拮抗水稻白叶枯病菌的菌核曲霉As‑75菌株及其发酵培养液和应用的制作方法

本发明属于生物技术微生物领域，涉及1株拮抗水稻白叶枯病菌的菌核曲霉(aspergillussclerotiorum)as-75菌株及其在植物病害防冶中的应用。

背景技术：

水稻白叶枯病与稻瘟病、纹枯病一起被称为水稻的“三大病害”。水稻白叶枯病俗称白叶痕、地火烧等，是一种世界性的细菌病害，由水稻黄单胞菌致病变种(xanthomonasoryzaepv.oryzae，xoo)引起。水稻遭受白叶枯病后，一般减产10％～30％，发病严重的可达50％，甚至绝收；品质变差，米质松脆，口感差；严重威胁全球农业和粮食生产。为此，寻求防治白叶枯病发生的有效生物防治方法对农业生产具有重要的意义。

曲霉(aspergillus)广泛分布于谷物、空气、土壤和各种有机物品上，与人类的生产、生活和医药卫生等密切相关，是发酵工业和食品加工业的重要菌种，已被利用的有近60种。如米曲霉(aspergilluoryzae)可用于酒、豆酱、酱油等的酿造；酱油曲霉(a.sojae)可用于蛋白酶的生产；黑曲霉(a.niger)可用于柠檬酸的生产；土曲霉(a.terreus)可用于衣康酸和洛伐他汀的生产等。近几年许多曲霉新代谢活性物质的功效相继被证实，如抑制癌细胞增殖和抗真菌的多肽、促进植物生长的赤霉素、可用于灭蚊的生物活性物质、可降解塑料的酶、生产降血压药洛伐他汀等，均引起了国内外研究学者的广泛关注。

水稻是全球最主要的粮食之一，而水稻白叶枯病菌会对水稻品质和产量产生严重的影响，目前，主要以化学防冶为主，但是化学农药会污染环境、易产生抗药性等的问题。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一株菌核曲霉(a.sclerotiorum)as-75菌株，本发明的第二个目的是提供上述的菌核曲霉as-75菌株的发酵培养液，本发明的第三个目的是提供上述的发酵培养液的应用。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

菌核曲霉(aspergillussclerotiorum)as-75菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是：中国武汉武汉大学，保藏编号为：cctccno：m2017350，保藏日期为：2017年6月19日。

本发明从浙江省各地不同生境收集的发酵样品(土壤、食品、空气、有机质等)中分离纯化获158株曲霉纯菌株；经筛选获1株拮抗水稻白叶枯病菌较强的优质菌株，编号为as-75，分离自水稻根际土壤；根据形态特征和itsrdna基因序列，鉴定as-75菌株为菌核曲霉(aspergillussclerotiorum)。

为了实现上述的第二个目的，本发明还公开了上述的菌核曲霉as-75菌株的发酵培养液。

为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案：

上述的菌核曲霉as-75菌株的发酵培养液用于拮抗水稻白叶枯病菌(xanthomonasoryzaepv.oryzae，xoo)。

上述的菌核曲霉as-75菌株的发酵培养液用于抑制金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、小麦赤霉病菌或杨树枯萎病菌。

本发明还公开了一种生物农药，该生物农药包括所述的菌核曲霉as-75菌株的发酵培养液。

本发明的菌核曲霉(a.sclerotiorum)as-75菌株可用于拮抗水稻白叶枯病菌，制备生物农药，用于水稻白叶枯病的防治。同时，对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌等细菌也有一定的抑制作用，对小麦赤霉病菌和杨树枯萎病菌等植物病原真菌有较强的抑制作用。可为微生物源农药开发提供优良的菌株，菌核曲霉as-75菌株在水稻白叶枯病等生物防冶上有较好的应用前景。

附图说明

图1曲霉as-75菌株pda培养基上培养15d菌落正面和背面。

图2曲霉as-75菌株分生孢子头自然生长形态特征(100倍)。

图3曲霉as-75菌株分生孢子头形态特征(400倍)。

图4曲霉as-75菌株分生孢子形态特征(400倍)。

图5曲霉as-75菌株itsrdna基因序列(580bp)。

图6基于itsrdna基因序列建立的曲霉as-75菌株系统发育树。

图7曲霉as-75菌株发酵滤液对水稻白叶枯病菌的抑菌效果。1为白叶枯病菌，2为对照组，3为发酵滤液，4为抑菌圈。

图8曲霉as-75菌株发酵滤液对4种植物病原真菌的抑制作用。注：从左到右依次为杨树枯萎病菌、小麦赤霉病菌、黄瓜枯萎病菌和番茄早疫病菌。

图9高温对曲霉as-75菌株发酵滤液拮抗水稻白叶枯病菌效果的影响。

图10酸碱度对曲霉as-75菌株发酵滤液拮抗水稻白叶枯病菌效果的影响。

具体实施方式

下面对本发明具体实施方式做一个详细的说明。

实施例1菌核曲霉(aspergillussclerotiorum)as-75菌株的分离、筛选和鉴定

1培养基

(1)pda培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂粉20g，水1l，ph6.5。用于曲霉菌株的分离纯化和鉴定。

(2)改良pd培养液：马铃薯200g、葡萄糖20g、牛肉膏5g、水1l，ph6.5。用于曲霉菌株发酵培养。

(3)水稻白叶枯病菌固体培养基(xoo固体培养基)：马铃薯300g，胰蛋白胨5g，蔗糖15g，ca(no3)·h2o0.5g，na2hpo4·12h2o2g，琼脂粉20g，水1l，ph6.5。用于水稻白叶枯病菌的固体培养。

(4)水稻白叶枯病菌培养液(xoo培养液)：马铃薯300g，胰蛋白胨5g，蔗糖15g，ca(no3)·h2o0.5g，na2hpo4·12h2o2g，水1l，ph6.5。用于水稻白叶枯病菌的液体培养。

2实验方法

2.1拮抗水稻白叶枯病菌曲霉的共培养初筛

(1)曲霉菌株的活化和复壮：将实验室保藏的158株曲霉菌株分批接入pda培养基平板上，28℃活化培养48h；待白色绒毛状菌丝长出后，取少许菌丝转接于另一pda培养基平板上继续复壮培养4d。

(2)水稻白叶枯病菌的培养：取水稻白叶枯病菌接入xoo培养液中，于摇床上(28℃，180r/min)振荡培养48h。之后取150μl水稻白叶枯病菌菌液涂布于xoo固体培养基平板上，于28℃培养30min。

(3)共培养：取已复壮曲霉菌饼(直径6mm)接种于pda培养基平板上，利用共培养的方法初步筛选出对水稻白叶枯病菌有拮抗作用的曲霉菌株。

2.2拮抗水稻白叶枯病菌曲霉菌株的牛津杯法复筛

挑取已纯化曲霉菌丝接种到装有约100ml改良pd培养液的锥形瓶中，于摇床上(28℃，180r/min)振荡培养。培养9d后，得发酵液，将发酵液在室温下经真空抽滤后得滤液。滤液用牛津杯法测定对水稻白叶枯病菌的抑菌效果，用十字交叉法测量抑菌圈的大小，筛选出拮抗效果好的曲霉菌株。

2.3as-75菌株的形态观察和itsrdna基因测序

用镊子挑取少量as-75菌株菌丝，转接于pda培养基平板中，活化培养3d；取平皿中1菌饼(直径6mm)接种于新的pda培养基平板上，28℃培养5d，显微镜观察as-75菌株的菌丝、分生孢子头、分生孢子梗、分生孢子等的形态特征，并拍照。提取as-75菌株的基因组dna，扩增itsrdna基因序列，送上海生物工程公司测序。

3实验结果

3.1拮抗水稻白叶枯病菌曲霉菌株的筛选

利用共培养法和牛津杯法对实验室保藏的158株曲霉纯菌株进行对水稻白叶枯病菌拮抗作用的初筛和复筛。获1株具有较强抑菌作用曲霉菌株，编号为as-75，抑菌圈直径达31mm(附图7)，as-75曲霉菌株分离自水稻根际土壤。

3.2曲霉as-75菌株的鉴定结果

as-75菌株形态特征：在pda培养基上30℃培养3d即形成较典型的菌落。菌落初期为白色绒毛状，2d后开始出现出现孢子，培养3d后出现大量白色圆形菌核；菌落中心凸起，周边平坦，质地绒状；菌落气生菌丝少而短小，分生孢子结构生长较稀疏，呈浅黄色，菌落全面产生大量菌核(附图1)；显微镜观察菌丝细胞丝状交织，具隔膜；分生孢子头球形至辐射形，200～500μm，球形者老后裂成几个致密的柱状体，也有少数呈疏松柱形者；分生孢子梗生自基质，孢梗茎200～700μm×6～11μm，壁厚可达1.2μm，近于光滑或显著粗糙，黄褐色；顶囊球形或近球形25～35μm，全部表面可育；产孢结构双层；梗基8～12μm×3～5μm，瓶梗8～11μm×2～2.5μm(附图2，附图3)；分生孢子球形或近球形，较小，2.5～3μm，壁光滑(附图4)；菌核多为球形或近球形，直径1000～1500μm。

as-75菌株的itsrdna基因序列：分析结果表明，as-75菌株的itsrdna基因序列长度为580bp(附图5)，基于itsrdna基因序列建立的曲霉(aspergillus)系统发育树表明，与菌核曲霉(aspergillussclerotiorum)的进化距离最近(附图6)。根据as-75菌株的形态特征和itsrdna基因序列，鉴定为菌核曲霉(aspergillussclerotiorum)。

实施例2菌核曲霉(a.sclerotiorum)as-75菌株的抗菌谱及稳定性测定

1菌株：

(1)菌核曲霉(a.sclerotiorum)as-75菌株。

(2)3种细菌：金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、大肠杆菌(escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，用作细菌抗菌谱测试。

(3)4种植物病原真菌：小麦赤霉病菌(gibberellafujikuroi)、番茄早疫病菌(alternariasolani)、杨树枯萎病菌(fusariumsolani)、黄瓜枯萎病菌(fusariumoxysporumf.sp.momordicae)，用作真菌抗菌谱测试。

2培养基

(1)pda培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂粉20g、水1l、ph6.0～6.5。用于曲霉as-75菌株的活化培养和3种抗菌谱测定真菌的培养。

(2)lb液体培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠5g、水1l、ph7.2～7.4。用于3种抗菌谱测定细菌的培养。

(3)pd培养液：马铃薯200g、葡萄糖20g、水1l、ph6.0～6.5。用于曲霉as-75菌株的种子培养。

(4)发酵培养液：马铃薯200g、葡萄糖20g、蛋白胨5g、水1l、ph6.0～6.5。用于as-75菌株发酵培养。

3实验方法

3.1as-75菌株的培养

用接种针挑少量as-75菌株菌丝，转接于pda培养基平皿中，活化培养4d；取平皿中3个菌饼(直径6mm)接种于pd种子培养液中，摇床培养3d，制得种子液；在发酵培养液中，按6％接入种子液，180r/min摇床培养9d，得as-75菌株发酵液，用于抗菌谱和稳定性测定。

3.2as-75菌株抗菌谱测定

将as-75菌株发酵液用真空抽滤得滤液，滤液进一步用0.22μm微孔滤膜过滤，待用。用牛津杯法(200μl滤液)，以lb液体培养基为对照，测定as-75菌株发酵培养液对3种细菌的抑制作用；用pd培养液为对照，测定as-75菌株发酵培养液对4种植物病原真菌的抑制作用。抑菌圈大小用十字交叉法测量，每组处理重复三次，计算菌丝生长抑制率(％)。

3.3曲霉as-75菌株抑菌成分的稳定性分析

3.3.1高温稳定性

将as-75菌株发酵液，用真空抽滤后得滤液，滤液分装于7个10ml离心管中，每管装5ml，分别在50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃、121℃保温条件下处理2h。将处理后的样品用0.22μm微孔滤膜过滤，再用牛津杯法(200μl滤液)测定其抑菌活性，记录抑菌圈大小。用不作处理的发酵液滤液(28℃)作为对照，每组处理重复三次。

3.3.2酸碱稳定性

将as-75菌株发酵液，用真空抽滤后得滤液，分装于10个10ml离心管中，每管5ml，用1mol/lnaoh和1mol/lhcl溶液将as-75菌株发酵液ph标定分别至ph2.5、ph3.5、ph4.5、ph5.5、ph6.5、ph7.5、ph8.5、ph9.5、ph10.5、ph11.5。处理2h后，再调回原始ph6.5。将处理后的样品用0.22μm微孔滤膜过滤，再用牛津杯法测定其抑菌活性，记录抑菌圈大小。以不作处理的发酵液滤液(ph6.0～6.5)作为对照，每组处理重复三次。

4实验结果

4.1as-75菌株抗菌谱测定结果

as-75菌株对3种细菌的抑制效果：对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌均有一定的抑制作用，抑菌圈直径分别为11mm和12mm；但对大肠杆菌无抑制作用。

as-75菌株对4种植物病原真菌的抑制效果：as-75菌株发酵液对杨树枯萎病菌和小麦赤霉病菌有较强抑制作用，菌丝生长抑制率分别为38.1％和36.5％；对黄瓜枯萎病菌和番茄早疫病菌抑制作用较弱(附图8，表1)。

表1曲霉as-75菌株发酵培养液对4种植物病原菌的抑制效果

注：菌丝生长抑制率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-6)×100

4.2曲霉as-75菌株抑菌活性成分稳定性测定结果

4.2.1高温稳定性

当温度低于70℃范围内时，发酵培养液的抑菌效果与对照接近，无显著差异，稳定性较好；当温度高于70℃时，发酵液的抑菌效果随着温度升高而降低；当温度为121℃时，发酵液的抑菌圈直径仅为11mm，与对照(抑菌圈直径31mm)相比，抑菌能力大幅度下降(附图9)。

4.2.2酸碱稳定性

当ph为6.5时，as-75菌株发酵液的抑菌活性与对照组相近，无显著差异，稳定性最好；在ph2.5-6.5范围内，as-75菌株发酵液的抑菌活性呈上升趋势；随着碱性不断增强，as-75菌株发酵液的抑菌活性呈下降趋势，ph8.5～10.5范围内，抑菌活性趋于稳定。表明该拮抗物质对酸碱环境具有一定的耐受力(附图10)。