本发明涉及活性组分提取技术领域，尤其涉及喙尾琵琶甲中取代苯醌提取物及其提取方法和应用、一种药物组合物。
背景技术：
喙尾琵琶甲(blapsrynchopeterafairmaire)属鞘翅目(coleoptera)拟步甲科(tenebrionidae)琵琶甲属(blaps)，俗名臭壳子，也叫臭屁虫、打屁虫，是云南彝族长期广泛使用的昆虫药物，具有清热解毒、活血化瘀、祛风定痛、软坚散结之功效，用于热证发烧、饮食积滞、小儿疳积、夜惊、乳癖、乳痰、积聚、风湿痹痛、牙龈肿痛、疮痒肿毒、湿疹、皮肤瘙痒等。在云南民间还常将喙尾琵琶甲应用于治疗咳嗽、胃炎、疔疮、肿瘤等疑难杂症。云南省滇中和滇西地区有多例采用臭壳子治愈多种癌症的病例报告，并有疗效确切地用于治疗肝癌、胃癌、直肠癌、膀胱癌、子宫颈癌、乳腺癌、食道癌等肿瘤之验方临床记录。据调查，彝族民间医生在治疗肿瘤、心血管及类风湿等疑难病症的处方中，80％以上都含有该昆虫药。
虽然云南民间有食用喙尾琵琶甲治疗癌症的偏方，然而现有研究中皆是对喙尾琵琶甲干燥虫体进行常规的提取分离，且采用常规的提取分离工艺提取得到的喙尾琵琶甲的总提物、不同极性提取物甚至进一步分离至单体，都未能得到强效抑制肿瘤细胞生长的活性物质。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种喙尾琵琶甲中取代苯醌提取物及其提取方法和应用、一种药物组合物，采用本发明提供的方法能够成功的从喙尾琵琶甲的防御液中提取出抑制肿瘤细胞增殖的活性物质。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种喙尾琵琶甲中取代苯醌提取物的提取方法，包括以下步骤：
(1)提供喙尾琵琶甲的防御液；
(2)将所述步骤(1)中的防御液进行第一硅胶柱层析分离，所述第一硅胶柱层析分离采用梯度洗脱，所述梯度洗脱包括依次进行的四个梯度，每个梯度中洗脱剂的组成为：
第一梯度中石油醚和丙酮的体积比为(49～51)︰1；
第二梯度中石油醚和丙酮的体积比为(24～26)︰1；
第三梯度中石油醚和丙酮的体积比为(9.5～10.5)︰1；
第四梯度中石油醚和丙酮的体积比为(4.5～5.5)︰1；
(3)收集所述步骤(2)中第三梯度和第四梯度的洗脱液，去除所得洗脱液中的洗脱剂，得到粗提物；
(4)将所述步骤(3)中的粗提物进行第二硅胶柱层析分离，所述第二硅胶柱层析分离采用梯度洗脱，所述梯度洗脱包括依次进行的三个梯度，每个梯度中洗脱剂的组成为：
第一梯度中石油醚和丙酮的体积比为(9.5～10.5)︰1；
第二梯度中石油醚和丙酮的体积比为(7.8～8.2)︰1；
第三梯度中石油醚和丙酮的体积比为(5.8～6.2)︰1；
(5)收集所述步骤(4)中第二梯度和第三梯度的洗脱液，去除所得洗脱液中的洗脱剂，得到取代苯醌提取物。
优选的，所述步骤(2)中第一硅胶柱层析分离过程中，防御液与硅胶柱中填充的硅胶的质量比为1：(40～60)；所述硅胶的粒度为300～400目。
优选的，所述步骤(2)中第一硅胶柱层析分离过程中，防御液的质量与每个梯度中洗脱剂的体积比独立为1g：(62.5～125)ml。
优选的，所述步骤(3)中去除所得洗脱液中的洗脱剂在≤50℃条件下进行。
优选的，所述步骤(4)中第二硅胶柱层析分离过程中，粗提物与硅胶柱中填充的硅胶的质量比为1：(90～110)；所述硅胶的粒度为300～400目。
优选的，所述步骤(4)中第二硅胶柱层析分离过程中，粗提物的质量与每个梯度中洗脱剂的体积比独立为1g：(80～160)ml。
优选的，所述步骤(5)中去除所得洗脱液中的洗脱剂在≤50℃条件下进行。
本发明提供了上述技术方案所述提取方法提取得到的取代苯醌提取物，包括2-甲基-1,4-苯醌和2-乙基-1,4-苯醌，所述2-甲基-1,4-苯醌和2-乙基-1,4-苯醌的摩尔比为1︰(0.5～2.5)。
本发明提供了上述技术方案所述取代苯醌提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明提供了一种药物组合物，包括有效剂量的上述技术方案所述取代苯醌提取物和药学上可接受的辅料。
本发明提供了一种喙尾琵琶甲中取代苯醌提取物的提取方法，首先提供喙尾琵琶甲的防御液；将所述防御液进行第一硅胶柱层析分离，所述第一硅胶柱层析分离采用梯度洗脱，所述梯度洗脱包括依次进行的四个梯度，收集第三梯度和第四梯度的洗脱液，去除所得洗脱液中的洗脱剂，得到粗提物；将所述粗提物进行第二硅胶柱层析分离，所述第二硅胶柱层析分离采用梯度洗脱，所述梯度洗脱包括依次进行的三个梯度，收集第二梯度和第三梯度的洗脱液，去除所得洗脱液中的洗脱剂，得到取代苯醌提取物。采用本发明提供的提取方法得到的取代苯醌提取物包括2-甲基-1,4-苯醌和2-乙基-1,4-苯醌，所述2-甲基-1,4-苯醌和2-乙基-1,4-苯醌的摩尔比为1︰(0.5～2.5)。实施例的实验结果表明，采用本发明提供的方法得到的取代苯醌提取物对ags、caco-2、hepg2、u251和bel-7402的ic50分别为3.6±0.6、2.8±0.5、3.8±0.4、3.7±0.8和2.8±0.2，说明所述取代苯醌提取物能够抑制肿瘤细胞增殖，具有显著的细胞毒活性，能够进一步开发成为抗肿瘤药物。
附图说明
图1为2-甲基-1,4-苯醌(1)和2-乙基-1,4-苯醌(2)的结构式。
具体实施方式
本发明提供了一种喙尾琵琶甲中取代苯醌提取物的提取方法，包括以下步骤：
(1)提供喙尾琵琶甲的防御液；
(2)将所述步骤(1)中的防御液进行第一硅胶柱层析分离，所述第一硅胶柱层析分离采用梯度洗脱，所述梯度洗脱包括依次进行的四个梯度，每个梯度中洗脱剂的组成为：
第一梯度中石油醚和丙酮的体积比为(49～51)︰1；
第二梯度中石油醚和丙酮的体积比为(24～26)︰1；
第三梯度中石油醚和丙酮的体积比为(9.5～10.5)︰1；
第四梯度中石油醚和丙酮的体积比为(4.5～5.5)︰1；
(3)收集所述步骤(2)中第三梯度和第四梯度的洗脱液，去除所得洗脱液中的洗脱剂，得到粗提物；
(4)将所述步骤(3)中的粗提物进行第二硅胶柱层析分离，所述第二硅胶柱层析分离采用梯度洗脱，所述梯度洗脱包括依次进行的三个梯度，每个梯度中洗脱剂的组成为：
第一梯度中石油醚和丙酮的体积比为(9.5～10.5)︰1；
第二梯度中石油醚和丙酮的体积比为(7.8～8.2)︰1；
第三梯度中石油醚和丙酮的体积比为(5.8～6.2)︰1；
(5)收集所述步骤(4)中第二梯度和第三梯度的洗脱液，去除所得洗脱液中的洗脱剂，得到取代苯醌提取物。
本发明首先提供喙尾琵琶甲的防御液。在本发明中，所述喙尾琵琶甲优选为成虫喙尾琵琶甲活体。本发明对于所述成虫喙尾琵琶甲活体的来源没有特殊的限定，野外采集或直接从市场购买均可。在本发明中，所述防御液优选是通过物理刺激成虫喙尾琵琶甲活体、所述成虫喙尾琵琶甲活体尾部腺体分泌得到。本发明对于所述物理刺激没有特殊的限定，具体如从背部抓取成虫喙尾琵琶甲活体，采用拇指和食指固定虫体腹背部的两侧，将其尾部碰触收集容器，喙尾琵琶甲的尾部受到收集容器的碰触刺激后，其尾部腺体会分泌黄色透明液体，即为防御液，收集所述防御液进行后续提取处理。需要注意的是，所述防御液的挥发性强，若暴露于空气中，颜色逐渐加深，几个小时后，部分挥发，残留少量的固体状物质，所以，收集防御液的过程需要在避光条件下进行，且收集到的防御液需要避光低温保存，具体可以将收集到的防御液于棕色收集容器中在-10～4℃温度下保存。本发明优选将所述成虫喙尾琵琶甲活体适应性饲养1～2天后再对其进行物理刺激，使其释放防御液。在本发明的实施例中，具体是将野外采集或直接从市场购买的成虫喙尾琵琶甲活体置于具有光滑边缘的宽敞容器(如大塑料盆)内，底部铺垫一层干燥沙土或锯末，喂食蔬菜碎和/或水果碎，饲养环境温度为18～25℃，湿度为40％～70％。
得到喙尾琵琶甲的防御液后，本发明将所述防御液进行第一硅胶柱层析分离，所述第一硅胶柱层析分离采用梯度洗脱，所述梯度洗脱包括依次进行的四个梯度，每个梯度中洗脱剂的组成为：
第一梯度中石油醚和丙酮的体积比为(49～51)︰1；
第二梯度中石油醚和丙酮的体积比为(24～26)︰1；
第三梯度中石油醚和丙酮的体积比为(9.5～10.5)︰1；
第四梯度中石油醚和丙酮的体积比为(4.5～5.5)︰1。
本发明在进行所述第一硅胶柱层析分离前，优选将所述防御液进行预处理，所述预处理优选包括以下步骤：
将所述防御液与丙酮混合，再与硅胶混合，去除所得混合物料中的丙酮，将剩余物料研磨，将得到的粉末物料置于硅胶柱柱顶，然后进行所述第一硅胶柱层析分离。
本发明对于所述丙酮的添加量没有特殊的限定，能够溶解防御液以便后续能够与硅胶混合均匀即可。在本发明中，所述防御液与预处理过程中所用硅胶的质量比优选为1：(2.5～5)，更优选为1：(3～4.5)，最优选为1：(3.5～4)。在本发明中，预处理过程中所用硅胶的粒度优选为300～400目；具体的，在本发明的实施例中，预处理过程中所用硅胶的粒度与所述第一硅胶柱层析分离所用硅胶柱中填充的硅胶的粒度一致。本发明对于去除丙酮所采用的方式没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的去除丙酮的技术方案即可；在本发明的实施例中，具体是将所得混合物料在≤50℃条件下进行水浴加热，以除去丙酮。本发明对于所述研磨没有特殊的限定，能够使所得粉末物料的粒度适于进行后续硅胶柱层析分离即可。
在本发明中，所述第一硅胶柱层析分离过程中，防御液与硅胶柱中填充的硅胶的质量比优选为1：(40～60)，更优选为1：(45～55)，最优选为1:50。在本发明中，所述硅胶的粒度优选为300～400目。
在本发明中，所述第一硅胶柱层析分离过程中，防御液的质量与每个梯度中洗脱剂的体积比优选独立为1g：(62.5～125)ml，更优选为1g：(75～110)ml，最优选为1g：(85～95)ml。
本发明对于所述第一硅胶柱层析分离过程中的压力没有特殊的限定，在常压或加压条件下进行均可。为了保证洗脱速度，在本发明的实施例中，具体的，是在硅胶柱的顶部设置小型空气加压泵提供≤2.5个大气压的压力。
在本发明中，所述述第一硅胶柱层析分离过程中的温度优选≤50℃；在本发明的实施例中，具体是在室温下进行所述第一硅胶柱层析分离，即不需要额外加热或冷却。
在本发明中，所述第一硅胶柱层析分离过程中，第一梯度中石油醚和丙酮的体积比为(49～51)︰1；优选为50:1；第二梯度中石油醚和丙酮的体积比为(24～26)︰1，优选为25:1；第三梯度中石油醚和丙酮的体积比为(9.5～10.5)︰1，优选为10:1；第四梯度中石油醚和丙酮的体积比为(4.5～5.5)︰1，优选为5:1。在本发明中，所述第一梯度和第二梯度的洗脱液中为低极性的烃类杂质，所述第三梯度和第四梯度的洗脱液中包含目标提取物。
完成所述第一硅胶柱层析分离后，本发明收集所述第一硅胶柱层析分离过程中第三梯度和第四梯度的洗脱液，去除所得洗脱液中的洗脱剂，得到粗提物。在本发明中，去除所得洗脱液中的洗脱剂优选在≤50℃条件下进行；在本发明的实施例中，具体的，是在45～50℃下去除所得洗脱液中的洗脱剂。本发明对于去除洗脱剂的方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的去除洗脱剂的方法即可；在本发明的实施例中，具体是通过减压浓缩去除所得洗脱液中的洗脱剂。
得到粗提物后，本发明将所述粗提物进行第二硅胶柱层析分离，所述第二硅胶柱层析分离采用梯度洗脱，所述梯度洗脱包括依次进行的三个梯度，每个梯度中洗脱剂的组成为：
第一梯度中石油醚和丙酮的体积比为(9.5～10.5)︰1；
第二梯度中石油醚和丙酮的体积比为(7.8～8.2)︰1；
第三梯度中石油醚和丙酮的体积比为(5.8～6.2)︰1。
本发明在进行所述第二硅胶柱层析分离前，优选将所述粗提物进行预处理，所述预处理优选包括以下步骤：
将所述粗提物与丙酮混合，再与硅胶混合，去除所得混合物料中的丙酮，将剩余物料研磨，将得到的粉末物料置于硅胶柱柱顶，然后进行所述第二硅胶柱层析分离。
本发明对于所述丙酮的添加量没有特殊的限定，能够溶解粗提物以便后续能够与硅胶混合均匀即可。在本发明中，所述粗提物与预处理过程中所用硅胶的质量比优选为1：(2.5～5)，更优选为1：(3～4.5)，最优选为1：(3.5～4)。在本发明中，预处理过程中所用硅胶的粒度优选为300～400目；具体的，在本发明的实施例中，预处理过程中所用硅胶的粒度与所述第二硅胶柱层析分离所用硅胶柱中填充的硅胶的粒度一致。本发明对于去除丙酮所采用的方式没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的去除丙酮的技术方案即可；在本发明的实施例中，具体是将所得混合物料在≤50℃条件下进行水浴加热，以除去丙酮。本发明对于所述研磨没有特殊的限定，能够使所得粉末物料的粒度适于进行后续硅胶柱层析分离即可。
在本发明中，所述第二硅胶柱层析分离过程中，粗提物与硅胶柱中填充的硅胶的质量比优选为1：(90～110)，更优选为1：(95～105)，最优选为1:100。在本发明中，所述硅胶的粒度优选为300～400目。
在本发明中，所述第二硅胶柱层析分离过程中，粗提物的质量与每个梯度中洗脱剂的体积比优选独立为1g：(80～160)ml，更优选为1g：(95～140)ml，最优选为1g：(110～120)ml。
本发明对于所述第二硅胶柱层析分离过程中的压力没有特殊的限定，在常压或加压条件下进行均可。为了保证洗脱速度，在本发明的实施例中，具体的，是在硅胶柱的顶部设置小型空气加压泵提供≤2.5个大气压的压力。
在本发明中，所述第二硅胶柱层析分离过程中，第一梯度中石油醚和丙酮的体积比为(9.5～10.5)︰1，优选为10:1；第二梯度中石油醚和丙酮的体积比为(7.8～8.2)︰1，优选为8:1；第三梯度中石油醚和丙酮的体积比为(5.8～6.2)︰1，优选为6:1。在本发明中，所述第一梯度的洗脱液中为粗提物中少量极性稍低的非醌类杂质，所述第二梯度和第三梯度的洗脱液中包含目标提取物。
完成所述第二硅胶柱层析分离后，本发明收集所述第二硅胶柱层析分离过程中第二梯度和第三梯度的洗脱液，去除所得洗脱液中的洗脱剂，得到取代苯醌提取物。在本发明中，去除所得洗脱液中的洗脱剂优选在≤50℃条件下进行；在本发明的实施例中，具体的，是在45～50℃下去除所得洗脱液中的洗脱剂。本发明对于去除洗脱剂的方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的去除洗脱剂的方法即可；在本发明的实施例中，具体是通过减压浓缩去除所得洗脱液中的洗脱剂。
本发明提供了采用上述技术方案所述提取方法提取得到的取代苯醌提取物，包括2-甲基-1,4-苯醌和2-乙基-1,4-苯醌，所述2-甲基-1,4-苯醌和2-乙基-1,4-苯醌的摩尔比为1︰(0.5～2.5)，优选为1︰(1～2)。所述2-甲基-1,4-苯醌和2-乙基-1,4-苯醌的结构式见图1。
本发明提供了上述技术方案所述取代苯醌提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明提供了一种药物组合物，包括有效剂量的上述技术方案所述取代苯醌提取物和药学上可接受的辅料。在本发明中，所述药学上可接受的辅料包括但不限于淀粉、羧甲基淀粉钠和硬脂酸镁中的一种或几种；所述有效剂量优选是指取代苯醌提取物占所述药物组合物的质量百分比含量为10.0～99.9％，更优选为25.0～85.0％，进一步优选为35.0～75.0％，最优选为45.0～65.0％。在本发明中，所述药物组合物具有抗肿瘤作用；所述肿瘤优选为消化道肿瘤，更优选为人胃腺癌细胞(ags)、人结直肠腺癌细胞(caco-2)、人肝癌细胞(hepg2)、人胶质瘤细胞(u251)或人肝癌细胞(bel-7402)。
在本发明的实施例中，所述药物组合物具体包括以下重量百分含量的组分：
本发明上述技术方案所述取代苯醌提取物20g；淀粉20g；羧甲基淀粉钠1.5g；硬脂酸镁500mg。
本发明对于将所述药物组合物制备成抗肿瘤药物所采用的方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的技术方案即可；具体的，在本发明的实施例中，采用以下步骤将所述药物组合物制备成药物：
向本发明上述技术方案所述取代苯醌提取物(20g)中加入淀粉(20g)、羧甲基淀粉钠(1.5g)，混合均匀，加入润湿剂乙醇，过20目筛网制备得到湿颗粒，50℃干燥3h，整粒、过筛，然后加入硬脂酸镁(500mg)，混合均匀，填充胶囊，制备得到抗肿瘤药物。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
(1)从市场购买成虫喙尾琵琶甲活体，置于具有光滑边缘的塑料盆内，底部铺垫一层干燥沙土，喂食蔬菜碎，饲养环境温度为20℃，湿度为50％，饲养两天后，从背部抓取成虫喙尾琵琶甲活体，拇指和食指固定虫体腹背部，将其尾部碰触收集容器，喙尾琵琶甲尾部受到收集容器的碰触刺激后，其尾部腺体会分泌黄色透明液体，即得到防御液；
(2)取4g步骤(1)中的防御液与丙酮混合，再与16g粒度为300～400目的硅胶混合，45℃下水浴加热去除所得混合物料中的丙酮，将剩余物料研磨，将得到的粉末物料置于硅胶柱柱顶，然后进行所述第一硅胶柱层析分离其中，防御液与硅胶柱中填充的硅胶的质量比为1:50，硅胶的粒度为300～400目，在硅胶柱顶部设置小型空气加压器加压至1.5个大气压；所述第一硅胶柱层析分离采用梯度洗脱，所述梯度洗脱包括依次进行的四个梯度，每个梯度中洗脱剂的体积为400ml，每个梯度中洗脱剂的组成为：
第一梯度中石油醚和丙酮的体积比为50︰1；
第二梯度中石油醚和丙酮的体积比为25︰1；
第三梯度中石油醚和丙酮的体积比为10︰1；
第四梯度中石油醚和丙酮的体积比为5︰1；
(3)收集所述步骤(2)中第三梯度和第四梯度的洗脱液，在48℃条件下减压浓缩去除所得洗脱液中的洗脱剂，得到粗提物2.5g；
(4)将所述步骤(3)中的粗提物与丙酮混合，再与10g粒度为300～400目的硅胶混合，45℃下水浴加热去除所得混合物料中的丙酮，将剩余物料研磨，将得到的粉末物料置于硅胶柱柱顶，然后进行第二硅胶柱层析分离，其中，粗提物与硅胶柱中填充的硅胶的质量比为1:100，硅胶的粒度为300～400目，在硅胶柱顶部设置小型空气加压器加压至1.5个大气压；所述第二硅胶柱层析分离采用梯度洗脱，所述梯度洗脱包括依次进行的三个梯度，每个梯度中洗脱剂的体积为400ml，每个梯度中洗脱剂的组成为：
第一梯度中石油醚和丙酮的体积比为10︰1；
第二梯度中石油醚和丙酮的体积比为8︰1；
第三梯度中石油醚和丙酮的体积比为6︰1；
(5)收集所述步骤(4)中第二梯度和第三梯度的洗脱液，在48℃条件下减压浓缩去除所得洗脱液中的洗脱剂，得到取代苯醌提取物1.8g。
将所得取代苯醌提取物进行核磁共振分析，核磁共振碳谱和核磁共振氢谱数据见表1。碳谱主要信号显示有高、低两组；高信号组共8个信号，包括1个伯碳，1个仲碳，3个叔碳和3个季碳，低场187.9ppm和187.5ppm两个季碳信号提示有对苯醌结构；高场的1个伯碳，1个仲碳信号结合氢谱高场的一组qd峰和一组t峰提示有乙基取代，所以高信号组结构鉴定为2-乙基-1,4-苯醌(化合物2)。低信号组共7个信号，低场部分信号及化学位移相似，仅高场乙基信号换为甲基信号，所以低信号组鉴定为2-甲基-1,4-苯醌(化合物1)。两个化合物的氢谱均出现了远程耦合，使化合物1中的甲基，裂分为d峰(j＝1.5hz)，化合物2中的亚甲基裂分为qd峰，(j＝7.4hz和1.6hz)，同时，低场的3位芳香氢不再是d峰而是m峰。说明所得取代苯醌提取物为2-甲基-1,4-苯醌和2-乙基-1,4-苯醌的混合物，所述2-甲基-1,4-苯醌和2-乙基-1,4-苯醌的摩尔比约为1︰2。
表1化合物1和化合物2的核磁共振碳谱和核磁共振氢谱数据
注：核磁共振波谱数据在brukerav-400型核磁共振波谱仪测定(δ单位为ppm，j为耦合常数，用括号中的数字表示，单位为hz)；表1中的原子编号对应图1中的原子编号(图1为2-甲基-1,4-苯醌(1)和2-乙基-1,4-苯醌(2)的结构式)；d为双重峰，dd为双双重峰，t为三重峰，qd为四重峰，m为多重峰。
实施例2
(1)从市场购买成虫喙尾琵琶甲活体，置于具有光滑边缘的塑料盆内，底部铺垫一层干燥沙土，喂食蔬菜碎，饲养环境温度为20℃，湿度为65％，饲养两天后，从背部抓取成虫喙尾琵琶甲活体，拇指和食指固定虫体腹背部，将其尾部碰触收集容器，喙尾琵琶甲尾部受到收集容器的碰触刺激后，其尾部腺体会分泌黄色透明液体，即得到防御液；
(2)取50g步骤(1)中的防御液与丙酮混合，再与125g粒度为300～400目的硅胶混合，50℃下水浴加热去除所得混合物料中的丙酮，将剩余物料研磨，将得到的粉末物料置于硅胶柱柱顶，然后进行所述第一硅胶柱层析分离其中，防御液与硅胶柱中填充的硅胶的质量比为1:50，硅胶的粒度为300～400目，在硅胶柱顶部设置小型空气加压器加压至2.5个大气压；所述第一硅胶柱层析分离采用梯度洗脱，所述梯度洗脱包括依次进行的四个梯度，每个梯度中洗脱剂的体积为5000ml，每个梯度中洗脱剂的组成为：
第一梯度中石油醚和丙酮的体积比为50︰1；
第二梯度中石油醚和丙酮的体积比为25︰1；
第三梯度中石油醚和丙酮的体积比为10︰1；
第四梯度中石油醚和丙酮的体积比为5︰1；
(3)收集所述步骤(2)中第三梯度和第四梯度的洗脱液，在50℃条件下减压浓缩去除所得洗脱液中的洗脱剂，得到粗提物30g；
(4)将所述步骤(3)中的粗提物与丙酮混合，再与75g粒度为300～400目的硅胶混合，50℃下水浴加热去除所得混合物料中的丙酮，将剩余物料研磨，将得到的粉末物料置于硅胶柱柱顶，然后进行第二硅胶柱层析分离，其中，粗提物与硅胶柱中填充的硅胶的质量比为1:100，硅胶的粒度为300～400目，在硅胶柱顶部设置小型空气加压器加压至2.5个大气压；所述第二硅胶柱层析分离采用梯度洗脱，所述梯度洗脱包括依次进行的三个梯度，每个梯度中洗脱剂的体积为3500ml，每个梯度中洗脱剂的组成为：
第一梯度中石油醚和丙酮的体积比为10︰1；
第二梯度中石油醚和丙酮的体积比为8︰1；
第三梯度中石油醚和丙酮的体积比为6︰1；
(5)收集所述步骤(4)中第二梯度和第三梯度的洗脱液，在50℃条件下减压浓缩去除所得洗脱液中的洗脱剂，得到取代苯醌提取物21.2g。
实施例3
将本发明实施例1步骤(1)得到的防御液和步骤(5)得到的取代苯醌提取物进行抗肿瘤活性测试。
1、实验试剂
(1)噻唑蓝(mtt)溶液的配制
精确称取250mg噻唑蓝粉末与50ml磷酸盐缓冲液(pbs)混合，得到5mg/ml的噻唑蓝溶液，避光保存。
(2)三联液的配制
称取十二烷基硫酸钠(sds)粉末50g，质量浓度为37％的盐酸0.5ml及异丁醇25ml，用三蒸水稀释后磁力搅拌混匀，混匀后将所得液体转移至500ml容量瓶中，定容至500ml，再次混匀，将配制好的三联液转移至蓝盖玻璃瓶内，常温保存。
(3)阳性药物溶液和受试药物溶液的配制
用pbs将顺铂(阳性药物)粉剂、实施例1得到的防御液和取代苯醌提取物(受试药物)分别配制为50mg/ml的母液于-20℃闭光保存；实验时用pbs将母液倍比稀释为0.01mg/ml、0.03mg/ml、0.1mg/ml、0.3mg/ml、1mg/ml五个浓度，分别得到对应浓度的阳性药物溶液和受试药物溶液。
2、mtt测试
(1)种板：将肿瘤细胞消化后离心，弃去上清液，向剩余部分中加入新鲜培养基得到细胞悬液，吸取10μl细胞悬液，将其与等体积的台盼蓝混合，使用细胞计数板计数后，调整细胞浓度为(1～3)×105个/ml；设置五个浓度梯度，每个浓度设置三个复孔。
(2)给药：种板后将96孔板置于co2培养箱中培养24h后，每孔加入对应浓度的阳性药物溶液和受试药物溶液10μl(浓度分别为0.01mg/ml、0.03mg/ml、0.1mg/ml、0.3mg/ml、1mg/ml)。
(3)测板：给药后培养48h，加入mtt溶液15μl/孔；4h后加入三联液150μl/孔，16h后用酶标仪在490nm下测定各孔的od值。
3、数据处理与测试结果
用下述公式计算细胞增殖抑制率，根据细胞增殖抑制率与相应的浓度梯度，用spss17.0计算阳性药物和受试药物的ic50值，结果如表2所示。
细胞增值抑制率(％)＝(阴性对照组od值-受试组od值)/(阴性对照组od值-空白对照组od值)×100％，其中，阴性对照组是指加入mtt和三联液但未加任何阳性药物和受试药物的pbs溶液，空白对照组是指未加mtt、三联液、阳性药物和受试药物的pbs溶液。
表2阳性药物及受试药物抑制肿瘤细胞生长的ic50值
注：ags：人胃腺癌细胞；caco-2：人结直肠腺癌细胞；hepg2：人肝癌细胞；u251：人胶质瘤细胞；bel-7402：人肝癌细胞。
根据表2结果可知，实施例1中取代苯醌提取物具有显著的细胞毒活性，能够进一步开发成为抗肿瘤药物。
由以上实施例可知，采用本发明提供的方法能够成功的从喙尾琵琶甲的防御液中提取出抑制肿瘤细胞增殖的活性物质，且提取方法简单，可操作性强。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。