本发明涉及一种检测曼氏无针乌贼种群的方法，尤其涉及一种能够在不损伤环境和物种种群前提下采取环境DNA对曼氏无针乌贼种群进行检测的快速高效检测曼氏无针乌贼种群的方法。
背景技术：
曼氏无针乌贼（Sepiella japonica）是一年生的中型乌贼。头足纲，乌贼科。俗名叫墨鱼，生长快，肉质鲜美，是一种深受市场欢迎的海味食品。曼氏无针乌贼在我国主要分布于黄海、东海海域，为近距离洄游物种。在我国沿海，曼氏无针乌贼是资源丰厚、产量很好的一种经济头足类。曼氏无针乌贼全身都是宝，食用和药用价值都相当高，上世纪七八十年代曾是我国“四大海产品”之一。它每年产量可达几万吨，其中以东海产量为最高，是东海渔民的主要捕捞对象之一。但过度捕捞导致该物种资源衰竭。
及时掌握曼氏无针乌贼种群的分布格局和种群大小，是物种资源保护和生物多样性保护的重要内容和研究前提。传统的曼氏无针乌贼种群分布监测，主要利用现场调查法，如以网具进行渔获采集。具有耗时费力、成本高、捕获率低、可能会伤害到目标物种或者破坏调查点的生态系统的缺点。环境DNA（eDNA）分析是一种将DNA分析技术与传统方法相结合的生物学研究的新工具。这一方法最早出现于上世纪80年代。之后20年间，随着样品采样、DNA提取、分析和测序等关键技术的突破，eDNA分析发展成为完整的物种分布检测技术手段。其应用从微生物分析扩展到高等水生或半水生物种鉴定、居群乃至生物群落的多样性分析。荧光定量PCR（QuantitativePCR，qPCR）特异性高，能够对DNA进行量化分析，近年来逐渐替代普通PCR，成为eDNA分析的重要手段。设计种间特异的qPCR扩增引物和探针是采用eDNA分析进行曼氏无针乌贼资源监测的关键技术。
目前，关于曼氏无针乌贼种间特异性扩增引物和探针的相关研究还未见报道。建立起曼氏无针乌贼的qPCR分析，实现曼氏无针乌贼的简单、快速、准确、客观的分子鉴定是目前开展曼氏无针乌贼eDNA资源监测急需解决的问题。
中国专利局于2010年6月16日公开了一种曼氏无针乌贼内壳荧光标记方法的发明专利申请，申请公告后CN101731162A，该发明采用茜素络合指示剂作为染色剂，利用茜素络合指示剂的水溶液对曼氏无针乌贼进行浸泡染色，提供了一种新型的标志流放的方法，但其仅能对已经捕获的曼氏无针乌贼进行标志，并不能对野外自然环境中的曼氏无针乌贼种群进行快速有效的检测。
技术实现要素：
为解决传统的曼氏无针乌贼种群分布监测，主要利用现场调查法，如以网具进行渔获采集，具有耗时费力、成本高、捕获率低、可能会伤害到目标物种或者破坏调查点的生态系统等缺点，而现有技术中没有在不损伤环境的前提下对曼氏无针乌贼种群进行快速有效检测的方法等问题，本发明提供了一种能够在不损伤环境和物种种群前提下采取环境DNA对曼氏无针乌贼种群进行检测的快速高效检测曼氏无针乌贼种群的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
一种快速高效检测曼氏无针乌贼种群的方法，所述快速高效检测曼氏无针乌贼种群的方法包括以下步骤：
1）提取待检测环境的eDNA样本，对样本进行前处理；
2）将经过前处理的eDNA样本通过DNA抽提试剂盒进行DNA抽提，将抽提后的DNA溶于100μL水中得到DNA样本液；
3）对DNA样本液，采用特制的引物和探针进行qPCR反应；
4）对qPCR扩增产物进行测序和检测，测定Ct值，判定结果；
所述eDNA样本包括土壤、泥沙和水。采用eDNA替代传统对曼氏无针乌贼采用现场调查法，捕捞式的检测，首先能够极大地降低检测过程对自然环境和被检测的曼氏无针乌贼物种的影响，实现检测对自然环境和物种无损伤的目的，此外，现场调查法以网具采集，费时费力，需要大量的人力成本，并且捕获率低，检测结果可靠性低，而eDNA检测则可避免这一类的问题，只需从自然环境中待测点的土壤、泥沙和水中采集样本即可，因为土壤、泥沙和水中必然会有其所生存物种的组织成分、分泌物等物质残留，从中即可获取DNA样本；采用特制的引物和探针能够对一个待检测物种进行针对性的检测，能够大大提高检测效率和检测的准确性，降低了后续测序成本和测序所需的时间。
作为优选，步骤3）中所述特制的引物分别为上游引物SEQ ID NO.1：5’-AGCAGGAACAGGATGAAC-3’和下游引物SEQ ID NO.2：5’-GCCAAATCGACAGAAGGT-3’；所述探针序列为SEQ ID NO.3：5’-FAM-CTACCCTCCTTTATCAAGTAACCTCTCAC-TAMRA-3’。所述特制的引物是一种种间特异性的扩增引物，能够实现对曼氏无针乌贼的特异性扩增，并且不受其余近缘物种的影响，能够大大提高检测的准确性和结果的可靠性，探针能够为后续检测提供更加便利的条件，方便检测，并也能提高检测的准确性和结果的可靠性。
作为优选，步骤1）中所述eDNA样本优选为水。由于水的溶解度比较大，其eDNA稳定性较高，并可对水样进行大体积抽滤；而土壤和泥沙稳定性高，尤其是表层的土壤和泥沙，表面沉积有大量近期该环境中所残留的PCR抑制物质，单个样本能够处理的土壤和泥沙体积亦相对较小。为能够较为准确地反应出检测点的eDNA，选用水对提高检测的准确性和结果的可靠性有利。
作为优选，步骤1）中所述前处理方法为将eDNA样本滤膜置于酒精中进行充分浸泡保存或置于液氮中进行充分研磨。滤膜能够对eDNA起到采集作用，酒精能够起到一定的保护作用，并且酒精提供了一个极低含水量的环境条件，可以保持浸泡过程中DNA完整性，在前处理完成后酒精可快速挥发不对后续DNA抽提和检测等造成影响。
作为优选，步骤3）中所述探针为荧光PCR探针。荧光PCR探针更够极为方便地进行检测。
作为优选，步骤3）中所述的qPCR扩增的反应体系组成为：PremixExTaq 10μL、10μM的上游引物SEQ ID NO.1取0.4μL、10μM的下游引物SEQ ID NO.2取0.4μL、10μM的探针SEQ ID NO.3取0.4μL和100g/μL的DNA模版液1μL，利用去离子水补足至20μL；
所述qPCR扩增条件为：95℃预变性10s，随后95℃变性5s，60℃退火23s，72℃延伸60s，变性、退火和延伸共进行40个循环，最后进行72℃延伸5min，4℃条件下保存。
作为优选，所述的qPCR扩增采用荧光定量PCR仪进行反应。
作为优选，所述步骤4）中测定Ct值，当Ct值小于或等于35时判定结果为阳性，当Ct值大于35时判定结果为阴性。
本发明的有益效果是：
（1）本发明提供了一种可以快速高效检测曼氏无针乌贼种群的方法；
（2）所述快速高效检测曼氏无针乌贼种群的方法所采集的eDNA样本取样均取自土壤、泥沙和水等，不会对检测点造成环境负担，不会对物种生存环境造成不利影响；
（3）利用特制的引物和探针能够准确、快速并高效地对曼氏无针乌贼DNA进行检测，提高了检测的效率和准确性，降低了检测成本；
（4）相较于传动曼氏无针乌贼种群分布检测所利用的现场调查法，具有省时省力、成本低、高效且不会伤害到目标物种或破坏调查点生态系统的优点。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明，但不以任何形式对本发明内容进行限制。显然所描述实施例仅为本发明一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例1
一种快速高效检测曼氏无针乌贼种群的方法，所述快速高效检测曼氏无针乌贼种群的方法包括以下步骤：
1）提取待检测环境的eDNA样本，所采集样本为土壤，对其进行前处理，前处理步骤为将eDNA样本置于液氮中进行充分研磨；
2）将经过前处理的eDNA样本通过DNA抽提试剂盒进行DNA抽提，将抽提后的DNA溶于100μL水中得到DNA样本液；
3）对DNA样本液，采用特制的引物和探针进行qPCR反应，所述特制的引物分别为上游引物SEQ ID NO.1：5’-CACCAGACATAGCCTTCC-3’和下游引物SEQ ID NO.2：5’-GCCAGCATGAGATAGATTAC-3’；所述探针序列为SEQ ID NO.3：5’-HEX-TGTTCATCCAGTTCCAGCACCT-TAMRA-3’；
所述的qPCR扩增的反应体系组成为：PremixExTaq 10μL、10μM的上游引物SEQ ID NO.1取0.4μL、10μM的下游引物SEQ ID NO.2取0.4μL、10μM的探针SEQ ID NO.3取0.4μL和100g/μL的DNA模版液1μL，利用去离子水补足至20μL；
所述qPCR扩增条件为：95℃预变性10s，随后95℃变性5s，60℃退火23s，72℃延伸60s，变性、退火和延伸共进行40个循环，最后进行72℃延伸5min，4℃条件下保存；
4）对qPCR扩增产物进行测序和检测，测序结果SEQ ID NO.4为：5’-CACCAGACATAGCCTTCCCTCGAATAAATAATATAAGTTTTTGGTTATTACCTCCATCTTTAACTCTTTTATTATCATCCTCAGCTGTAGAAAGAGGTGCTGGAACTGGATGAACAGTATATCCTCCCTTATCTAGTAATCTATCTCATGCTGGC -3’；测定Ct值，Ct值为19，阳性，该环境中生存有曼氏无针乌贼种群。
实施例2
一种快速高效检测曼氏无针乌贼种群的方法，所述快速高效检测曼氏无针乌贼种群的方法包括以下步骤：
1）提取待检测环境的eDNA样本，所采集样本为泥沙，对其进行前处理，前处理步骤为将eDNA样本置于液氮中进行充分研磨；
2）将经过前处理的eDNA样本通过DNA抽提试剂盒进行DNA抽提，将抽提后的DNA溶于100μL水中得到DNA样本液；
3）对DNA样本液，采用特制的引物和探针进行qPCR反应，所述特制的引物分别为上游引物SEQ ID NO.1：5’-CACCAGACATAGCCTTCC-3’和下游引物SEQ ID NO.2：5’-GCCAGCATGAGATAGATTAC-3’；所述探针序列为SEQ ID NO.3：5’-HEX-TGTTCATCCAGTTCCAGCACCT-TAMRA-3’；
所述的qPCR扩增的反应体系组成为：PremixExTaq 10μL、10μM的上游引物SEQ ID NO.1取0.4μL、10μM的下游引物SEQ ID NO.2取0.4μL、10μM的探针SEQ ID NO.3取0.4μL和100g/μL的DNA模版液1μL，利用去离子水补足至20μL；
所述qPCR扩增条件为：95℃预变性10s，随后95℃变性5s，60℃退火23s，72℃延伸60s，变性、退火和延伸共进行40个循环，最后进行72℃延伸5min，4℃条件下保存；
4）对qPCR扩增产物进行测序和检测，测序结果SEQ ID NO.4为：5’-CACCAGACATAGCCTTCCCTCGAATAAATAATATAAGTTTTTGGTTATTACCTCCATCTTTAACTCTTTTATTATCATCCTCAGCTGTAGAAAGAGGTGCTGGAACTGGATGAACAGTATATCCTCCCTTATCTAGTAATCTATCTCATGCTGGC -3’；测定Ct值，Ct值为26，阳性，该环境中生存有曼氏无针乌贼种群。
实施例3
一种快速高效检测曼氏无针乌贼种群的方法，所述快速高效检测曼氏无针乌贼种群的方法包括以下步骤：
1）提取待检测环境的eDNA样本，所采集样本为水，对其进行前处理，前处理步骤为将eDNA样本滤膜置于酒精中进行充分浸泡保存；
2）将经过前处理的eDNA样本通过DNA抽提试剂盒进行DNA抽提，将抽提后的DNA溶于100μL水中得到DNA样本液；
3）对DNA样本液，采用特制的引物和探针进行qPCR反应，所述特制的引物分别为上游引物SEQ ID NO.1：5’-CACCAGACATAGCCTTCC-3’和下游引物SEQ ID NO.2：5’-GCCAGCATGAGATAGATTAC-3’；所述探针序列为SEQ ID NO.3：5’-HEX-TGTTCATCCAGTTCCAGCACCT-TAMRA-3’；
所述的qPCR扩增的反应体系组成为：PremixExTaq 10μL、10μM的上游引物SEQ ID NO.1取0.4μL、10μM的下游引物SEQ ID NO.2取0.4μL、10μM的探针SEQ ID NO.3取0.4μL和100g/μL的DNA模版液1μL，利用去离子水补足至20μL；
所述qPCR扩增条件为：95℃预变性10s，随后95℃变性5s，60℃退火23s，72℃延伸60s，变性、退火和延伸共进行40个循环，最后进行72℃延伸5min，4℃条件下保存；
4）对qPCR扩增产物进行测序和检测，测序结果SEQ ID NO.4为：5’-CACCAGACATAGCCTTCCCTCGAATAAATAATATAAGTTTTTGGTTATTACCTCCATCTTTAACTCTTTTATTATCATCCTCAGCTGTAGAAAGAGGTGCTGGAACTGGATGAACAGTATATCCTCCCTTATCTAGTAATCTATCTCATGCTGGC -3’；测定Ct值，Ct值为13，阳性，该环境中生存有曼氏无针乌贼种群。
实施例4
一种快速高效检测曼氏无针乌贼种群的方法，所述快速高效检测曼氏无针乌贼种群的方法包括以下步骤：
1）提取待检测环境的eDNA样本，所采集样本为水，对其进行前处理，前处理步骤为将eDNA样本滤膜置于酒精中进行充分浸泡保存；
2）将经过前处理的eDNA样本通过DNA抽提试剂盒进行DNA抽提，将抽提后的DNA溶于100μL水中得到DNA样本液；
3）对DNA样本液，采用特制的引物和探针进行qPCR反应，所述特制的引物分别为上游引物SEQ ID NO.1：5’-CACCAGACATAGCCTTCC-3’和下游引物SEQ ID NO.2：5’-GCCAGCATGAGATAGATTAC-3’；所述探针序列为SEQ ID NO.3：5’-HEX-TGTTCATCCAGTTCCAGCACCT-TAMRA-3’；
所述的qPCR扩增的反应体系组成为：PremixExTaq 10μL、10μM的上游引物SEQ ID NO.1取0.4μL、10μM的下游引物SEQ ID NO.2取0.4μL、10μM的探针SEQ ID NO.3取0.4μL和100g/μL的DNA模版液1μL，利用去离子水补足至20μL；
所述qPCR扩增条件为：95℃预变性10s，随后95℃变性5s，60℃退火23s，72℃延伸60s，变性、退火和延伸共进行40个循环，最后进行72℃延伸5min，4℃条件下保存；
4）对qPCR扩增产物进行检测，测定Ct值，Ct值为39，阴性，该环境中不生存有曼氏无针乌贼种群。
其中实施例1～3所检测地点为确认生存有曼氏无针乌贼的近陆海域，eDNA土壤样本采集自近陆浅海海底，eDNA泥沙样本采自近海边缘的泥沙层，受潮涨潮落影响泥沙层每天都会被海水淹没一段时间，eDNA水样本采自近陆水深一米处的海水；
实施例4所检测地点为一观光旅游海滩的近陆海域，并确定该近陆海域没有曼氏无针乌贼生存，eDNA水样本采集自近陆水深一米处的海水。
实施例1～4检测均进行多次，最后检测Ct值去除无效值后取平均值。
检测结果表面，检测准确度高，以Ct值35为分界点，能够对eDNA样本进行检测后快速判断检测点是否生存有曼氏无针乌贼，具有省时省力、成本低、高效且不会伤害到目标物种或破坏调查点生态系统的优点，且检测还具有成本低、效率高、准确性高和结果可靠性高的优点。
序列表
<110> 浙江海洋大学
<120> 一种快速高效检测曼氏无针乌贼种群的方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 上游引物(Forward Primer)
<400> 1
caccagacat agccttcc 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 下游引物(Reverse primer)
<400> 2
gccagcatga gatagattac 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 探针(probe)
<400> 3
tgttcatcca gttccagcac ct 22
<210> 4
<211> 155
<212> DNA
<213> 测序结果(Sequencing results)
<400> 4
caccagacat agccttccct cgaataaata atataagttt ttggttatta cctccatctt 60
taactctttt attatcatcc tcagctgtag aaagaggtgc tggaactgga tgaacagtat 120
atcctccctt atctagtaat ctatctcatg ctggc 155