基乙胺，然后缓慢滴加7.45ml(57.5mmol)氯甲酸异丁酯，保持此温度反应45分钟；将5g(56.5mmol)h-ala-nh2溶解于30ml二氯甲烷后缓慢加入上述三口瓶中，在-15～-10℃下反应1小时后自然升温至室温反应8小时，停止反应，将反应液倒入300ml水中，静置分液，水相用100ml二氯甲烷萃取一次，萃取后的二氯甲烷相用150ml饱和氯化钠水溶液洗涤，减压脱除溶剂，得到16.6g白色固体，即fmoc-pro-ala-nh2。将得到的白色固体加入100ml四氢呋喃溶液中，在0～10℃下加入100ml浓氨水搅拌反应12小时后减压脱除四氢呋喃，有固体析出，过滤，真空干燥得6.8g白色固体h-pro-ala-nh2，收率75.6％。
3、向1000ml三口瓶中加入30g(0.046mol)fmoc-arg(pbf)-oh和300ml二氯甲烷，搅拌溶解后降温至-15℃，加入6.45g(0.047mol)1-羟基苯并三唑和9.7g(75mmol)n,n-二异丙基乙胺，搅拌15分钟后加入9.1g(0.047mol)n-乙基-n′-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，在-15～-10℃下反应45分钟；将11.1g(0.06mol)h-pro-ala-nh2、9.7g(75mmol)n,n-二异丙基乙胺溶于100ml二氯甲烷后滴加到三口瓶中，在-10～-5℃下反应1小时后自然升温至室温搅拌反应8小时，停止反应，将反应液倒入500ml水中，静置分液，水层用200ml二氯甲烷萃取，萃取后的二氯甲烷相依次经1mol/l的盐酸洗涤、饱和氯化钠溶液洗涤、无水硫酸钠干燥后过滤，滤液减压脱除溶剂，得到31.6g白色固体，即fmoc-arg(pbf)-pro-ala-nh2，收率77.4％。
4、向1000ml三口瓶中加入16.7g(0.025mol)fmoc-arg(pbf)-pro-ala-nh2和100ml体积浓度为20％的哌啶的n,n-二甲基甲酰胺溶液，室温搅拌反应2小时后，加入50ml含12.0g(0.042mol)boc-gly-pro-ome的n,n-二甲基甲酰胺溶液，室温搅拌反应24小时，停止反应，将反应液倒入600ml水中搅拌，加入柠檬酸使得体系有大量白色固体析出，过滤，水洗，真空干燥后用乙酸乙酯打浆两次，固体过滤后真空干燥，得到15.3g白色固体boc-gly-pro-arg(pbf)-pro-ala-nh2。然后将boc-gly-pro-arg(pbf)-pro-ala-nh2加入200ml三氟乙酸与三异丙基硅烷、水的体积比为90:5:5的混合液中，室温搅拌反应1小时后减压脱除溶剂，浓缩液倒入200ml丙酮中，搅拌下滴加浓盐酸至有大量白色固体析出，过滤，固体用丙酮洗涤，真空干燥，得到白色固体h-gly-pro-arg-pro-ala-nh2·hcl。
将h-gly-pro-arg-pro-ala-nh2·hcl加入到50ml水中，离子交换除盐酸(以体积分数为2％的乙酸水溶液恒流，检测波长210nm，流速10ml/min，色谱柱规格：5cm×45cm，填料deae)，最后冷冻干燥，得到8.2g白色固体，即维洛斯肽，收率67.5％、纯度大于85％。
上述的boc代表叔丁氧羰基，fmoc代表9-笏甲氧羰基，pbf代表2,2,4,6,7-五甲基苯并二氢呋喃-5-磺酰基。