一种香梨蛋白质的提取方法与流程

本发明涉及天然产物提取技术领域，具体涉及一种香梨蛋白质的提取方法。

背景技术：

库尔勒香梨属于新疆梨种，原产于新疆南疆巴音郭楞蒙古自治州，阿克苏等地，至今已有1300年的栽培历史，为古老地方优良品种。库尔勒香梨的果皮薄、质脆、果肉白色、肉质细嫩，多汁味甜，近果心处略酸，香味浓郁，于巴州库尔勒市种植面积达2.4万亩，年产量在一千吨以上，远销美国、东南亚、港、澳等国家和地区。

但是香梨黑头病的发生严重影响了香梨的果实品质和商品价值，香梨黑头病是一种潜伏性侵染病，2016年调查表明，目前香梨黑头病病原菌污染问题日趋明显，果园平均发病率为14.7％，最高者达到34.8％，特别是在采后贮藏期间出现的腐败病症。因此在研究香梨响应黑头病病原菌侵染的分子应答机制基础上，对病原菌侵染后果实的蛋白质组学进行分析至关重要。目前常采用tca-丙酮法方法提取香梨中的蛋白质，但是蛋白质所得的双向电泳图谱蛋白点较模糊，分辨率低，横竖纹以及拖尾问题严重，经pdquest8.0.1软件统计分析，在相同参数设置条件下，tca/丙酮沉淀法在胶面上可分辨出126个蛋白质点，得到的蛋白点很少。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种香梨蛋白质的提取方法，能够增加分辨蛋白点的数量。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种香梨蛋白质的提取方法，包括以下步骤：

1)将香梨果肉在液氮氛围中研磨，得到研磨物；

2)将所述步骤1)得到的研磨物与交联聚维酮混合，得到含有交联聚维酮的混合物；

3)将所述步骤2)得到的含有交联聚维酮的混合物与提取液、tris饱和酚混合，混合后进行振荡，将所述振荡后料液置于冰上保温，将所述保温后的料液离心得到第一酚相；

4)将所述步骤3)得到的第一酚相与提取液混合，混合后进行振荡，将所述振荡后的料液置于冰上保温，将所述保温后的料液离心得到第二酚相；

5)将所述步骤4)得到的第二酚相与醋酸铵甲醇溶液混合，混合后进行振荡，将所述振荡后料液置于冰上保温，将所述保温后的料液在-10～30℃过夜，得到香梨蛋白质；

所述步骤3)和步骤4)中的提取液以水为溶剂，独立包括以下浓度的组分：0.5～0.9mol/l蔗糖、0.05～0.15mol/lkcl、0.01～0.08mol/ledta、0.1～0.8mol/ltris-hcl；所述提取液的ph值为6.0～8.0。

优选的，所述步骤3)中的含有交联聚维酮的混合物的质量与提取液的体积、tris饱和酚的体积比为(0.89～1.31)g:(5～15)ml:(5～15)ml。

优选的，所述步骤4)中的第一酚相与提取液的体积比为(0.5～1.5):(0.5～1.5)。

优选的，所述步骤5)中的醋酸铵甲醇溶液中醋酸铵的摩尔浓度为0.05～0.15mol/l。

优选的，所述步骤5)中的第二酚相与醋酸铵甲醇溶液的体积比为(0.5～1.5):(2.5～6.5)。

优选的，所述步骤2)中的研磨物与交联聚维酮的质量比为(0.8～1.2):(0.09～0.11)。

优选的，所述步骤3)和4)中离心的条件独立的包括：所述离心的温度为1～8℃，所述离心的转速为3000～8000rpm，所述离心的时间为20～40min。

优选的，所述步骤3)、4)和5)中振荡的条件独立的包括：所述振荡的时间为4～6min，所述振荡每间隔4～6min振荡一次，所述振荡的次数为4～8次。

优选的，所述步骤5)中过夜后还包括：将所述过夜后的料液纯化，得到香梨蛋白质；

所述纯化具体包括以下步骤：

i将所述过夜后的料液固液分离，得到沉淀；

ii将所述沉淀依次进行甲醇洗涤和丙酮洗涤后干燥，得到香梨蛋白质。

本发明提供的是一种香梨蛋白质的提取方法，包括以下步骤：1)将香梨果肉在液氮氛围中研磨，得到研磨物；2)将所述步骤1)得到的研磨物与交联聚维酮混合，得到含有交联聚维酮的混合物；3)将所述步骤2)得到的含有交联聚维酮的混合物与提取液、tris饱和酚混合，混合后进行振荡，将所述振荡后料液置于冰上保温，将所述保温后的料液离心得到第一酚相；4)将所述步骤3)得到的第一酚相与提取液混合，混合后进行振荡，将所述振荡后的料液置于冰上保温，将所述保温后的料液离心得到第二酚相；5)将所述步骤4)得到的第二酚相与醋酸铵甲醇溶液混合，混合后进行振荡，将所述振荡后料液置于冰上保温，将所述保温后的料液在-10～30℃过夜，得到香梨蛋白质；所述步骤3)和步骤4)中的提取液以水为溶剂，独立包括以下浓度的组分：0.5～0.9mol/l蔗糖、0.05～0.15mol/lkcl、0.01～0.08mol/ledta、0.1～0.8mol/ltris-hcl；所述提取液的ph值为6.0～8.0。

本发明的香梨果肉经液氮研磨后，再与交联聚维酮混合，能够除去酚类物质，再依次经tris饱和酚和提取液提取，能够将香梨蛋白质从香梨果肉中提取出来，再经醋酸铵甲醇溶液沉淀后，得到香梨蛋白质，能够避免糖分、色素、盐类物质等其它物质的干扰，增加了分辨蛋白点的数量。

本发明实施例的结果显示：采用本发明的方法，能够测出1000多个蛋白点，蛋白点分布均匀，蛋白点呈清晰的圆形或者椭圆形，凝胶背景干净，横竖条纹干扰少，图谱清晰，蛋白点多，表明库尔勒香梨蛋白质的分离效果良好。

附图说明

图1为样本一的双向电泳图谱；

图2为样本二的双向电泳图谱；

图3为胎牛血清标准品蛋白定量标准曲线。

具体实施方式

本发明提供了一种香梨蛋白质的提取方法，1)将香梨果肉在液氮氛围中研磨，得到研磨物；2)将所述步骤1)得到的研磨物与交联聚维酮混合，得到含有交联聚维酮的混合物；3)将所述步骤2)得到的含有交联聚维酮的混合物与提取液、tris饱和酚混合，混合后进行振荡，将所述振荡后料液置于冰上保温，将所述保温后的料液离心得到第一酚相；4)将所述步骤3)得到的第一酚相与提取液混合，混合后进行振荡，将所述振荡后的料液置于冰上保温，将所述保温后的料液离心得到第二酚相；5)将所述步骤4)得到的第二酚相与醋酸铵甲醇溶液混合，混合后进行振荡，将所述振荡后料液置于冰上保温，将所述保温后的料液在-10～30℃过夜，得到香梨蛋白质；所述步骤3)和步骤4)中的提取液以水为溶剂，独立包括以下浓度的组分：0.5～0.9mol/l蔗糖、0.05～0.15mol/lkcl、0.01～0.08mol/ledta、0.1～0.8mol/ltris-hcl；所述提取液的ph值为6.0～8.0。

在本发明中，所述提取液对香梨果肉中的蛋白质进行提取，对抗蛋白质溶液ph值的改变，保持蛋白质稳定性，抑制蛋白酶活性，防止蛋白质分解。

本发明将香梨果肉在液氮氛围中研磨，得到研磨物。

本发明对所述香梨的品种没有特殊限定，在本发明实施例中具体为库尔勒香梨。

在本发明中，所述香梨果肉优选经过香梨切细至无明显块状后得到。

在本发明中，所述香梨果肉在液氮氛围中研磨优选为将液氮加入香梨果肉中进行研磨，直至香梨果肉变成粉末。本发明对所述研磨使用的工具没有特殊限定，在本发明实施例中具体使用研钵研磨，本发明在研磨前优选对研钵预冷。

本发明将得到的研磨物与交联聚维酮混合，得到含有交联聚维酮的混合物。

在本发明中，所述研磨物与交联聚维酮的质量比优选为(0.8～1.2):(0.09～0.11)，更优选1.0:0.1。本发明中的交联聚维酮能够吸附香梨果肉破碎后释放出的酚类物质。本发明对所述交联聚维酮的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售产品即可。

本发明将得到的含有交联聚维酮的混合物与提取液、tris饱和酚混合，混合后进行振荡，将所述振荡后料液置于冰上保温，将所述保温后的料液离心得到第一酚相。在本发明中，此步骤的作用为对香梨果肉中的蛋白质进行抽提。

在本发明中，所述提取液以水为溶剂，优选包括以下组分：0.5～0.9mol/l蔗糖、0.05～0.15mol/lkcl、0.01～0.08mol/ledta、0.1～0.8mol/ltris-hcl；更优选包括：0.6～0.8mol/l蔗糖、0.08～0.12mol/lkcl、0.03～0.06mol/ledta、0.3～0.6mol/ltris-hcl；最优选为0.7mol/l蔗糖、0.1mol/lkcl、0.05mol/ledta、0.5mol/ltris-hcl。在本发明中，所述提取液的ph值优选为6.0～8.0，更优选为6.5～7.5，最优选为6.0～8.0。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售产品即可。

在本发明中，所述含有交联聚维酮的混合物的质量与提取液的体积、tris饱和酚的体积比为(0.89～1.31)g:(5～15)ml:(5～15)ml，更优选为(1.0～1.2)g:(8～12)ml:(8～12)，最优选为1.1g:10ml:10ml。

在本发明中，所述振荡的条件优选包括：所述振荡的时间优选为4～6min，更优选为4.5～5.5min，最优选为5min；所述振荡优选每间隔4～6min振荡一次，更优选为4.5～5.5，最优选为5min；所述振荡的次数优选为4～8次，更优选为5～7次，最优选为6次。

在本发明中，所述离心的条件优选包括：所述离心的温度优选为1～8℃，更优选为3～6℃，最优选为5℃；所述离心的转速优选为3000～8000rpm，更优选为4000～6000rpm，最优选为5000rpm；所述离心的时间优选为20～40min，更优选为25～35min，最优选为30min。本发明对所述离心使用的仪器没有特殊限定，在本发明实施例中具体为离心机。本发明离心后的上层为第一酚相。

本发明将得到的第一酚相与提取液混合，混合后进行振荡，将所述振荡后的料液置于冰上保温，将所述保温后的料液离心得到第二酚相。在本发明中，此步骤的作用是反复抽提，进行纯化。

在本发明中，所述提取液以水为溶剂，优选包括以下组分：0.5～0.9mol/l蔗糖、0.05～0.15mol/lkcl、0.01～0.08mol/ledta、0.1～0.8mol/ltris-hcl；更优选包括：0.6～0.8mol/l蔗糖、0.08～0.12mol/lkcl、0.03～0.06mol/ledta、0.3～0.6mol/ltris-hcl；最优选为0.7mol/l蔗糖、0.1mol/lkcl、0.05mol/ledta、0.5mol/ltris-hcl。在本发明中，所述提取液的ph值优选为6.0～8.0，更优选为6.5～7.5，最优选为6.0～8.0。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售产品即可。在本发明中，所述第一酚相与提取液的体积比优选为(0.5～1.5):(0.5～1.5)，更优选为(0.8～1.2):(0.8～1.2)，最优选为1:1。

在本发明中，对包括第一酚相和提取液的混合物料进行振荡的条件优选包括：所述振荡的时间优选为4～6min，更优选为4.5～5.5min，最优选为5min；所述振荡优选每间隔4～6min振荡一次，更优选为4.5～5.5，最优选为5min；所述振荡的次数优选为4～8次，更优选为5～7次，最优选为6次。

在本发明中，所述离心的条件优选包括：所述离心的温度优选为1～8℃，更优选为3～6℃，最优选为5℃；所述离心的转速优选为3000～8000rpm，更优选为4000～6000rpm，最优选为5000rpm；所述离心的时间优选为20～40min，更优选为25～35min，最优选为30min。本发明对所述离心使用的仪器没有特殊限定，在本发明实施例中具体为离心机。本发明离心后的上层为第二酚相。

本发明将得到的第二酚相与醋酸铵甲醇溶液混合，混合后进行振荡，振荡后置于冰上，再-10～30℃过夜，得到香梨蛋白质。

在本发明中，所述第二酚相与醋酸铵甲醇溶液的体积比优选为(0.5～1.5):(2.5～6.5)，更优选为(0.8～1.2):(4～6)，最优选为1:5。在本发明中，所述醋酸铵甲醇溶液中醋酸铵的摩尔浓度优选为0.05～0.15mol/l，更优选为0.08～0.120.05～0.15mol/l，最优选为0.100.05～0.15mol/l。

在本发明中，对包括所述第二酚相和醋酸铵甲醇溶液的混合溶液进行振荡的条件优选包括：所述振荡的时间优选为4～6min，更优选为4.5～5.5min，最优选为5min；所述振荡优选每间隔4～6min振荡一次，更优选为4.5～5.5，最优选为5min；所述振荡的次数优选为4～8次，更优选为5～7次，最优选为6次。

在本发明中，所述过夜的温度优选为-10～30℃，更优选为-15～25℃，最优选为-20℃。

本发明优选在所述过夜后，将得到的料液进行纯化后，得到香梨蛋白质。

在本发明中，所述纯化具体包括以下步骤：

ⅰ将所述过夜后的料液固液分离，得到沉淀；

ⅱ将所述沉淀依次进行甲醇洗涤和丙酮洗涤后干燥，得到香梨蛋白质。

在本发明中，所述甲醇和丙酮在洗涤前优选在-20℃预冷后使用。

在本发明中，所述步骤ⅱ中甲醇优选可替换为乙醇或醋酸铵。

在本发明中，将所述过夜后的料液固液分离后，得到沉淀；所述固液分离优选采用离心的方式进行，所述离心的条件包括：所述离心的温度优选为1～8℃，更优选为3～6℃，最优选为5℃；所述离心的转速优选为3000～8000rpm，更优选为4000～6000rpm，最优选为5000rpm；所述离心的时间优选为20～40min，更优选为25～35min，最优选为30min。

在本发明中，将所述沉淀依次进行甲醇洗涤和丙酮洗涤后干燥，得到香梨蛋白质。

在本发明中，所述沉淀的质量与甲醇的体积比优选为(5～6)mg:(4～6)ml，更优选为5.5mg:5ml。

本发明优选重复一次甲醇洗涤的步骤。

在本发明中，所述沉淀的质量与丙酮的体积比优选为(5～6)mg:(4～6)ml，更优选为2.5mg:5ml。

本发明优选重复一次丙酮洗涤的步骤。

在本发明中，所述沉淀依次经甲醇和丙酮洗涤的目的是将沉淀中的色素、盐和水溶性糖去除。

在本发明中，所述沉淀经甲醇和丙酮洗涤后独立的进行固液分离，所述固液分离优选采用离心的方式进行，所述离心的的条件包括：所述离心的温度优选为1～8℃，更优选为3～6℃，最优选为5℃；所述离心的转速优选为3000～8000rpm，更优选为4000～6000rpm，最优选为5000rpm；所述离心的时间优选为20～40min，更优选为25～35min，最优选为30min。

本发明将所述沉淀依次进行甲醇洗涤和丙酮洗涤后干燥，得到香梨蛋白质。

在本发明中，所述干燥的条件包括：所述干燥的温度优选为20～28℃，更优选为22～26℃，最优选为25℃。

下面结合本发明的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

研磨前先在研钵中倒入液氮预冷，然后将1g香梨果肉切细至无明显块状后置于研钵中，迅速加入液氮研磨，直至组织变成粉末，均匀而没有明显颗粒；立刻在研钵中加入100mg交联聚维酮，再用药勺转移至50ml离心管中；

在含有香梨果肉粉末的50ml离心管中加入10ml提取液，再加入10mltris饱和酚，手动充分振荡5min后置于冰上，每隔5min振荡一次，共6次；然后在4℃、5000rpm的条件下离心30min，吸出第一酚相，转移到15ml离心管中；提取液以水为溶剂，包括以下组分：0.7mol/l蔗糖、0.1mol/lkcl、0.05mol/ledta、0.5mol/ltris-hcl；所述提取液的ph值为7.5。

在15ml离心管中加入与第一酚相酚相同体积的提取液，手动充分振荡5min后置于冰上，每隔5min振荡一次，总共6次，再在4℃、5000r/min的条件下离心30min，吸出上层酚相，转移至新的15ml离心管中，重复一次操作，得到第二酚相；

在第二酚相中加入第二酚相5倍体积的醋酸铵甲醇溶液，手动充分振荡5min后置于冰上，每隔5min振荡一次，总共6次，-20℃沉淀过夜；醋酸铵甲醇溶液中醋酸铵的摩尔浓度为0.1mol/l。

对沉淀过夜的溶液在4℃、5000rpm的条件下离心30min，倒上清，得到第一沉淀，加入5ml甲醇对第一沉淀进行洗涤，用移液器反复吹打均匀后，在4℃、5000rpm的条件下离心30min，重复一次操作，得到第二沉淀；

加入5ml丙酮对第二沉淀进行洗涤，用移液器反复吹打均匀后，在4℃、5000rpm的条件下离心30min，重复一次操作，得到第三沉淀，将第三沉淀在25℃干燥，得到香梨蛋白质，-80℃保存备用；

将香梨蛋白质与200ulrb(8mol/l尿素，2％chaps，0.015mol/lddt和0.5％ipg)混合，用枪头反复吹打直至香梨蛋白质充分分散后进行超声助溶，超声4下后放于冰上冷却，再重复1次，超声后在4℃、12000r/min的条件下离心20min，吸出上清液，转移至新的ep管中，得到蛋白质提取液，取蛋白质提取液测量样品中蛋白浓度；采用考马斯亮兰法(bradford)测定蛋白浓度，对总蛋白质进行定量；超声的条件包括：80w，0.8s开，0.8s关。

根据定量所得的数据吸取相应量的蛋白质提取液，进行一向等电聚焦电泳：分析胶(银染)的上样量为银染120μg，质谱胶(考染)的上样量为1200μg；上样液的成分为：185μl相应量的蛋白质提取液、1％dtt9μl、1％ipgbuffer3μl、1×bpb1μl、rb至460μl。从冰箱取出干胶条(24cm，ph4)室温20℃下复温10min。吸取离心后的样品上清液加到水化盘的槽中，将样本溶液均匀地加入槽底，加样长约22cm。取出胶条，胶面朝下放入水化盘的槽中，操作过程要避免产生气泡。放好胶条后再加入1.2ml覆盖油于支持膜上保湿，调节室内温度为20℃，让胶条泡胀过夜，记录下胶条的号码，之后进行等电聚焦；等点聚焦的参数为：500v(升压模式为step-n-hold)，1小时；1000v(升压模式为gradiet)，1小时；8000v(升压模式为gradiet)，3小时；8000v(升压模式为step-n-hold，保持)，5:36小时。

跑完等电聚焦以后，取出胶条，吸干表面的覆盖油，胶面朝上将胶条放入平衡管中，-70℃保存，备用。

胶条平衡：平衡液(sds)中分别加入0.1mol/ldtt和0.25mol/liaa搅拌均匀后备用，iaa搅拌时应避光。取出胶条进行复温10min，加入10ml左右去离子水洗掉胶条表面的覆盖油；后将每支胶条放入平衡管中并加入8ml平衡液进行平衡，先加dtt平衡15min，倒干净平衡液后马上加入iaa平衡15min，iaa平衡时要避光。

二向聚丙烯酰胺凝胶电泳：吸取0.8％低熔琼脂糖封住整个胶面，将平衡好的胶条迅速从平衡管中取出，在装上槽液的量筒中稍微涮洗一下，将胶条放入玻璃板中，使胶条下端紧密接触二向聚丙烯酰胺凝胶(12.5％)胶面，注意不要让胶条下端困住气泡，装好玻璃板后装上槽，然后在槽与玻璃板的缝隙处加入1.5％普通琼脂糖封住缝隙。在上槽中轻轻地加入上槽液至最大刻度处，下槽液加入到下槽中，盖上盖子，接上电极后开始电泳。当溴酚蓝跑出二向胶以后可停止电泳；上槽液的配制方法：量取240ml的10×电泳储液sds，加水至1.2l配置2×上槽液；下槽液的配制方法：用量筒量取450ml10×电泳储液sds，加入50ml去离子水，配成1×的下槽液；二向聚丙烯酰胺凝胶电泳的参数为2w/条，1h；17w/条，直到溴酚蓝跑到底。

电泳结束后转移凝胶，按照胶条的号码选择相应号码的染色盘(染色盘需先标好号码，并先加入250ml固定液)。使胶稍微脱离玻璃板，将玻璃板反扣到染色盘上，让胶慢慢脱离玻璃板落入染色盘中。将染色盘置于水平摇床上振动，室温固定2h以上。

染色：对上步骤得到的胶条分别进行银染(分析)和考染质谱分析，固定、染色及脱色过程均在水平摇床上晃动进行，之后将凝胶转移至扫描仪上，扫描结束对图像进行分析，结果见图1和2。

根据图1和图2可以得出，图中的黑点为分离的蛋白点，共测出1000多个蛋白点，蛋白点分布均匀，蛋白点呈清晰的圆形或者椭圆形，凝胶背景干净，横竖条纹干扰少，图谱清晰，蛋白点多，表明库尔勒香梨蛋白质的分离效果良好。

标准曲线的绘制：

取5、10、15、20、25、30、35μg的bsa制作标准曲线，样品取2μl，双复管测定。每支管加入1mlbradford进行染色，涡旋振荡20s，使其充分混匀后静置5min即可测定吸光值，测定时两个样品之间的操作间隔20s。定量分两次进行，第一次为初步定量，计算得到各样品的浓度后，将所有样品浓度尽量调至比较接近，再进行第二次定量，为了保证定量的准确性，每次定量都需制作标准曲线。

表17个浓度梯度的胎牛血清标准品bsa吸光值

以吸光值和bsa浓度制定标准曲线，结果见图3，其中，系列1代表点的图注。根据图3可以得出，标准曲线回归方程y＝78.269x-24.23，r²＝0.9901。

根据库尔勒香梨蛋白样本所测得的吸光值，将结果带入标准曲线计算蛋白质含量及浓度，其中，样本一与样本而为重复实验，结果见表2。

表2库尔勒香梨蛋白样本定量结果

根据表2可以得出，样本一的香梨蛋白质浓度为7.000378ug/ul，样本二的香梨蛋白质浓度为6.393793，则1ml蛋白质提取液(样本一)中蛋白质为7.000378mg；1ml蛋白质提取液(样本二)中蛋白质为6.393793mg。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。