本发明涉及食品技术领域中饮品原料在热加工过程中蛋白质形成的微纳米胶粒构造，具体涉及到一种茶叶热稳定性蛋白纳米颗粒及其制备方法。
背景技术：
茶汤作为一种古老且广受大众喜爱的健康饮品，具有生津止渴、清凉降火等多种保健功效。先前国内外关于茶汤的研究主要集中在单一化学物质的研究，如茶多酚，而对茶汤这一典型的多相分散体系研究甚少，但单纯引用纯单一成分，很难有预期效果。对于现代医药研究而言茶汤研究面临的困难主要为茶汤里存在一些胶束粒子，茶叶蛋白参与其中，但具体哪些蛋白参与,这些反应至今尚未有明确报道。本发明旨在通过在茶叶水溶性热稳定蛋白引入“微纳米胶粒”的概念，从微观世界的角度描述茶汤的物理化学性质，以及与人体作用的生理功效。从而使纳米颗粒在茶叶风味以及茶叶中生理功效成分在体内的传递和起效方面发挥作用。
与此同时，从食品加工角度出发，使制作茶饮料过程中，撇开更多的原料因素，不依赖于茶原料的好坏，变得更加自由，这有利于茶饮料工业的发展。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种茶叶热稳定性蛋白纳米颗粒及其制备方法。针对化合物在纳米化后，在安全性上的不确定性，本发明涉及的茶叶热稳定性蛋白纳米颗粒的设计从两个“天然”体系出发：一是天然存在于食品中的蛋白质成分，二是该蛋白质的纳米化过程发生在热加工过程，其纳米颗粒在由鲜叶制成的成品茶叶冲泡的茶汤中广泛存在，对热加工过程稳定，为广大人群饮用多年，安全性高。本发明得到的茶叶热稳定性蛋白纳米颗粒体，表面规则，粒径分布均匀，稳定性好。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种茶叶热稳定性蛋白，该蛋白为水溶性蛋白，在成品茶加工及茶汤冲泡过程中具有热稳定性。其n-端一级结构序列为：gdespetl。
所述的茶叶热稳定性蛋白分子量为66.0kda、等电点为4.82。
一种茶叶热稳定性蛋白的提取方法，经过tris-盐酸缓冲液水相抽提，离子交换色谱unoq阴离子交换色谱，从茶叶鲜叶中分离得到一个电泳纯的茶叶热稳定性蛋白。其具体包括以下步骤：
1）茶叶热稳定性蛋白粗提液的制备：以料液质量比1:3将茶叶鲜叶加入4℃预冷的含0.05mph7.2tris-盐酸缓冲液、10wt.%pvpp、5m尿素、1mmpmsf、1mmedta、5wt.%nahso3的水溶液，冰浴上研磨，4℃浆液浸提3h，纱布过滤，滤过液4℃12000rpm离心30min，取上清，得鲜叶蛋白粗提液；
2）茶叶热稳定性蛋白的离子交换色谱分离：将10ml茶叶热稳定性蛋白初提液流加至以含5m尿素的0.02mol/l、ph9.0tris-盐酸缓冲液平衡的unoq阴离子色谱柱，以同样浓度tris-盐酸缓冲液继续平衡3倍柱体积后，再以含0～0.65mol/lnacl、5m尿素的0.02mol/l、ph9.0tris-盐酸缓冲液线性梯度洗脱100ml，最后用含0.65mol/lnacl、5m尿素的0.02mol/l、ph9.0tris-盐酸缓冲液洗脱1个柱体积，流速1ml/min，紫外分光光度计测量波长为280nm，经过色谱分离的组分以自动分布收集仪收集，后以sds-page进行蛋白成分鉴定；
3）茶叶热稳定性蛋白的基本性质表征：以sds-page测定该经纯化得到的茶叶热稳定性蛋白的分子量大小，以等点聚焦测定该茶叶热稳定性蛋白的等电点，以edmandegradation测定该茶叶热稳定性蛋白的n-端一级结构序列。
一种茶叶热稳定性蛋白纳米颗粒，由所述茶叶热稳定性蛋白组成，15个茶叶热稳定性蛋白单体形成一个球体的蛋白纳米颗粒，该纳米颗粒其平均粒径为75±1.3nm，表面电荷呈负性，范围在-24.7±0.6mv。
所述的茶叶热稳定性蛋白纳米颗粒的制备方法包括：将该茶叶热稳定性蛋白配制为0.11mg/ml的ph5.05盐溶液，经过30℃加热30min，利用分子截留量为100kda的超滤离心管进行超滤去除未反应的茶叶热稳定性蛋白，即获得茶叶热稳定性蛋白纳米颗粒。并应用动态光散射技术、多角度激光光散射和冷冻电子扫描显微镜对茶叶热稳定性蛋白纳米颗粒进行性质研究，本发明制备得到的茶叶热稳定性蛋白纳米颗粒平均粒径为75±1.3nm，表面电荷呈负性，zeta电位值为-24.7±0.6mv。
所述的盐溶液为tris-盐酸溶液。
本发明的优点在于：本发明涉及的茶叶热稳定性蛋白来源于食品，安全性高。其纳米颗粒的制备方法不涉及任何交联剂，且其纳米颗粒在由鲜叶制成的成品茶叶冲泡的茶汤中广泛存在，对热加工过程稳定，为广大人群饮用多年，安全性高。本发明得到的茶叶热稳定性蛋白纳米颗粒体，表面规则，粒径分布均匀，稳定性好。其可以使制作茶饮料过程中，撇开更多的原料因素，不依赖于茶原料的好坏，变得更加自由，有利于茶饮料工业的发展。
附图说明
图1茶叶热稳定性蛋白粗提液unoq阴离子交换色谱图。
图2茶叶热稳定性蛋白粗提液unoq阴离子交换收集各色谱峰的sds-page电泳图，其中m表示为蛋白maker，p1为目标蛋白。
图3茶叶热稳定性蛋白纳米颗粒的电镜观察图。图中a为在20μm下观察，b为在500nm下观察。
图4茶叶热稳定性蛋白纳米颗粒粒径分布图。
图5不同样品经相同条件unoq阴离子交换色谱分离后的色谱图。图中a：正山小种鲜叶粗提液，b：正山小种成品茶茶汤，c：正山小种茶汤颗粒。
图6不同样品经相同条件unoq阴离子交换色谱分离后的sds-page电泳对比图。图中a：正山小种鲜叶粗提液，b：正山小种成品茶茶汤，c：正山小种茶汤颗粒，
其中m表示为蛋白maker。
具体实施方式
实施例1：茶叶热稳定性蛋白的提取
茶叶热稳定性蛋白粗提液的制备：以料液比1:3将茶叶鲜叶加入4℃预冷的含tris-盐酸缓冲液（0.05m,ph7.2），10%pvpp（g/鲜叶重g），5m尿素，1mmpmsf，1mmedta，5%nahso3的水溶液中，冰浴上研磨，浆液浸提（4℃，3h），纱布过滤，滤过液离心（4℃，12000rpm，30min），取上清，得鲜叶蛋白粗提液。
茶叶热稳定性蛋白的离子交换色谱分离：将10ml茶叶热稳定性蛋白初提液流加至以含5m尿素的0.02mol/l、ph9.0tris-盐酸缓冲液平衡的unoq阴离子色谱柱，以同样浓度tris-盐酸缓冲液继续平衡3倍柱体积后，再以含0～0.65mol/lnacl、5m尿素的0.02mol/l、ph9.0tris-盐酸缓冲液线性梯度洗脱100ml，最后用0.65mol/lnacl、5m尿素的0.02mol/l、ph9.0tris-盐酸缓冲液洗脱1个柱体积，流速1ml/min，紫外分光光度计测量波长为280nm，经过色谱分离的组分以自动分布收集仪收集，后以sds-page进行蛋白成分鉴定，见图1和2。
茶叶热稳定性蛋白基本理化性质，其特征为分子量66.0kda、等电点为4.82，n-端一级结构序列为gdespetl。
实施例2：茶叶热稳定性蛋白纳米颗粒的制备
将该茶叶热稳定性蛋白配制为0.11mg/ml的ph5.05盐溶液，经过30℃加热30min，利用分子截留量为100kda的超滤离心管进行超滤去除未反应的茶叶热稳定性蛋白，即获得茶叶热稳定性蛋白纳米颗粒，见图3。
用激光粒度仪测定其粒度及表面电位，测得其粒径为75±1.3nm，表面电位为-24.7±0.6mv。茶叶热稳定性蛋白纳米颗粒粒度分布图见图4。
实施例3：茶叶热稳定性蛋白的热稳定性
1.按实施例1方式选取正山小种鲜茶叶，制备粗提液；
2.准确称取正山小种成品茶茶叶10g。将茶叶放入500ml烧杯中，倒入沸腾的农夫山泉矿泉水200ml，冲泡15s后用80目滤网滤出，此称为第一泡茶汤；立刻重复之前步骤二次，将一泡、二泡、三泡茶汤混匀后，在500g下离心10min后取上清，制得成品茶茶汤样品。
3.用超滤截留（100kda）方法对正山小种茶汤中的颗粒进行分离处理，得到的颗粒用tris-盐酸缓冲液（ph9.0，0.02m，5m尿素）重悬，使茶汤颗粒均匀分布在缓冲液中，得成品茶汤颗粒蛋白。
将三个样品用相同条件的unoq阴离子交换色谱分离收集，后以sds-page进行蛋白成分鉴定。正山小种鲜叶蛋白粗提液、正山小种成品茶茶汤、正山小种茶汤颗粒中分子量约为66.0kda的蛋白组分具有相似的洗脱条件，包括出峰位置，出峰时间等，这表明此茶叶蛋白在茶叶成品加工和热冲泡中具有热稳定性，见图5和6。
实施例4：茶叶热稳定性蛋白多酚氧化酶酶学特性
多酚氧化酶活性测定：量取待测样液200μl，加入柠檬酸盐缓冲液（0.1m，ph5.6）200μl，底物反应混合液（柠檬酸盐buffer：0.1%脯氨酸：1%邻苯二酚（v:v:v）=10：2：3）1.2ml。37℃恒温水浴30min后，添加6m尿素1.2ml终止反应。紫外分光光度计在460nm下测定吸光值。空白对照加柠檬酸盐缓冲液。计算公式：
其中：每毫升样品的e460增加0.001为一个活性单位；t：反应时间（30min）；v：试样容量（0.2ml）
利用此测定酶活方法对上述茶叶热稳定性蛋白（p1）多酚氧化酶酶学特性进行研究。得到以下结论：p1的最适温度为35℃，最适ph为6.2，cu2+最适浓度为0.25×10-7m。抑制剂的效果为半胱氨酸>edta>亚硫酸钠>抗坏血酸。酶动力学参数km为6.97mm，vmax为15.79。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
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<110>浙江工商大学
<120>一种茶叶热稳定性蛋白纳米颗粒及其制备方法
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<170>patentinversion3.3
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<213>人工序列
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