一株巨大芽孢杆菌、其多肽农用微生物菌剂及制备方法与应用与流程

本发明涉及一株巨大芽孢杆菌、其多肽农用微生物菌剂及制备方法与应用，属于微生物肥料
技术领域：
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背景技术：
：氨基酸(aminoacid)是含有氨基和羧基的一类有机化合物的通称，是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，是含有碱性氨基和酸性羧基的有机化合物。氨基酸赋予蛋白质特定的分子结构形态，使他的分子具有生化活性。l-型氨基酸作为一种可被植物吸收利用的物质，能够补充作物必须的氨基酸，刺激和调节植物快速生长，促进对营养物质的吸收。改善作物品质，提高作物抗病性；还能够螯合中微量元素，促进微量元素在植物体内的吸收和运输。提高植物对逆境的适应性，在胁迫的前期、中期、后期分别施用氨基酸，可防止和恢复受高温、低湿、霜冻、虫害、冰雹，淹水等胁迫的影响。一些氨基酸衍生物可以调节植物生长，或是作为农药使用等。近年来，氨基酸在植物营养研究领域受到国内外广泛关注，并取得了许多新进展。蛋白质是生物体内重要的活性分子，包括催化新陈代谢的酵素和酶。一般将多于100个肽键相联接的氨基酸称作蛋白质，2个以上100个以下肽键相联接的氨基酸称作多肽。经过长期试验研究发现：多肽不仅可以为作物生长提供有机营养物质，而且在植物生长发育中的能够进行信号传导、活化细胞活性，提高作物产量，提高肥料利用效率，改善品质等方面都起到了重要作用。多肽肽链上有很多羧基，链周围有很多络合基团，与金属离子有很强的螯合作用，能与养分结合并能把养分卡在环内，把养分富集起来给植物利用，从而提高肥料利用效率，提高作物产量，对一些在植物体内难移动的矿质元素，如钙素能被活性肽螯合，被植物很好地吸收。多肽能够增强作物的免疫力，提高抗逆性，具有明显的抗病虫害效应。近年来，多肽、氨基酸在农作物栽培中节约肥料、提高肥料利用率、提高作物抗逆性方面已经得到大量的应用，取得了显著效果，例如，中国专利文献cn103204735a(申请号201310116458)公开了一种多肽水溶肥及其制备方法，该发明选用多肽与有机、无机微量元素混合而成，选用的多肽为酸水解动植物蛋白后进行中和、过滤后的滤液喷雾干燥制得。中国专利文献cn101747093a(申请号：200910248459)提供了一种以维生素c发酵废弃物生产菌体蛋白和多肽有机肥的方法，该方法以维生素c生产工艺形成的废弃醪液中添加古龙酸母液，调节ph值至2.0-5.0，然后经温和水解产生多肽和氨基酸，再调节ph值并适当浓缩，添加适量无机元素制备成多肽有机肥。以上两种多肽肥均是利用酸水解的方式将有机物中的蛋白质水解成氨基酸、小分子活性肽，生产多肽肥料。酸水解得到的多肽肥存在以下缺点：1)需要在压力釜内、高温高压条件下进行，成本高，安全性差；2)生产过程中需要使用大量的酸和碱，不利于环保；3)酸解蛋白质得到的活性肽形态单一，生物活性有限，水解得到的氨基酸多数构型发生变化，不能为作物吸收利用，肥效低。采用微生物发酵法代替传统的酶法水解蛋白的方法可以克服酸水解的缺点，如：中国专利文献cn102079674a(申请号：201010558843.5)提供了一种微生物有机肥，由秸秆、面粉(玉米粉或豆粉)、石灰、磷酸二氢钾、水和液体混合菌种nem组成，nem混合菌种包括枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母、巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌、植物乳杆菌、光合菌和成团泛菌经发酵培养后制成。中国专利文献cn104671961a(申请号：201010558843.5)提供了一种用于蔬菜的微生物发酵有机肥，按重量份包括如下组分：秸秆40-100份、豆粕10-20份、复合微生物菌剂10-20份、草炭30-50份、无机添加剂5-15份，复合微生物菌剂为枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、腊状芽孢杆菌、胶胨样芽孢杆菌、哈茨木霉、植物乳酸菌、酵母菌的混合物。以上两种方法多种不同培养条件的微生物在同一环境中生长繁殖，相互之间产生竞争或抑制作用，尽管个别菌种在有机物发酵过程中产生多肽成分，但其数量达不到应有的效果，而且多种微生物存在竞争作用，活菌数量较低。又如：中国专利文献cn105272407a(申请号：201510791723.2)公开了一种微生物发酵制备生物多肽有机肥的方法及应用，该方法以糠醛渣、食用菌培养料废渣为主要原料，再配以蛋白质含量丰富的麦麸、豆饼等，先经过初级处理以溶出所含蛋白质；再先后利用两种微生物将原料中的不同蛋白质分解，形成多种形态的生物多肽成分，制成以多肽为高效成分的生物多肽有机肥。虽然以上生产的有机肥、生物有机肥多肽、有机质含量较高，但生产过程中需要额外处理或酶解，增加了生产成本，肥料中的养分多为水不溶性，施到土壤中很难被作物吸收利用，此外，该方法得到的有机肥活菌量非常低，用量大，不适合长期应用。又如：中国专利文献cn105884405a(申请号201510836791.6)公开了一种氨基酸-多肽液肥的制备方法。其利用高产蛋白酶的枯草芽孢杆菌、高产淀粉酶的地衣芽孢杆菌、黑霉菌发酵饼粕生产大豆多肽，通过微生物深层、均相、液态发酵技术生产植物多肽及系列产品，虽然以上发明生产的氨基酸-多肽液肥虽然氨基酸-多肽液肥中多肽含量较高，但是生产工艺繁琐，液体发酵能耗较高，且增加了后续过滤工艺进行固液分离、产物提取，发酵过程中的活性功能菌种被过滤去掉，部分未完全降解的有机养分也被过滤到固体滤渣中，造成活性菌种、有机养分大量损失，从而降低了肥效。技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明提供一株巨大芽孢杆菌、其多肽农用微生物菌剂及制备方法与应用。发明概述：本发明以蛋白含量丰富的酒糟、豆粕粉、秸秆粉为主要原料，配以玉米粉、麦麸，与无机盐以及少量碳源经过合理复配后蒸熟；先利用高产蛋白酶枯草芽孢杆菌，再利用巨大芽孢杆菌在特定的发酵条件下将原料中的不同蛋白质分解，制成以活性肽、氨基酸、多糖等为高效成分的农用微生物菌剂，该菌剂中含大量活体芽孢、17种游离氨基酸、多种活性肽、多糖，养分含量丰富，菌体活性高，货架期达到2年以上，经过大田实验，取得了良好的提质、增产效果。本发明的技术方案如下：一株巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)菌株hb，2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：cgmccno.11961。根据本发明，一种多肽农用微生物菌剂的制备方法，包括步骤如下：(1)功能菌枯草芽孢杆菌种子液制备a、用lb斜面培养基将枯草芽孢杆菌菌株活化，得活化的枯草芽孢杆菌菌株；b、将活化的枯草芽孢杆菌菌株接种到液体种子培养基中，于32-37℃下培养16-24h，得到枯草芽孢杆菌种子液，备用；(2)功能菌巨大芽孢杆菌种子液制备a、用lb斜面培养基将巨大芽孢杆菌菌株活化，得活化的巨大芽孢杆菌菌株；b、将活化的巨大芽孢杆菌菌株接种到液体种子培养基中，于32-37℃下培养16-24h，得到巨大芽孢杆菌种子液，备用；(3)预处理混合料的制备按比例，取豆粕粉、秸秆粉、麦麸、酒糟、玉米粉混合均匀，豆粕粉、秸秆粉、麦麸、酒糟、玉米粉的重量份如下：豆粕粉40-80份，秸秆粉6-28份，麦麸5-22份，酒糟5-20份，玉米粉5-15份；加水调整含水率至60-70wt％，于20-35℃条件下静置8-24小时，然后于温度115-121℃下蒸煮20-40min，冷却后得预处理混合料，备用；(4)取步骤(3)制得的预处理混合料，按质量百分比为8-30wt％的接种量接入步骤(1)制备的枯草芽孢杆菌种子液，混合均匀，在温度为32-36℃条件下发酵24-30小时，搅拌均匀；(5)然后按照质量百分比为12-18wt％的接种量接入步骤(2)制备的巨大芽孢杆菌种子液，混合均匀，提高温度至38-42℃，继续发酵24-48小时，发酵结束后降温至室温，干燥、粉碎后，制得本发明的富含高含量活菌、复合氨基酸及活性肽的农用微生物菌剂。根据本发明优选的，步骤(1)、(2)中所述的lb斜面培养基的组分及重量百分比如下：胰蛋白胨0.8-1.2％，酵母提取物为0.4-0.6％，氯化钠0.4-0.6％，琼脂粉1.5-2.0％，其余为水，ph值为7.2。根据本发明优选的，步骤a、步骤a中，所述的活化为挑取单菌落在lb培养基斜面培养基上37℃培养18-24h。根据本发明优选的，步骤b、步骤b中所述的液体种子培养基组分及其重量百分比如下：葡萄糖2.0-3.0％，玉米浆干粉1.1-1.8％，黄豆粉1.5-4.0％，酵母浸膏0.1-0.2％，磷酸二氢钾0.01-0.03％，氯化钠0.01-0.02％，硫酸镁0.01-0.02％，其余为水，ph值为7.0-7.3；根据本发明优选的，步骤(4)中枯草芽孢杆菌种子液的接种量为10-20wt％，发酵温度为34-36℃，发酵时间为26-30小时；最为优选的，枯草芽孢杆菌种子液的接种量为10wt％，发酵温度为35℃，发酵时间为30小时。根据本发明优选的，步骤(5)中巨大芽孢杆菌种子液的接种量为14-18wt％，发酵温度为40-42℃，发酵时间为40-48小时；最为优选的，巨大芽孢杆菌种子液的接种量为15wt％，发酵温度为42℃，发酵时间为48小时；根据本发明优选的，步骤(5)中干燥温度为50-110℃。根据本发明优选的，所述的秸秆粉为玉米秸秆粉、小麦秸秆粉或水稻秸秆粉中一种或两种以上任意混合。根据本发明优选的，所述的秸秆粉、酒糟的粒径小于等于0.6cm，所述的麦麸、豆粕粉、玉米粉的粒径为0.4-1mm。根据本发明优选的，枯草芽孢杆菌种子液中活菌数为5.0×109-1.5×1010cfu/ml，巨大芽孢杆菌种子液中活菌数为1.2×109-8.6×109cfu/ml。上述制备方法中未详细限定的均按照现有技术。根据本发明优选的，所述的枯草芽孢杆菌为购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为acccno.11025的枯草芽孢杆菌菌株p-1。本发明的巨大芽孢杆菌为植物根际促生菌(pgpr)，较其他同类菌具有较强的分解原料中的脂蛋白、磷蛋白的能力以及耐110℃高温、高盐、定殖能力强、繁殖速度快的特点；该巨大芽孢杆菌在菌剂的发酵生产过程以及土壤中能够充分利用蛋白施入土壤后能够快速在作物根际定殖，充分利用蛋白质养分及色氨酸等氨基酸资源，通过好氧发酵转化为吲哚乙酸(iaa),改善根际土壤微生态环境，保持优势菌种地位，占领有害菌的生存空间，同时能够降解有机磷农药，将无效磷转化为有效磷，提高土壤中磷的吸收利用效率，恢复生态平衡。枯草芽孢杆菌具有能够在生长繁殖过程中大量分泌α-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等活性酶的特异功能，并且在发酵过程中能够大量产生一种水溶性的胞外多糖，将土壤中的有机废弃物转化成易于被作物吸收利用的小分子物质，菌体生长繁殖过程中还能够分泌多糖类物质，具有保水、保肥、提高土壤肥力的功能。一种富含高含量活菌、复合氨基酸及活性肽的农用微生物菌剂，采用上述方法制得，所述的微生物菌剂中，有效活菌数10-50亿/g，游离氨基酸质量含量4-12wt％，活性肽质量含量11-22wt％。本发明的微生物菌剂的应用：用于蔬菜、瓜类、果树、粮棉作物增产或与复合肥、有机无机复混肥复配作为肥料增效剂使用。根据本发明优选的，用于蔬菜、瓜类、果树、粮棉作物增产时，施用方法为：将微生物菌剂在作物种植前均匀撒施于土壤表面翻耕入土，或按照质量比：1:20的比例拌土后施于栽植穴或播种穴内，然后移栽幼苗或播种；根据本发明优选的，撒施时微生物菌剂用量：蔬菜作物每亩5-15公斤，果树每亩10-20公斤，瓜类作物每亩10-20公斤，粮棉作物每亩5-15公斤；穴施时微生物菌剂用量：蔬菜作物每亩3-6公斤，瓜类每亩5-10公斤。根据本发明优选的，作为肥料增效剂使用时，每吨肥料添加微生物菌剂为60-120公斤。本发明的优良效果如下：1.本发明的微生物菌剂中含有大量高活性的巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌的芽孢休眠体，有效活菌数最高达50亿/g本发明制备的菌剂产品每克含有数十亿的功能芽孢，其中具有较强特异功能的巨大芽孢杆菌芽孢约占80％以上，该巨大芽孢杆菌抗逆性强，能够耐受高盐、高温环境，具有较强的定殖能力，施入土壤中能够快速繁殖成为优势菌群，分解土壤中的有机磷，把无效磷转化为有效磷，有效提高土壤中磷的吸收效率。该巨大芽孢杆菌在菌剂的发酵生产过程以及土壤中还能够充分利用蛋白质养分及色氨酸等氨基酸资源，通过好氧发酵转化为吲哚乙酸(iaa)，吲哚乙酸是一种天然的植物生长促进剂，促进种子萌发、作物生长及根系发达。2.本发明微生物菌剂中含有丰富的植物源游离氨基酸、活性肽以及丰富的菌种代谢产物本发明微生物菌剂中富含大量活体芽孢、17种游离氨基酸(赖氨酸、精氨酸、谷氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、脯氨酸)、不同分子量的活性肽、多糖，养分含量丰富，菌体活性高，货架期达到2年以上，菌剂中的活性肽、游离氨基酸，易于被作物吸收，促进干物质的合成，使产品色泽更浓、个头更大、vc及糖分更高，极大提高作物产量和品质。氨基酸、活性肽能促进光合作用，提高微量元素等营养物质在植物体内的吸收和运输效率，刺激作物根系发达，茁壮作物枝干，促进作物开花、坐果，增强作物抗寒、抗旱、抗病与抗虫能力，使作物膨果快、坐果率高，延长作物采收期。菌剂中的多糖等物质与肥料中的养分结合，能够减少化学肥料氮、磷、钾养分的流失以及磷元素的固定，促进养分元素在作物体内的转运速率，提高作物对肥料的吸收、利用效率。3.本发明的制备方法效率高、综合作用效果好本发明先后使用两种微生物对富含蛋白质的有机原料发酵处理，先使用枯草芽孢杆菌分解原料中的酪蛋白、丝蛋白后，然后使用巨大芽孢杆菌分解原料中的脂蛋白、磷蛋白。减少了微生物之间的相互影响，提高了游离氨基酸、活性肽的转化效率，在每亩地使用量几公斤的条件下能起到很好的提高肥料利用率、作物增产的效果。大田实验结果显示，与空白对照相比本菌剂在大棚番茄种植实验增产高达19.49％，葡萄增产高达25.98％，糖酸比增加7％以上，彩椒增产高达11.41％，且能够使采收期提前3-7天，维生素c、可溶性固形物含量提高15％以上。4.本发明的制备方法工艺简单、生产周期短本发明利用麦麸、豆粕粉等为原料，无需化学工艺处理和额外加酶酶解，整个生产过程全部通过微生物发酵实现，无需分离、提纯等繁琐、耗能的后处理过程，也无需额外添加活体微生物，大大降低了复合氨基酸、活性肽菌剂的生产成本。枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌组合发酵，整个发酵周期3天左右，在获得大量游离氨基酸、活性肽、多糖、吲哚乙酸等代谢产物的同时，还获得大量的微生物芽孢。5.本发明菌剂的发酵及制备方法设计科学合理本发明将菌株通过枯草芽孢杆菌高密度发酵活性肽、游离氨基酸、多糖后期，再添加耐高温活性功能菌株巨大芽孢杆菌进行复合菌株的扩繁，待巨大芽孢杆菌产芽孢率达到90％以上时停止发酵，进行烘干后粉碎，得到复合氨基酸、活性肽菌剂，含17种游离氨基酸、多糖、活性肽、活体芽孢，养分含量丰富，菌体活性高。多种有机养分配合微生物协同作用，使活性肽菌剂肥效大大提高，经过田间实验，取得了良好的效果。对两种作物进行的田间试验显示，与不施本发明菌剂的处理相比，本发明的菌剂在大棚草莓的增产率为7.2-12.5％，vc含量提高6.2-7.9％，番茄增产7.3-11.2％，vc含量提高6.9-9.1％。附图说明图1为本发明实施例1-4制得的微生物菌剂中发酵活性肽蛋白电泳照片，图中，泳道1、实施例1，泳道2、实施例2，泳道3、实施例3，泳道4、实施例4。图2为本发明实施例1制得的微生物菌剂中17种游离氨基酸的色图谱。图3为本发明实施例2制得的微生物菌剂中17种游离氨基酸的色图谱。图4为本发明实施例3制得的微生物菌剂中17种游离氨基酸的色图谱。图5为本发明实施例4制得的微生物菌剂中17种游离氨基酸的色图谱。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面以具体实施例来进一步清楚地解释本发明，但是不以任何方式构成对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。巨大芽孢杆菌选用hb菌株，于2016年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.11961。枯草芽孢杆菌选用acccno.1102，中国农业微生物菌种保藏管理中心购得。实施例1：一种多肽农用微生物菌剂的制备方法，步骤如下：(1)功能菌枯草芽孢杆菌种子液制备a、将低温保存的枯草芽孢杆菌菌株p-1在lb平板培养基上活化，挑取单菌落在lb培养基斜面培养基上37℃培养24h，得活化的菌株；b、用无菌的接种环刮取一环步骤a活化的菌株接种到50ml液体种子培养基中，在35℃培养18h，即得枯草芽孢杆菌种子液，种子液中活菌数3.8*109cfu/ml。(2)功能菌巨大芽孢杆菌种子液制备a、将低温保存的巨大芽孢杆菌菌株hb在lb平板培养基上活化，挑取单菌落在lb斜面培养基上37℃培养24h，得活化的菌株；b、用无菌的接种环刮取一环步骤a活化的菌株接种到50ml液体种子培养基中，在35℃培养18h，即得巨大芽孢杆菌种子液，种子液中活菌数1.9*109cfu/ml。(3)混合料的制备按质量份，取豆粕粉40份，水稻秸秆粉10份，麦麸10份，酒糟25份，玉米粉5份，放入容器内混合均匀，加水调整至水分含量60％，于30℃条件下放置18小时；120℃条件下蒸煮25min，得混合料，冷却备用；(4)发酵物的制备按质量份，取步骤(3)制备的混合料，按30％的接种量接入步骤(1)制备的枯草芽孢杆菌种子液，混合均匀，于35℃条件下放置28小时，然后搅拌均匀，按照15％的接种量接入步骤(2)制备的巨大芽孢杆菌种子液，混合均匀，再提高温度至38℃，继续发酵35小时，发酵结束后将温度降至室温，得到发酵物；(5)微生物菌剂的制备将步骤(4)中的发酵物在80℃条件下进行干燥，经粉碎处理后得到富含高含量活菌、复合氨基酸及活性肽的农用微生物菌剂。依据国标gb/t2087-2006中的方法进行检测，结果为：微生物菌剂中含有效活菌数35亿/g，游离氨基酸4.9％，活性肽11.5％。从图1、附图2中可以看出，得到的微生物菌剂中含有17种氨基酸，多种活性肽。实施例2：一种多肽农用微生物菌剂的制备方法，步骤如下：(1)功能菌枯草芽孢杆菌种子液的制备同实施例1，种子液中活菌数为3.2*109cfu/ml。(2)功能菌巨大芽孢杆菌种子液的制备同实施例2，种子液中活菌数为2.2*109cfu/ml。(3)混合料的制备按质量份，取豆粕粉80份，花生秸秆粉5份，麦麸5份，酒糟5份，玉米粉5份，放入容器内混合均匀，加水调整至水分含量70％，于28℃条件下放置24小时；121℃条件下蒸煮20min，得混合料，冷却备用；(4)发酵物的制备按质量份，取步骤(3)制备的混合料，按15％的接种量接入步骤(1)制备的枯草芽孢杆菌种子液，混合均匀，于34℃条件下放置30小时，然后搅拌均匀，按照20％的接种量接入步骤(2)制备的巨大芽孢杆菌种子液，混合均匀，再提高温度至39℃，继续发酵38小时，发酵结束后将温度降至室温，得到发酵物；(5)微生物菌剂的制备将步骤(4)中的发酵物在90℃条件下进行干燥，经粉碎处理后得到富含高含量活菌、复合氨基酸及活性肽的农用微生物菌剂。依据国标gb/t2087-2006中的方法进行检测，结果为：微生物菌剂中含有效活菌数49亿/g，游离氨基酸11.6％，活性肽20.5％。从图1、附图3中可以看出，得到的微生物菌剂中含有17种氨基酸，多种活性肽。实施例3：一种多肽农用微生物菌剂的制备方法，步骤如下：(1)功能菌枯草芽孢杆菌种子液的制备同实施例1，种子液中活菌数为3.72*109cfu/ml。(2)功能菌巨大芽孢杆菌种子液的制备同实施例2，种子液中活菌数为2.89*109cfu/ml。(3)混合料的制备按质量份，取豆粕粉65份，玉米秸秆粉15份，麦麸5份，酒糟10份，玉米粉5份，放入容器内混合均匀，加水调整至水分含量65％，于30℃条件下放置20小时；121℃条件下蒸煮25min，得混合料，冷却备用；(4)发酵物的制备按质量份，取步骤(3)制备的混合料，按25％的接种量接入步骤(1)制备的枯草芽孢杆菌种子液，混合均匀，于35℃条件下放置28小时，然后搅拌均匀，按照20％的接种量接入步骤(2)制备的巨大芽孢杆菌种子液，混合均匀，再提高温度至40℃，继续发酵38小时，发酵结束后将温度降至室温，得到发酵物；(5)微生物菌剂的制备将步骤(4)中的发酵物在100℃条件下进行干燥，经粉碎处理后得到富含高含量活菌、复合氨基酸及活性肽的农用微生物菌剂。依据国标gb/t2087-2006中的方法进行检测，结果为：微生物菌剂含有效活菌数28亿/g，游离氨基酸7.88％，活性肽11.1％。从图1、附图4中可以看出，得到的微生物菌剂中含有17种氨基酸，多种活性肽。实施例4：一种多肽农用微生物菌剂的制备方法，步骤如下：(1)功能菌枯草芽孢杆菌种子液的制备同实施例1，种子液活菌数3.89*109cfu/ml。(2)功能菌巨大芽孢杆菌种子液的制备同实施例2，种子液活菌数2.12*109cfu/ml。(3)混合料的制备按质量份，取豆粕粉60份，玉米秸秆粉15份，麦麸5份，酒糟10份，玉米粉10份，放入容器内混合均匀，加水调整至水分含量65％，于30℃条件下放置20小时；121℃条件下蒸煮20min，得混合料，冷却备用；(4)发酵物的制备按质量份，取步骤(3)制备的混合料，按20％的接种量接入步骤(1)制备的枯草芽孢杆菌种子液，按照20％的接种量接入步骤(2)制备的巨大芽孢杆菌种子液，混合均匀，于35℃条件下放置28小时，然后搅拌均匀，再提高温度至40℃，继续发酵42小时，发酵结束后将温度降至室温，得到发酵物；(5)微生物菌剂的制备将步骤(4)中的发酵物在110℃条件下进行干燥，经粉碎处理后得到富含高含量活菌、复合氨基酸及活性肽的农用微生物菌剂。依据国标gb/t2087-2006中的方法进行检测，结果为：微生物菌剂含有效活菌数20亿/g，游离氨基酸6.1％，活性肽11.59％。从图1、附图5中可以看出，得到的微生物菌剂中含有17种氨基酸，多种活性肽。对比例1一种农用微生物菌剂的制备方法，如实施例1所述，不同之处在于：该方法只接种枯草芽孢杆菌种子液进行发酵，发酵条件同实施例1。对比例2一种农用微生物菌剂的制备方法，如实施例1所述，不同之处在于：该方法只接种巨大芽孢杆菌种子液进行发酵，发酵条件同实施例1。对比例3一种农用微生物菌剂的制备方法，如实施例1所述，不同之处在于：该方法采用枯草芽孢杆菌种子液与巨大芽孢杆菌种子液混合后进行接种，接种量及发酵条件同实施例1。对比例4一种农用微生物菌剂的制备方法，如实施例1所述，不同之处在于：该方法采用的巨大芽孢杆菌为普通市售巨大芽孢杆菌，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：cgmccno.1.1870。实验例：实施例1-4和对比例1-4的应用效果如下：实验时间：2015年9月至2016年8月。寿光大棚番茄试验：设实施例1-4和对比例1-4共8个处理。每个小区面积66平方米，实施例1-4、对比例1-4的菌剂产品用量为每亩5公斤，同时以不施菌剂作为对照例。施用方法是在番茄移栽前施入栽培穴内，与土混合后栽植番茄幼苗，其它肥料施用按照农民习惯施肥统一进行，所有的管理措施一致。应用效果见表1、2。表1实施例与对比例、对照例的番茄产量、vc含量及可溶性固形物含量测试结果表2.与对照例相比实施例1-4的番茄应用效果％2、临沂露天葡萄试验：设实施例1-4和对比例1-4共8个处理。每个小区面积30平方米，实施例1-4、对比例1-4的菌剂产品用量为每亩8公斤，同时以不施菌剂作为对照例。施用方法是在葡萄移栽前施入栽培穴内，与土混合后栽植葡萄幼苗，其它肥料施用按照农民习惯施肥统一进行，所有的管理措施一致。应用效果见表3、4。表3.实施例与对比例、对照例的葡萄产量、糖酸比及可溶性固形物含量测试结果表4.与对照例相比实施例1-4的葡萄应用效果％3、临沂大棚彩椒试验：设实施例1-4和对比例1-4共5个处理。每个小区面积20平方米，实施例1-4的菌剂产品用量为每亩8公斤，对照例为不施菌剂对照。施用方法是菌剂作为基肥使用，与土混匀撒施后翻耕，其它肥料施用按照农民习惯施肥统一进行，所有的管理措施一致。应用效果见表5、6。表5.实施例与对比例、对照例的彩椒产量、vc含量测试结果表6.与对比例相比实施例1-4的彩椒应用增产效果％项目相比于对照例增产率％相比于对照例vc提高％实施例110.0912.6实施例211.4118.27实施例39.8218.9实施例48.5717.64综上，本发明的微生物菌剂中含有大量高活性的巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌的芽孢休眠体，有效活菌数最高达50亿/g，17种游离氨基酸(赖氨酸、精氨酸、谷氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、脯氨酸)、不同分子量的活性肽、多糖，养分含量丰富，菌体活性高，促进养分元素在作物体内的转运速率，提高作物对肥料的吸收、利用效率，提高作物的产量及品质。当前第1页12