本发明涉及一种染色体和基因探针组合物及试剂盒，尤其涉及一种检测骨髓增生异常综合症的染色体和基因探针组合物及试剂盒。
背景技术：
骨髓增生异常综合症(mds)是一组异质性的造血干祖细胞恶性克隆性疾病，以骨髓细胞异常增殖、分化、成熟，骨髓衰竭，细胞凋亡增加、髓系一系或多系血细胞减少，无效造血以及急性髓细胞性白血病(aml)转化风险增高为主要特征。在mds中，异常的造血干祖细胞恶性增殖，其子代细胞迅速侵占整个骨髓，且该细胞仍然保持着成熟的能，但其凋亡能力也增强，即过度凋亡，故临床上表现为无效造血及外周血细胞减少。
由于mds的异质性，不同的mds患者有不同的临床表现，而临床表现的多样性可能是因为不同的患者有不同的染色体异常的类型。临床上大约有40％-60％的mds患者有染色体的异常，其中以5q的缺失(5q-)、5号染色体单体(-5)、7q的缺失(7q-)、7号染色体单体(-7)、20q的缺失(20q-)、8号染色体三体(+8)、y号染色体单体(-y)为主，不同染色体异常的患者有着不同的临床特征和发病过程，所以染色体的异常与mds患者的诊断、治疗及预后有很大的相关性。目前，临床上对染色体异常的诊断方法主要是常规细胞遗传学(cc)分析和荧光原位杂交(fish)分析，虽然常规细胞遗传学分析法(主要为核型分析)比较可靠，也是检测染色体异常的金标准，但是cc需要分离培养细胞，诱导其成为中期细胞才能进行检测，且该分析方法缺乏灵敏度。另外，mds临床表现是血细胞减少且细胞又比较难于扩增，如果得不到足够数量的中期细胞，cc分析方法则不能得到足够的诊断信息。荧光原位杂交(fish)技术是利用碱基的互补性，将标记荧光素的探针与待检测的样本dna进行杂交，通过荧光显微镜收集荧光信号对待测核酸进行定性、定量及相对定位分析。fish与cc相比其优势是无需分离培养细胞，直接用间期细胞就可以进行检测，且比cc更灵敏。因此，现在fish越来越多地用于mds的诊断。定量多基因荧光原位杂交技术(qm-fish)是指在同一时间内定量单个肿瘤细胞核的多个基因，可用于大规模研究临床肿瘤标本基因拷贝数的变化。然而，目前大多数在临床中使用的fish试剂盒为单色或双色试剂盒，在mds染色体异常的检测中需要进行多次(5次以上)检测。但mds是一种细胞减少的疾病，其骨髓血样往往不够进行多次检测。因此，本项目旨在研发一种高分辨多色fish诊断试剂盒，可在单个细胞水平同时检测多种染色体的异常，对于mds这种有多种染色体异常且细胞量减少的疾病的诊断、分型、治疗、预后评估具有重要意义。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是：提供一种检测骨髓增生异常综合症的染色体和基因探针组合物及试剂盒，可以用于确定骨髓增生异常综合症的分子病理类型，判断病情预后，指导个体化治疗，评估临床治疗效果，监测病灶复发和转移。
为了解决上述问题，本发明采用的技术方案为：
本发明提供了一种检测骨髓增生异常综合症的染色体和基因探针组合物，包括20q12探针，5p15.2探针，egr1探针，cspy探针，csp8探针，csp7探针和d7s486探针。
具体地，所述探针组合物包括：
优选地，所述20q12探针，5p15.2探针，egr1探针，cspy探针，csp8探针，csp7探针和d7s486探针均为经过荧光素标记的探针。
优选地，所述的探针组合物分为两组：
第一组kit1含4个探针：5p15.2/egr1/20q12/cspy；
第二组kit2含3个探针：csp7/d7s486/csp8；
每组的探针之间采用不同颜色的荧光素标记。
根据本发明一个优选的实施方案，20q12,5p15.2,egr1,cspy,csp8,csp7和d7s486单个探针制备步骤如下：
1)克隆筛选：检索ucscgenomebrowser，ncbicloneregistry，ensemblgenomebrowser等数据库分别含20q12,5p15.2,egr1,cspy,csp8,csp7和d7s486的所有克隆，并对这些克隆进行筛选，选择最佳的克隆。
2)克隆培养：按照筛选确定的克隆编号购买bac克隆(美国invitrogen公司)，划线接种到含有氯霉素的琼脂平板上，37℃培养过夜；挑取单克隆到3-5毫升含氯霉素抗性的lb液体培养基中，37℃振摇活化培养8-16小时；然后将菌液全部加入至400-500毫升含氯霉素抗性的lb液体培养基中，37℃震摇培养16-24小时。
3)探针的制备和鉴定：获得bac克隆后，提取大量dna，用nd-1000超微量分光光度计对质粒进行浓度和纯度(260nm/280nm)测定。酶切dna后采用缺口平移的方法进行荧光素标记(选择最佳的荧光染料和镜检的荧光显微镜的滤光片匹配组合，使检测到的荧光信号强度最大)，标记好的探针用1-2％的琼脂糖凝胶电泳对产物进行分析。对选取的20q12,5p15.2,egr1,cspy,csp8,csp7和d7s486的各个bac克隆连接好荧光素后进行沉淀和浓缩，溶解到含有50％去离子甲酰胺的杂交缓冲液中，用fish杂交的方法在正常人二倍体成纤维细胞(hdf)爬片上进行杂交，从而完成待选克隆的分子鉴定。
根据本发明一个优选的实施方案，20q12,5p15.2,egr1,cspy,csp8,csp7和d7s486探针组合物的制备步骤如下：
1)克隆筛选：检索ucscgenomebrowser，ncbicloneregistry，ensemblgenomebrowser数据库分别含有20q12,5p15.2,egr1,cspy,csp8,csp7和d7s486的所有细菌人工染色体(bac)克隆，根据单个探针连接后产物琼脂糖凝胶电泳和fish鉴定的结果，选出每种探针中最佳的克隆。
2)克隆培养：将筛选确定的bac克隆划线接种到含有氯霉素的琼脂平板上，37℃培养过夜。挑取单克隆到3-5毫升含氯霉素抗性的lb液体培养基中，37℃振摇活化培养8-16小时。然后将菌液全部加入至400-500毫升含氯霉素抗性的lb液体培养基中，37℃震摇培养16-24小时。
3)探针的制备和验证：获得每组目的染色体和基因的克隆后，提取大量dna，用nd-1000超微量分光光度计对质粒进行浓度和纯度(260nm/280nm)测定。酶切dna后采用缺口平移的方法进行荧光素标记(选择最佳的荧光染料和镜检的荧光显微镜的滤光片匹配组合，使检测到的荧光信号强度最大)。将连接好荧光素的探针分为两组：第一组：kit1：20q12-b,5p15.2-g,egr1-o,cspy-r；第二组：kit2：csp8-b,csp7-g和d7s486-o进行沉淀和浓缩，溶解到含有50％去离子甲酰胺的杂交缓冲液中，即得两组的荧光标记探针杂交混合液，用fish杂交的方法在正常人二倍体成纤维细胞(hdf)爬片上进行杂交，从而完成两组探针的fish验证。
根据本发明一个优越的实施方案，克隆筛选步骤中
含20q12基因最优的克隆，为如下编号的一种、两种或三种组合：
20q12-r1：rp11-879b22；
20q12-r2：ctd-2504c8；
20q12-r3：rp11-773o18；
含5p15.2最优的克隆，为如下编号的一种或两种组合：
5p15.2-r1：rp11-1047j7；
5p15.2-r2：rp11-1021k13；
含有egr1最优的克隆，为如下编号的一种或两种组合：
egr1-r1：rp11-461o14，
egr1-r2：ctd-2108n19；
含有cspy最优的克隆，为如下编号的一种或两种组合：
cspy-r11：rp11-960m2，
cspy-r14：ctd-2657k20；
含有csp8最优的克隆，为如下编号的一种、两种或三种组合：
csp8-r1：rp11-747k13；
csp8-r2：rp11-31i4；
csp8-r3：rp11-112b4；
含有csp7最优的克隆，为如下编号的一种或两种组合：
csp7-r4：rp11-1054n15；
csp7-r5：rp11-357n20；
含有d7s486最优的克隆，为如下编号的一种或两种组合：
d7s486-r1：rp11-258a7；
d7s486-r2：rp11-51m22。
以上克隆均来自ucscgenomebrowser数据库。
根据本发明一个优越的实施方案，克隆培养和鉴定步骤中使用的每种探针标记总长分别为：20q12的fish标记片段总长为531kb；5p15.2标记片段总长为542kb；egr1标记片段总长为334kb；cspy标记片段总长为404kb；csp8标记片段总长为321kb；csp7标记片段总长为343kb；d7s486标记片段总长为358kb。
根据本发明的一个优选方法：探针制备过程中用ecor1酶对目的dna进行酶切，ecor1酶的浓度为0.1单位/微升；50微升切口平移体系中脱氧核糖核酸聚合酶i的使用量为10个单位，脱氧核糖核酸酶i使用量为50纳克。
根据本发明一个优选方案，在将标记好荧光素的dna进行沉淀时，加入三种人类未标记的竞争性cotdna，ssdna和trna重复序列脱氧核糖核酸，以降低杂交反应时产生的荧光背景，其中cotdna，ssdna和trna沉淀时的使用浓度均为1毫克/毫升，沉淀的体系为300微升。
根据本发明一个优选方案，基因探针浓缩方法为乙醇(-20℃)沉淀浓缩，最后使用杂交缓冲液溶解沉淀。
根据本发明一个优选实施方案，杂交缓冲液的组分包括50％的去离子甲酰胺，2×ssc和0.1克/毫升的硫酸葡聚糖。
本发明的另一目的是提供了一种骨髓增生异常综合症荧光原位杂交检测试剂盒，该试剂盒包括上述的探针组合物。优选地，所述的探针组合物分为两组，第一组四个探针，第二组三个探针。
优选地，所述第一组四个探针为：5p15.2/egr1/20q12/cspy，采用不同颜色荧光素标记，如5p15.2-g/egr1-o/20q12-b/cspy-r；第二组三个探针为：csp7/d7s486/csp8，采用不同颜色的荧光素标记，如csp7-g/d7s486-o/csp8-b。使用时，在同一骨髓涂片上标记出2个反应区域，一组探针对应一个反应区域，加入探针，进行杂交。(通过这样的策略，可以对同一白血病样本同时检测7个基因靶点，显著提高了检测能力和效率。)
优选地，所述探针组合物分两组，分别溶解在杂交缓冲液中，第一组中，20q12探针的浓度为：4纳克/微升，5p15.2探针的浓度为:4纳克/微升,egr1探针的浓度为：4纳克/微升，cspy探针的浓度为：4纳克/微升，第二组中，csp8探针的浓度为：4纳克/微升，csp7探针的浓度为：4纳克/微升，d7s486探针的浓度为：4纳克/微升。
更优选地，所述杂交缓冲液的组分包括50％的去离子甲酰胺，2×ssc和0.1克/毫升的硫酸葡聚糖。
优选地，所述试剂盒还包括dapi复染液。
优选地，所述试剂盒还包括20xsspe洗涤液。
优选地，所述试剂盒还包括包装试剂管的塑料包装盒。
本发明还提供了上述试剂盒在骨髓增生异常综合症荧光原位杂交检测中的应用，包括如下步骤：
1)标本处理和制片：收集病人骨髓细胞，用0.075摩尔/升的kcl低渗液去除骨髓中的红细胞，用固定液(甲醇：冰乙酸＝3:1)室温固定细胞三次，第一次固定30分钟，第二、三次固定各15分钟，用固定液调整细胞浓度为1×105/ml，进行细胞甩片，晾干，用钻石笔标记细胞位置，用2×ssc(37℃)洗涤5分钟，梯度乙醇(70％，85％，2×100％乙醇)中脱水，3分钟/梯度，晾干后fish检测备用。
2)杂交：将要检测的标本处理好后，标记处2个反应区域，一组探针对应一个反应区域，加入探针，2微升/区域，分别加上规格为12×12mm普通盖玻片，避免产生气泡，用封片胶封片，37℃干燥20分钟，将玻片放入杂交仪中，78℃变性5分钟，37℃杂交过夜。
3)洗片：标本杂交过夜后，去除盖玻片，放入4×核酸杂交的缓冲液(salinesodiumphosphateedta，sspe)中洗涤两次，梯度乙醇中脱水，晾干，用dapi复染，在荧光显微镜下观察检测结果。
4)图像采集与分析：在荧光显微镜下使用相应的滤光片观察不同的荧光信号，对信号进行拍照和计数。
本发明所具有的有益效果：
1、目前市场上的荧光原位杂交法通常可同时检测1-2个基因；而本试剂盒可对同一骨髓增生异常综合症病人骨髓细胞进行7种基因的同时检测，显著提高了检测能力和效率。
2、本试剂盒可用于对骨髓增生异常综合症进行分子病理分型。
3、本发明试剂盒可直接用于中期或间期骨髓增生异常综合症病人骨髓细胞的荧光杂交法检测，而无需细胞培养和制备高质量的中期染色体片，操作大大简化。
附图说明
图1为用绿色荧光素greendutp标记csp7-r4，黄色荧光素promofluor-555-aadutp(pf555)标记csp7-r5(表1)的探针设计示意图和fish检测结果，将这两种探针混合后和正常人二倍体成纤维细胞进行杂交，再进行荧光显微镜镜检得到的图像。结果显示绿色和黄色探针在同一基因位点结合，细胞核中最后呈现两个荧光素信号点，每个点由绿色和黄色两种荧光素重叠而成。表明这两种含csp7的bac克隆既可单独也可联合用作检测csp7染色体的fish探针。
图2为将标记好的各种探针在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳，电泳结果呈现smear条带，即dna探针标记后含有各种不同大小的片段。其中lane1为dnamarkerd2000；lane2为5p15.2-g；lane3为egr1-o；lane4为20q12-b；lane5为cspy-r；lane6为csp7-g；lane7为d7s486-o；lane8为csp8-b。
图3是本发明将成功制作的两组探针kit1：pf415-20q12(蓝色荧光素标记的20q12探针)，green-5p15.2(绿色荧光素标记的5p15.2探针)，pf555-egr1(黄色荧光素标记的egr1探针)，pf590-cspy(红色荧光素标记的cspy探针)；kit2：pf415-csp8(蓝色荧光素标记的csp8探针)，green-csp7(绿色荧光素标记的csp7探针)，pf555-d7s486(黄色荧光素标记的d7s486探针)(表2)分别混合后对正常人二倍体成纤维细胞杂交，再进行荧光显微镜镜检得到的图像。结果显示，kit1中，在同一细胞核中，可以检测出2个蓝色、绿色、黄色、和1个红色信号；kit2中，可以分别检测出2个蓝色、绿色和黄色信号。每种探针得到的荧光信号较强，获得的图像清晰，信噪比高。
图4是本发明成功制备的kit1：pf415-20q12，green-5p15.2，pf555-egr1，pf590-cspy；kit2：pf415-csp8，green-csp7，pf555-d7s486检测试剂盒对骨髓增生异常综合症病人骨髓标本进行检测获得的图像。图a显示，kit1与5q-的mds患者骨髓细胞杂交结果，蓝色信号为20q12，绿色信号为csp5，黄色信号为egr1，红色信号为cspy，检测结果显示，egr1即5q信号缺失；图b显示，kit1与20q-的mds患者骨髓细胞杂交结果，蓝色信号为20q12，绿色信号为csp5，黄色信号为egr1，红色信号为cspy，结果显示，20q12信号缺失；图c显示，kit1与-y的mds患者骨髓细胞杂交结果，蓝色信号为20q12，绿色信号为csp5，黄色信号为egr1，红色信号为cspy，结果显示，y染色体信号缺失。图d显示，kit2与7q-的mds病人骨髓细胞杂交结果，蓝色信号为csp8，绿色信号为csp7，黄色信号为d7s486，检测结果显示，d7s486即7q信号缺失；图e显示，kit2与+8的mds患者骨髓细胞杂交结果，蓝色信号为csp8，绿色信号为csp7，黄色信号为d7s486，结果显示，8号染色体三体。
图5为在一张载玻片上同时进行7种基因和染色体的检测的示意图，如图所示，在同一张载玻片上划分出2个反应区域，左侧反应区加入kit1探针(pf415-20q12，green-5p15.2，pf555-egr1，pf590-cspy)，右侧反应区加入kit2探针(pf415-csp8，green-csp7，pf555-d7s486)。
具体实施方式
下列通过具体实施例对本发明作进一步说明，但不限定本发明的保护范围。
实施例1：csp7探针的制备和鉴定方法，包括如下步骤：
1.克隆筛选：检索ucscgenomebrowser，ncbicloneregistry，ensemblgenomebrowser数据库所有csp7着丝粒的克隆(表3)。
2.克隆培养：按克隆编号购买bac克隆(美国invitrogen公司),划线接种到含有氯霉素的琼脂平板上，37℃培养过夜。挑取单克隆到3-5毫升含氯霉素抗性的lb液体培养基中，37℃振摇活化培养8-16小时。然后将菌液全部加入至400-500毫升含氯霉素抗性的lb液体培养基中，37℃震摇培养16-24小时。
3.探针制备：
(1)使用qiagen公司的质粒提取试剂盒，按照说明书要求进行bac克隆质粒的提取和纯化。用nd-1000超微量分光光度计对质粒dna进行浓度和纯度(260nm/280nm)测定。用ecor1酶对目的dna进行酶切，方法如下：
37℃孵育1小时，加入1微升的0.5m的乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid，edta)(ph7.5)终止反应，混匀，瞬时离心。
(2)沉淀dna：加入步骤(1)总液体量1/10体积的3m乙酸钠。
(3)再加入步骤(2)总液体量2倍体积100％乙醇(-20℃)，混匀，瞬时离心，-70℃，沉淀约2小时。离心14000rpm，4℃，20分钟，用枪尖小心吸弃上清，加入100微升70％乙醇(4℃)，混匀，离心14000rpm，4℃，15分钟。用枪尖小心吸弃上清，干燥沉淀10分钟，用10微升的10mm的tris-hcl(ph8.5)重悬后在振荡器上连续震荡至少5小时，转速800rpm，将溶解好的dna放在4℃保存直至连接反应。
(4)连接反应:
采用切口平移法对酶切好的dna进行荧光素标记，对csp7-r4采用greendutp荧光素标记，csp7-r5采用promofluor-555-aadutp(pf555)荧光素标记，标记方法如下：
取避光的ep管，先加入水，最后加入dnaseⅰ(10纳克/微升)和dnapolymeraseⅰ(10单位/微升，酶始终放在冰盒或冰上)按如下反应体系加液：
混匀，瞬时离心，14℃孵育过夜(9-12小时)。次日加入5微升的0.5m的edta(ph7.5)终止反应，混匀，瞬时离心，连接好的dna放在-20℃避光保存。
(5)沉淀dna:
按照以下反应体系对目的标记好的dna进行沉淀：
再加入15微升的3m的乙酸钠，630微升的100％乙醇(-20℃)混匀，瞬时离心，-20℃，沉淀过夜。次日离心14000rpm，4℃，20分钟。用枪尖小心吸弃上清，加入100微升的70％乙醇(4℃)，混匀，离心14000rpm，4℃，15分钟。用枪尖小心吸弃上清，室温避光干燥沉淀10分钟。加入10微升的含有50％去离子甲酰胺的杂交缓冲液溶解沉淀，在振荡器上连续震荡至少6小时以充分溶解探针，转速800rpm，将溶解好的探针放入56℃中孵育1小时，室温离心14000rpm，20分钟，将离心好的探针转移至一个新的避光ep管中，4℃中保存，若长期不用探针应保存于-20℃。
4.csp7探针验证：
(1)细胞准备：
1)正常人二倍体成纤维细胞(humandiploidfibroblastcell,hdf)培养于含有20％胎牛血清的mem与f12(1:1)混合培养基中，当细胞生长融合至90％时，用0.25％胰酶+0.02％edta溶液进行消化，传代；
2)取对数生长期的细胞，进行细胞爬片；
3)将制作好的细胞爬片放入甲醇中室温固定过夜；
4)次日放入1-2％的甲醛溶液中室温固定5分钟，磷酸缓冲液(pbs)中洗涤后放入70％的乙醇中-20℃保存；
5)将保存在70％的乙醇中的标本拿出，放入梯度乙醇(70％，85％，2×100％乙醇)中脱水，3分钟/梯度，脱水后晾干，加入制作好的探针，10微升/片，加上18×18mm普通盖玻片，避免产生气泡，用封片胶封片，37℃干燥20分钟。
(2)杂交：
将玻片放入杂交仪中，85℃变性5分钟，47℃杂交过夜。
(3)洗涤：
将杂交过夜的片子移去盖玻片，放在47℃的4×sspe中洗涤5分钟，55℃的4×sspe中洗涤10分钟；梯度乙醇中脱水(70％，85％，2×100％乙醇)，3分钟/梯度；空气中干燥片子约10分钟后加入8微升的dapi，加上盖玻片，避免产生气泡，指甲油封片。
(4)图像采集与分析：
采用zeiss公司多色荧光显微镜axioimagerz2型，滤光片采用chroma公司分别为：dapi(sp-100),spectrumgreentm(mf101),cy3tmv1(sp-102)组合。首先在dapi滤光片下选择视野，定位，用axiovisionrel.4.8.2软件中的重定位模块记录图像采集位置，然后用高分辨率ccd(charge-coupleddevice，电荷耦合原件)相机在63倍油镜下分别在dapi(emission：450-490nm),spectrumgreentm(emission：512-542nm)和cy3tmv1(emission：559.5-574.5nm)三个滤光片通路中采集荧光信息，用图象处理软件z-stack采集模块在每个拍摄的细胞核上进行立体扫描25-30层，采用焦深延长模块将多层扫描的荧光杂交信号压缩在一张图像上，从而获得清晰、稳定，理想的图像(如图1b所示)。
(5)结果判断：
荧光原位杂交结果显示，在同一个正常人二倍体成纤维细胞中，green-csp7-r4(绿色)和pf555-csp7-r5(黄色)分别得到两个清晰的荧光信号点。绿色和黄色探针在同一基因位点结合，细胞核中最后呈现两个荧光素信号点，每个点由绿色和黄色两种荧光素重叠而成。表明这两种含csp7的bac克隆既可单独也可联合用作检测csp7染色体的fish探针
实施例2：kit1：pf415-20q12，green-5p15.2，pf555-egr1，pf590-cspy；kit2：pf415-csp8，green-csp7，pf555-d7s486探针组合物的制备方法，包括如下步骤
1.克隆筛选：
检索ucscgenomebrowser，ncbicloneregistry，ensemblgenomebrowser数据库分别含有20q12,5p15.2,egr1,cspy,csp8,csp7和d7s486的所有细菌人工染色体(bac)克隆，购买bac克隆(美国invitrogen公司)，根据单个探针连接后产物琼脂糖凝胶电泳和fish鉴定的结果，选出每种探针中最佳的克隆(表4)。
2.克隆培养：按照选定的bac克隆(表4),划线接种到含有氯霉素的琼脂平板上，37℃培养过夜。挑取单克隆到3-5毫升含氯霉素抗性的lb液体培养基中，37℃振摇活化培养8-16小时。然后将菌液全部加入至400-500毫升含氯霉素抗性的lb液体培养基中，37℃震摇培养16-24小时。
3.探针制备：
(1)使用qiagen公司的质粒提取试剂盒，按照说明书要求进行bac克隆质粒的提取和纯化。用nd-1000超微量分光光度计对质粒dna进行浓度和纯度(260nm/280nm)测定。用ecor1酶对目的dna进行酶切，方法如下：
37℃孵育1小时，加入1微升的0.5m的edta(ph7.5)终止反应，混匀，瞬时离心。
(2)沉淀dna：加入步骤(1)总液体量1/10体积的3m乙酸钠。
(3)再加入步骤(2)总液体量2倍体积100％乙醇(-20℃)，混匀，瞬时离心，-70℃，沉淀约2小时，离心14000rpm，4℃，20分钟，用枪尖小心吸弃上清，加入100微升70％乙醇(4℃)，混匀，离心14000rpm，4℃，15分钟。用枪尖小心吸弃上清，干燥沉淀10分钟，用10微升的10mm的tris-hcl(ph8.5)重悬后在振荡器上连续震荡至少5小时，转速800rpm，将溶解好的dna放在4℃保存直至连接反应。
(4)连接反应:
采用切口平移法对酶切好的dna进行荧光素标记，对20q12,5p15.2,egr1,cspy,csp8,csp7和d7s486分别采用promofluor-415-aadutp,greendutp,promofluor-555-aadutp,promofluor-590-aadutp,promofluor-415-aadutp,greendutp,promofluor-555-aadutp荧光素(表5)标记，对kit1:pf415-20q12(蓝色)，green-5p15.2(绿色)，pf555-egr1(黄色)，pf590-cspy(红色)；kit2：pf415-csp8(蓝色)，green-csp7(绿色)，pf555-d7s486(黄色)探针分别标记如表2，方法如下：
取避光的ep管，先加入水，最后加入dnaseⅰ(10纳克/微升)和dnapolymeraseⅰ(10单位/微升，酶始终放在冰盒或冰上)按如下反应体系加液：
混匀，瞬时离心，14℃孵育过夜(9-12小时)，次日加入5微升的0.5m的edta(ph7.5)终止反应，混匀，瞬时离心，连接好的dna放在-20℃避光保存。
(5)沉淀dna:
按照以下反应体系对目的标记好的dna进行沉淀：
再加入15微升的3m的乙酸钠，630微升的100％乙醇(-20℃)混匀，瞬时离心，-20℃，沉淀过夜。次日离心14000rpm，4℃，20分钟。用枪尖小心吸弃上清，加入100微升的70％乙醇(4℃)，混匀，离心14000rpm，4℃，15分钟。用枪尖小心吸弃上清，室温避光干燥沉淀10分钟。加入10微升的含有50％去离子甲酰胺的杂交缓冲液溶解沉淀，在振荡器上连续震荡至少6小时以充分溶解探针组合物，转速800rpm，将溶解好的探针组合物放入56℃中孵育1小时，室温离心14000rpm，20分钟，将离心好的探针组合物转移至一个新的避光ep管中，4℃中保存，若长期不用探针组合物应保存于-20℃。
4.kit1：pf415-20q12，green-5p15.2，pf555-egr1，pf590-cspy；kit2：pf415-csp8，green-csp7，pf555-d7s486探针组合物验证：
(1)细胞准备：
1)正常人二倍体成纤维细胞(humandiploidfibroblastcell,hdf)培养于含有20％胎牛血清的mem与f12(1:1)混合培养基中，当细胞生长融合至90％时，用0.25％胰酶+0.02％edta溶液进行消化，传代；
2)取对数生长期的细胞，进行细胞爬片；
3)将制作好的细胞爬片放入甲醇中室温固定过夜；
4)次日放入1-2％的甲醛溶液中室温固定5分钟，磷酸缓冲液(pbs)中洗涤后放入70％的乙醇中-20℃保存；
5)将保存在70％的乙醇中的标本拿出，放入梯度乙醇(70％，85％，2×100％乙醇)中脱水，3分钟/梯度，脱水后晾干，加入制作好的探针，10微升/片，加上18×18mm普通盖玻片，避免产生气泡，用封片胶封片，37℃干燥20分钟。
(2)杂交：
将玻片放入杂交仪中，85℃变性5分钟，47℃杂交过夜。
(3)洗涤：
将杂交过夜的片子移去盖玻片，放在47℃的4×sspe中洗涤5分钟，55℃的4×sspe中洗涤10分钟；梯度乙醇中脱水(70％，85％，2×100％乙醇)，3分钟/梯度；空气中干燥片子约10分钟后加入8微升的dapi，加上盖玻片，避免产生气泡，指甲油封片。
(4)图像采集与分析：
采用zeiss公司多色荧光显微镜axioimagerz2型，滤光片采用chroma公司分别为：dapi(sp-100),spectrumgreentm(mf101),cy3tmv1(sp-102)和zeiss公司pf-415(45)组合。首先在dapi滤光片下选择视野，定位，用axiovisionrel.4.8.2软件中的重定位模块记录图像采集位置，然后用高分辨率ccd(charge-coupleddevice，电荷耦合原件)相机在63倍油镜下分别在dapi(emission：450-490nm),pf-415(emission：460-500nm)，spectrumgreentm(emission：512-542nm),cy3tmv1(emission：559.5-574.5nm)四个滤光片通路中采集荧光信息，用图象处理软件z-stack采集模块在每个拍摄的细胞核上进行立体扫描25-30层，采用焦深延长模块将多层扫描的荧光杂交信号压缩在一张图像上，从而获得获得清晰、稳定，理想的多色图像。拍摄5个区域共计200个细胞，记录20q12，5p15.2，egr1，cspy，csp8，csp7和d7s486的荧光信号数目。
(5)结果判断：
荧光原位杂交结果显示，kit1中，在同一细胞核中，可以检测出2个蓝色pf415-20q12、绿色green-5p15.2、黄色pf555-egr1、和1个红色pf590-cspy信号；kit2中，可以分别检测出2个蓝色pf415-csp8、绿色green-csp7和黄色pf555-d7s486信号。每种探针得到的荧光信号较强，获得的图像清晰，信噪比高，方法可靠稳定。
实施例3：一种骨髓增生异常综合症荧光原位杂交检测试剂盒(50人份)，组成如下：
其中第一组荧光标记探针组杂交混合液中20q12基因探针的浓度为：4纳克/微升，5p15.2基因探针的浓度为：4纳克/微升,egr1基因探针的浓度为：4纳克/微升，cspy基因探针的浓度为：4纳克/微升，
第一组荧光标记探针组杂交混合液中csp8基因探针的浓度为：4纳克/微升，csp7基因探针的浓度为：4纳克/微升，d7s486基因探针的浓度为：4纳克/微升。
所述杂交混合液的组分包括50％的去离子甲酰胺，2×ssc和0.1克/毫升的硫酸葡聚糖。
实施例4：骨髓增生异常综合症荧光原位杂交检测试剂盒的使用方法
收集临床骨髓增生异常综合症患者骨髓标本40例，使用实施例3中所述骨髓增生异常综合症荧光原位杂交检测试剂盒进行检测，方法如下：
1.标本处理和制片：
收集病人骨髓细胞，用0.075摩尔/升的kcl低渗液去除骨髓中的红细胞，用固定液(甲醇：冰乙酸＝3:1)室温固定细胞三次，第一次固定30分钟，第二、三次固定各15分钟，用固定液调整细胞浓度为1×105/ml，进行细胞甩片，晾干，用钻石笔标记细胞位置，用2×ssc(37℃)洗涤5分钟，梯度乙醇(70％，85％，2×100％乙醇)中脱水，3分钟/梯度，晾干后fish检测备用。
2.杂交反应：
将要检测的标本处理好后，在玻片上划2个反应圈，分别加入实施例3试剂盒中的第一组、第二组荧光标记探针组杂交混合液，2微升/片/组，加上规格为12×12mm普通盖玻片，避免产生气泡，用封片胶封片，37℃干燥20分钟。将玻片放入杂交仪中，78℃变性5分钟，37℃杂交过夜。
3.洗片：
将杂交过夜的片子移去盖玻片，放在47℃的4×sspe中洗涤5分钟，55℃的4×sspe中洗涤10分钟；梯度乙醇中脱水(70％，85％，2×100％乙醇)，3分钟/梯度；放入己烷：异丙醇(60:40)混合液中10分钟，再放入异丙醇中5分钟，最后放入100％的乙醇中5分钟；空气中干燥片子约10分钟后加入10微升的dapi，加上盖玻片，避免产生气泡，指甲油封片。
4.图像采集与分析：
采用zeiss公司多色荧光显微镜axioimagerz2型，滤光片采用chroma公司分别为：dapi(sp-100),spectrumgreentm(mf101),cy3tmv1(sp-102)和zeiss公司pf-415(45)组合。首先在dapi滤光片下选择视野，定位，用axiovisionrel.4.8.2软件中的重定位模块记录图像采集位置，然后用高分辨率ccd(charge-coupleddevice，电荷耦合原件)相机在63倍油镜下分别在dapi(emission：450-490nm),pf-415(emission：460-500nm)，spectrumgreentm(emission：512-542nm),cy3tmv1(emission：559.5-574.5nm)滤光片通路中采集荧光信息，调整焦距，在核的不同层次找到信号点，记录观察每个细胞中的各探针的数目，用图象处理软件z-stack采集模块在每个拍摄的细胞核上进行立体扫描5层，采用焦深延长模块将多层扫描的荧光杂交信号压缩在一张图像上，从而获得清晰、稳定，理想的多色图像。每片拍摄10个区域共计200个骨髓细胞，记录pf415-20q12，green-5p15.2，pf555-egr1，pf590-cspy，pf415-csp8，green-csp7和pf555-d7s486的荧光信号数目。
5.结果判断：
通过记录pf415-20q12，green-5p15.2，pf555-egr1，pf590-cspy，pf415-csp8，green-csp7和pf555-d7s486的荧光信号数目。发现在5q-的mds患者骨髓细胞中黄色信号egr1即5q缺失，其他信号正常；在20q-的mds患者骨髓细胞中蓝色信号20q12信号缺失；-y的mds患者骨髓细胞中红色信号cspy缺失；在7q-的mds病人骨髓细胞中黄色信号d7s486即7q缺失；在+8的mds患者骨髓细胞中蓝色信号csp8为三个，即该患者为8号染色体三体。从检测结果的中可以看出，同时检测的7种不同的荧光信号均较强，图像清晰，信噪比高，方法可靠稳定。
目前临床对于骨髓增生异常综合症患者主要通过少数单个基因的检测，其结果远不能反应该病复杂的病理发生过程。因此，通过本发明试剂盒对同一标本甚至同一白血病细胞克隆进行多综合检测，可以更好得进行分子病理分型，研究和跟踪白血病干细胞克隆在疾病发生和发展过程中的衍化，更好的判断预后，指导个性化治疗，判断疗效和监测病程。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，但本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。
表1csp7探针标记
表2kit1，kit2检测试剂盒探针标记
表3csp7克隆
表4kit1，kit2试剂盒克隆信息
表5荧光素标记的dutp