本发明涉及生物
技术领域：
，尤其涉及一种通过数字pcr检测pik3ca突变的试剂盒及其应用。
背景技术：
：肿瘤个体化治疗已经成为现代医学发展的趋势。临床研究证实，通过检测肿瘤患者样本中生物标志物的基因突变来预测药物疗效和评价预后，指导临床个体化治疗，能够提高疗效，减轻不良反应，促进医疗资源的合理利用。乳腺癌是女性中一种非常常见的癌症类型，同时乳腺癌包含多种异质性肿瘤类型，可根据不同的组织学和分子特征分为不同亚型。在乳腺癌患者体内经常发现磷酸肌醇3-激酶(pi3k)/akt信号通路的异常，其中pik3ca突变最为常见。pik3ca是乳腺癌中最常见突变基因之一，已经有研究发现这个基因发生突变与多种不同类型的人类乳腺癌具有相关性。pik3ca基因编码磷脂酰肌醇-3-激酶p110α催化亚基，有20个外显子，在人体正常脑、肺、乳腺、胃肠、宫颈、卵巢等组织中均有表达，具有调控机体细胞增殖、存活、死亡、分化等重要生理功能。该基因的突变可发生于乳腺癌、结直肠癌和肺癌等多种癌症中，其中在肝癌36％、乳腺癌中突变率为26％、结直肠癌中突变率为25％、肺癌中突变率为2％，其突变80％～90％聚集在该基因的第9外显子和第20外显子。许多研究发现pik3ca突变的肿瘤患者病理完全缓解的可能性较低，无进展生存期较短。一些临床前期的数据提示，pik3ca突变可能会使肿瘤对曲妥单抗、帕妥珠单抗产生抵抗。检测pik3ca突变与治疗有效性及预后相关，对指导治疗有积极作用。目前在基因检测方面，主要采用目标序列捕获和高通量测序技术，并结合生物信息学分析，获取目标区域的基因变异信息，然后采用sanger、qpcr等方法进行验证，找出致病基因突变。这种方法可一次性检测很多个肿瘤相关基因、解读大量肿瘤药物，全面、系统、准确地解读肿瘤药物与基因的关系；然而这种方法成本高，周期长，并不适用于所有的患者，且后续仍需要sanger、qpcr等方法进行验证。因此，研发一种新型的数字pcr检测pik3ca突变的试剂盒，准确高效地检测pik3ca的突变，具有重大意义和市场价值。技术实现要素：针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种通过数字pcr检测pik3ca突变的试剂盒及其应用，通过设计特异性的突变引物及探针序列，优化试剂盒内各组分各试剂的浓度及配方，最终得到的试剂盒高效简洁，具有较高的灵敏度和特异性，操作简单易行，耗时短，结果准，对癌症的预后及指导治疗有积极作用。为达此目的，本发明采用以下技术方案：一方面，本发明提供一种通过数字pcr检测pik3ca突变的试剂盒；所述试剂盒包括数字pcr试剂；所述数字pcr试剂包括根据pik3ca基因的e545k和h1047r的突变位点的多态性设计的引物和探针。所述pik3ca基因的e545k的引物的核酸序列如seqidno:1-2所示，所述探针的核酸序列如seqidno:3所示。所述seqidno:1为acgagatcctctctctgaaatcacta；所述seqidno:2为catgctgagatcagccaaattcag；所述探针a的核酸序列(seqidno:3)为ctatggagtcacaggtaag。优选地，所述探针a还包括5’端修饰的荧光基团和3’端的淬灭基团。所述修饰基团为fam、vic、hex中的任意一种，优选为fam。所述淬灭基团为bhq1、bhq2或mgb中的任意一种，优选为mgb。所述pik3ca基因的h1047r的引物的核酸序列如seqidno:4-5所示，所述探针如seqidno:6所示。所述seqidno:4为tgaaacaaatgaatgatgcacg；所述seqidno:5为cagtgcagtgtggaatccagagt；所述探针b的核酸序列(seqidno:6)为atggattggatcttccacaca。优选地，所述探针b还包括5’端修饰的荧光基团和3’端的淬灭基团。所述修饰基团为fam、vic或hex中的任意一种，优选为fam。所述淬灭基团为bhq1、bhq2或mgb中的任意一种，优选为mgb。发明人在长期测序实验过程中，充分研究总结pik3ca基因的突变与机体的关系，结合对先进测序技术的探索，采用数字pcr对pik3ca的突变进行检测，通过设计特异性的突变引物及探针序列，优化试剂盒内各组分各试剂的浓度及配方，最终得到的试剂盒高效简洁，具有较高的灵敏度和特异性，操作简单易行，耗时短，结果准。微滴式数字pcr(ddpcr)是数字pcr技术的一种，ddpcr系统将含有核酸分子的反应体系分成上万个纳米级的微滴，其中每个微滴不含或者含有一个至数个带有目标基因突变dna片段，经pcr扩增后，逐个对每个微滴进行荧光检测，因此具有极高的灵敏度，能用于检测血液中含量极低的肿瘤游离dna。优选地，所述数字pcr试剂还包括根据pik3ca基因的保守区设计的引物和探针。优选地，所述pik3ca基因的保守区的引物的核酸序列如seqidno:7-8所示，所述探针如seqidno:9所示。所述seqidno:7为gcttgcaataggtgtgcgtc；所述seqidno:8为catctcccaaacatccctcac；所述探针c的核酸序列(seqidno:9)为cactgaacaagttgg。优选地，所述探针c还包括5’端修饰的荧光基团和3’端的淬灭基团。所述修饰基团为fam、vic或hex中的任意一种，优选为hex。所述淬灭基团为bhq1、bhq2或mgb中的任意一种，优选为mgb。优选地，所述数字pcr试剂盒包括2×ddpcr缓冲液。优选地，所述引物的浓度为0.2-1μm，例如可以是0.2μm、0.5μm、0.8μm或1μm。优选地，所述探针的浓度为0.1-0.5μm，例如可以是0.1μm、0.3μm、0.4μm或0.5μm。优选地，所述试剂盒还包括dna抽提试剂。优选地，所述dna抽提试剂包括红细胞裂解液、细胞核裂解液、edta、蛋白酶k、饱和酚、氯仿和乙醇。人外周血中的淋巴细胞是抽提基因组dna最方便的材料。dna在细胞核内是与蛋白质形成复合物的形式存在，因此提取过程中必须将其中的蛋白质除去，sds可将细胞膜、核膜破坏，并将组蛋白从dna分子上分离，使核蛋白上的核酸游离。edta可抑制细胞中dnase活性。蛋白酶k可以用于消化细胞核膜以及核内蛋白质，rnase除去核酸中的rna。再用苯酚氯仿抽提可进一步使蛋白质变性而与核酸分开，再经无水乙醇沉淀，最后可得到比较纯净的dna。优选地，所述蛋白酶k的浓度为18-22mg/ml，例如可以是18mg/ml、19mg/ml、20mg/ml、21mg/ml或22mg/ml，优选为20mg/ml。优选地，所述红细胞裂解液包括nh4cl、khco3和edta。优选地，所述细胞核裂解液包括ph8.2的tris-hcl、nacl和edta。优选地，所述nh4cl的浓度为0.15-0.20m，例如可以是0.15m、0.155m、0.18m或0.20m，优选为0.155m。优选地，所述红细胞裂解液的khco3的浓度为0.01-0.02m，例如可以是0.01m、0.015m或0.02m，优选为0.01m。优选地，所述红细胞裂解液的edta的浓度为0.1-0.2m，例如可以是0.1m、0.15m或0.2m，优选为0.13m。优选地，所述细胞核裂解液的tris-hcl的浓度为0.01-0.02m，例如可以是0.01m、0.015m或0.02m，优选为0.01m。优选地，所述细胞核裂解液的nacl的浓度为0.3-0.5m，例如可以是0.3m、0.4m或0.5m，优选为0.4m。优选地，所述细胞核裂解液的edta的浓度为0.005-0.01m，例如可以是0.005m、0.008m或0.01m，优选为0.008m。第二方面，本发明提供一种采用如第一方面所述试剂盒检测pik3ca突变的方法，包括如下步骤：(1)抽提dna：采用所述dna抽提试剂提取外周血dna；(2)制备微滴：将步骤(1)抽提的dna与数字pcr试剂混合，放入微滴发生器中制备微滴；(3)pcr扩增：将步骤(2)制备的微滴封膜后按照设置程序进行pcr扩增；(4)微滴检测：将步骤(3)反应后的pcr板转移至微滴分析仪中进行荧光检测，并使用软件进行浓度计算。优选地，步骤(1)所述提取的dna浓度≥30ng/μl。所述pcr的反应体系：9μldna约100ng和11μl探针引物、ddpcr缓冲液的混合液。优选地，所述pcr扩增的条件为：95℃变性5min，随后95℃变性15sec，60℃退火30sec，进行40个循环，最后98℃延伸10min。作为优选技术方法，一种采用第一方面所述试剂盒检测pik3ca突变的方法，具体步骤包括如下：(1)抽提dna：采用dna抽提试剂提取外周血dna，得到浓度≥30ng/μl的dna；(2)制备微滴：将步骤(1)抽提的dna与ddpcr试剂混合，放入微滴发生器中制备微滴；(3)pcr扩增：将步骤(2)制备的微滴封膜后按照95℃变性5min，随后95℃变性15sec，60℃退火30sec，进行40个循环；最后98℃延伸10min的步骤进行pcr扩增；(4)微滴检测：将步骤(3)反应后的pcr板转移至微滴分析仪中进行荧光检测，并使用软件进行浓度计算。第三方面，本发明提供一种如第一方面所述试剂盒用于检测pik3ca突变。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：(1)本发明提供的试剂盒采用数字pcr的方法检测pik3c的突变，针对突变涉及特异性优化的引物和探针，并辅以保守区的质检探针，调整试剂盒中dna抽提的配方及浓度，提取浓度较高的dna，方便后续检测，最终得到的试剂盒高效简洁，具有较高的灵敏度和特异性。(2)本发明的试剂盒在用于检测pik3ca突变的过程，优化数字pcr的检测流程，突变平均丰度较高，准确度达到100％，操作简单易行，耗时短，结果准，对癌症的预后及指导治疗有积极作用。附图说明图1是本发明实施例3的pik3ca基因h1047r突变位点的检测微滴数目结果图。其中图1(a)为h1047r的突变计算，图1(b)为pik3ca基因计数，深灰色：无扩增的游离dna微滴数，蓝色：突变型游离dna微滴数，绿色：质控游离dna微滴数；图2为本发明实施例3的pik3ca基因e545k突变位点的检测微滴数目结果图。其中，图2(a)为e545k突变计算，图2(b)为pik3ca基因计数，深灰色：无扩增的游离dna微滴数，蓝色：突变型游离dna微滴数，绿色：质控游离dna微滴数。具体实施方式为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。实施例1组装试剂盒将探针a、探针b、探针c、6条引物和2×ddpcr缓冲液组成的数字pcr试剂与包括红细胞裂解液、细胞核裂解液、edta、20mg/ml的蛋白酶k、饱和酚、氯仿和乙醇的dna抽提试剂组装成试剂盒；其中包括：seqidno:1为acgagatcctctctctgaaatcacta的引物；seqidno:2为catgctgagatcagccaaattcag的引物；探针a：fam-fam-ctatggagtcacaggtaag-mgb；seqidno:4为tgaaacaaatgaatgatgcacg的引物；seqidno:5为cagtgcagtgtggaatccagagt的引物；探针b：fam-atggattggatcttccacaca-mgb；seqidno:7为gcttgcaataggtgtgcgtc的引物；seqidno:8为catctcccaaacatccctcac的引物；探针c：hex-cactgaacaagttgg-mgb。所述引物的浓度为0.2-1μm，所述探针的浓度为0.1-0.5μm；其中，所述红细胞裂解液包括0.155m的nh4cl、0.01m的khco3和0.13m的edta；所述细胞核裂解液包括0.01mph8.2的tris-hcl、0.4m的nacl和0.008m的edta。实施例2提取dnadna的抽提方法如下：(1)取40ml的1×红细胞裂解液和采用了pi3k抑制剂等pi3k通路相关靶向药物治疗的人类癌症患者的4-6mledta抗凝外周血于50ml离心管中混匀，直至溶液变透明，4℃2000rpm离心10分钟，小心去上清液，加3ml1×细胞核裂解液和25μl蛋白酶k于离心管中，振荡至匀，加300μl20％sds，摇匀至出现粘稠透明状，37℃消化6小时以上；(2)加6ml饱和酚于15ml离心管中，将消化液加入此离心管，轻摇混匀，4℃2000rpm离心10分钟，再加等体积酚/氯仿(各3ml)至另一15ml离心管，小心将上清移至此离心管，混匀，4℃2000rpm离心10分钟；(3)加6ml氯仿于15ml离心管中，小心将上清移至此离心管，混匀，4℃2000rpm离心10分钟；加10ml无水乙醇另一15ml离心管，小心上清移至此离心管摇匀，见白色絮状dna，用剪掉尖头的tip将dna吸出，12000rpm离心20分钟后，用70％乙醇洗二次(第一次500μl，第二次300μl，12000rpm离心10min)，室温干燥5分钟，再将dna溶于200μl1×te中，室温溶解过夜，然后紫外测od值，从而获得体积为20-100μl且dna浓度大于30ng/μl的dna抽提物。实施例3ddpcr反应步骤如下：配置ddpcr反应体系：取待测9μldna约100ng，分别与11μl针对不同突变的探针引物和缓冲液混合；制备微滴，在dg8tm微滴发生卡上相对应的孔中加入20μl上述pcr反应液，70μl微滴发生专用油，盖上微滴发生卡密封垫，放入qx200微滴发生器内进行反应。将处理好的微滴缓慢转移到96孔板上，将96孔板放在热封仪上，盖上热封膜进行封膜；pcr扩增：将已制备好的微滴pcr扩增程序进行目的片段扩增，pcr反应条件为：95℃变性5min，随后95℃变性15sec，60℃退火30sec，进行40个循环，最后98℃延伸10min，4℃保存；微滴检测：pcr反应结束后，将pcr板转移到qx200微滴分析仪(bio-radlaboratoriesusa)上，对所有样品孔进行荧光检测；结果分析：使用quantasofttm软件进行浓度计算，质控有扩增(在hex荧光信号区域有微滴分布)的前提下存在突变型片段的扩增(在fam荧光信号区域有微滴分布)，则判断该基因有突变，共检测20例患者的外周血样品，结果如图1、图2、表1和表2所示；表1pik3ca基因e545k位点突变检测结果患者丰度患者丰度患者丰度患者丰度a0f5.6k1.5p2.3b3.6g1.8l0q2.1c4.3h3.2m0r0d6.7i0n3.2s3.4e2.8j3.4o2.6t1.5由表1可知，pik3ca基因e545k位点突变检测了20例样本其中15例为阳性样本，5例为阴性样本，检测的平均丰度为3.2，准确度100％。表2pik3ca基因h1047r位点突变检测患者丰度患者丰度患者丰度患者丰度a1.8f2.6k1.4p9.1b0g0l2.4q0c3.2h4.1m3.6r7.2d0i0n5.3s8.1e4.5j4.3o2.1t9.2由表2可知，pik3ca基因h1047r位点突变检测了20例样本其中15例为阳性样本，5例为阴性样本，检测的平均丰度为4.6，准确度100％。综上所述，本发明提供的试剂盒，通过设计特异性的突变引物及探针序列，优化试剂盒内各组分各试剂的浓度及配方，dna提取液浓度≥30ng/μl，最终得到的试剂盒高效简洁，具有较高的灵敏度和特异性，操作简单易行，耗时短，结果准，准确度达到100％，对癌症的预后及指导治疗有积极作用。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。序列表<110>天津脉络医学检验有限公司<120>一种通过数字pcr检测pik3ca突变的试剂盒及其应用<130>2017<141>2017-12-11<160>9<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>26<212>dna<213>人工合成()<400>1acgagatcctctctctgaaatcacta26<210>2<211>24<212>dna<213>人工合成()<400>2catgctgagatcagccaaattcag24<210>3<211>19<212>dna<213>人工探针()<400>3ctatggagtcacaggtaag19<210>4<211>22<212>dna<213>人工合成()<400>4tgaaacaaatgaatgatgcacg22<210>5<211>23<212>dna<213>人工合成()<400>5cagtgcagtgtggaatccagagt23<210>6<211>21<212>dna<213>人工合成()<400>6atggattggatcttccacaca21<210>7<211>20<212>dna<213>人工合成()<400>7gcttgcaataggtgtgcgtc20<210>8<211>21<212>dna<213>人工合成()<400>8catctcccaaacatccctcac21<210>9<211>15<212>dna<213>人工合成()<400>9cactgaacaagttgg15当前第1页12