一种大白菜种质和品种系谱关系的鉴定方法与流程

本发明属于植物育种技术领域，尤其是大白菜育种技术，具体涉及一种大白菜种质和品种系谱关系的鉴定方法。

背景技术：

遗传多样性研究是植物种质资源有效利用和保护的重要基础，检测和研究植物种质资源的遗传多样性,可以揭示遗传多样性形成和维持的机制,为植物种质资源高效利用和合理保护策略的制定提供科学依据和实施方案。

植物种质资源遗传多样性研究的工具除表型标记外,主要是生物化学标记如同功酶标记，和以DNA为基础的分子标记(张赤红等，应用SSR标记对61个国家大麦遗传多样性的研究，植物遗传资源学报，2008,9(1):15-19；GarrisAJ,TaiTH,CoburnJ,etal，Genetic structure and diversity in Oryza sativa，Genetics，2005，69:1631-1638)。其中尤其是随着分子生物学的发展，基于遗传物质即DNA的序列差异而开发的各种分子标记被广泛应用于农作物品种或资源的亲缘关系鉴定。遗传多样性研究所采用的分子标记工具主要有显性和共显性两种,在所使用的分子标记中，尤以分布广、重复性好的共显性标记为宜，如SSR、InDels、SNP等。简单序列重复(simple sequence repeats,SSRs)，又称为微卫星DNA(microsatellite DNA)，是一类由1～6个核苷酸串联重复组成的DNA序列，如(CA)n、(ATG)n、(TAGG)n等重复，其长度一般较短，广泛分布于基因组的不同位置，由于重复基元数和基元碱基数的不同造成了每个位点的多态性，SSR标记可分为基因组SSR和EST-SSR两种类型，SSR标记具有共显性、重复性好、多态性丰富、易于检测等优点。插入/缺失多态性(insertion/deletions,InDels)标记是由于同一位点处的DNA序列在不同个体间发生了核苷酸片段的插入/缺失，根据目标位点两侧的序列设计特异引物进行PCR扩增，扩增片段的长度多态性即是InDels标记，InDel标记是根据同源序列之间的插入缺失差异来开发的，这对于基因组序列未知的作物而言开发具有一定的难度，InDels标记为一共显性标记，具有较好的稳定性及多态性丰富等优点。

在遗传多样性研究中，显性和共显性两种不同类型的分子标记产生不同的数据类型，显性分子标记产生二元型数据(可用1/0标记),而共显性分子标记产生基因型数据，数据形式不同给遗传多样性的分析和研究带来多方面的困难。针对共显性分子标记，如SSR、InDels等，长期以来，研究者采用这些标记鉴定农作物种质的亲缘关系时，一般采用特定的软件如NTSYS、Popgene等，都需要将标记检测结果按软件的要求转化为0/1矩阵或者AA/BB字母矩阵，然后再经过繁复的计算才能得到结果。然而，例如采用NTSYS聚类分析软件时，标记文件准备步骤繁琐，且NTSYS只能分析纯系之间的关系，并不适宜分析杂交种和纯系之间的关系。

技术实现要素：

针对上述现有技术存在的问题，本发明开发一种大白菜种质和品种系谱关系的鉴定方法，通过一种共显性标记赋值方法，尤其是关于InDels标记的赋值方法，将同一样本的一系列共显性标记的检测结果转化为由A、C、G、T四种碱基字母组成的“标记序列”，并结合常规核酸多样性分析软件如DNAMAN、clusterW、MEGA等，将不同样本的标记检测结果用核酸多样性分析软件进行分析比对，绘制同源关系树，即可直观的看出各材料之间的亲缘关系。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

首先，本发明公开了一种大白菜种质和品种系谱关系的鉴定方法，包括以下步骤：

(1)待检测样本基因组DNA提取；

(2)共显性标记的选择和筛选标准：根据共显性标记设计引物进行扩增和PAGE检测，选择具有多态性的特异性良好的引物组合，进行PCR扩增和毛细管电泳检测；

(3)标记赋值：将所有待检测样本的标记检测结果按顺序排列，一批样本中标记的顺序一致；如果单一标记在所有检测样本中的目的片段大小大于四种，则淘汰这一标记；单个多态性标记在所有样本中的检测结果按目的片段由大到小依次赋值为A、G、T、C；单个标记在特定样本中的检测结果赋值由两个字母组成；对于检测样本中所选标记完全缺失状况，缺失样本所占比例超过检测样本的百分之六十以上，淘汰该标记，缺失条带以NN表示；

(4)种质和品种系谱关系的鉴定结果输出：将上述标记赋值后生成由A/T/G/C字母组成的一段“DNA”序列，将不同待检测样本的标记检测结果用核酸多样性分析软件进行分析比对，绘制同源关系树，获得各待检测样本之间的亲缘关系。

本发明针对大白菜种质和品种系谱关系进行鉴定，大白菜是二倍体作物，其共显性分子标记(如SSR、InDels等)产生的基因型数据具有多样性，大多数共显性分子标记如SSR/InDels有效等位基因数多为4个以内(仪泽会等，大白菜简单序列重复(SSR)和插入/缺失(InDel)标记的开发及通用性分析，农业生物技术学报，2012,20(12):1398～1406，该文章技术内容一并纳入本申请)，由于DNA序列比对软件如DNAMAN可以根据多个DNA序列的相似性直观地给出所有序列的同源关系树文件，本发明有效的将常规核酸多样性分析软件如DNAMAN、clusterW、MEGA等的序列分析与二倍体大白菜共显性标记赋值分析相结合，以解决NTSYS只能认识二元型的0、1数据矩阵,而不能判读基因型数据或者NTSYS、Popgene等都需要将标记检测结果按软件的要求转化为0/1矩阵或者AA/BB字母矩阵的繁琐性问题。

具体的，本发明鉴定方法步骤(1)中，待检测样本基因组DNA提取可采取现有技术已知的方法，例如大白菜样本基因组DNA提取，参照刘栓桃等(农业生物技术学报，2014,22(7):853～861)的方法。

本发明优选的实施方式中，本发明所述共显性标记为SSR、InDels、SNP中的一种。

本发明一个优选的实施例中，共显性标记为InDels标记。本发明步骤(2)中所选择的InDels标记可以是现有技术已经公开报道的，如仪泽会等，大白菜简单序列重复(SSR)和插入/缺失(InDel)标记的开发及通用性分析，农业生物技术学报，2012,20(12):1398～1406，或新开发的标记，如张志刚等，农业生物技术学报，2016,24(4):510～518，两者文章内容一并纳入本申请。

例如，在标记开发中，通过对大白菜样本进行全基因组重测序、筛选测序数据中插入缺失差异在5bp以上的位点，于两侧保守区设计引物，进行PCR扩增和PAGE检测。

在具体的InDels共显性标记的选择和筛选标准中，选择样本中InDels标记有差异且分别只能够扩增出单一条带的引物组合，用于进行PCR扩增和毛细管电泳检测。

优选的，开发标记所用材料是日本大白菜杂交品种健春的自交分离株系06-247与大白菜地方品种河南二包头的自交分离株系He102。

具体的实施方式中，单个标记在特定样本中的检测结果赋值由两个字母组成，纯合型为AA、GG、TT、CC，杂合型赋值为AG、AT、AC、GT、GC、TC或CT、CG、CA、TG、TA、GA，一批样本中赋值标准一致。

具体的，杂合型赋值在一批样本中的顺序或是相对大的片段赋值在先、相对小的片段赋值在后，即可能是AG、AT、AC、GT、GC、TC，或者反之即相对小的片段赋值在先、相对大的片段赋值在后，即CT、CG、CA、TG、TA、GA，在一批样本中遵循一个顺序即可。

具体的实施方式中，核酸多样性分析软件选自DNAMAN、clusterW、MEGA中的一种或几种。

具体的实施例中，本发明采用DNAMAN和MEGA6.0软件对杂交种的亲缘关系鉴定，以鉴别新上市杂交种与已经销售的品种之间的亲缘关系；采用MEGA6.0对核心种质和杂交种的进行UPGMA聚类分析，不仅分析杂交种的系谱关系，而且比较容易判断出某杂交种的双亲来源。

优选的实施例中，本发明所述鉴定方法可用于大白菜杂交种之间亲缘关系鉴定。

优选的实施方式中，本发明所述鉴定方法用于收集的杂交种资源进行分子标记鉴定，判断其同已有种质的亲缘关系，寻找亲缘关系比较接近的材料进行回交转育，以有目的地进行种质创新、避免盲目性。

本发明取得了以下有益效果：

相对于聚类分析软件NYSYS、popgene等，DNA比对软件DNAMAN、MEGA等在分子生物学研究者中普及率比较高，因此将带型简单的InDels共显性标记的检测结果转化成A、G、T、C四个字母，四个字母依次表示条带由大到小，由于大白菜是二倍体作物，一个标记的检测结果由两个字母组成，即纯合型用AA、GG、TT或CC表示，杂合型在一批样本中的顺序要么是相对大的片段在先、相对小的片段在后，即可能是AG、AT、AC、GT、GC、TC，或者反之即相对小的片段在先、相对大的片段在后，即CT、CG、CA、TG、TA、GA，在一批样本中遵循一个顺序。另外，所选标记有可能在部分检测样本中是完全缺失的，如果缺失样本所占比例超过检测样本的百分之六十以上，淘汰该标记，不足百分之六十时缺失条带以NN表示。一组标记的检测结果在一批样本中按一定顺序排列，某一材料的所有标记检测结果就是一段“DNA序列”，这样的结果可以很容易地用DNAMAN、和MEGA软件进行比对，输出直观的比对结果，经与NTSYS聚类结果比较，基本一致。该赋值方法省去了NTSYS聚类分析软件的标记文件准备步骤，操作简单，关键是该方法适合分析杂交种和纯系之间的关系，不像NTSYS只能分析纯系之间的关系，所以既方便又实用。

附图说明

图1标记的筛选

图2 40个杂交种的DNAMAN5.0分析结果

图3 40个杂交种的MEGA 6.0分析结果

图4 127份资源的MEGA6.0分析结果

图5 127份资源的NTSYS 2.0聚类结果

图6 40个杂交种与127份核心资源的亲缘关系

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

1材料和方法：

1.1材料

开发标记所用材料是日本大白菜杂交品种健春的自交分离株系06-247与大白菜地方品种河南二包头的自交分离株系He102。40个大白菜杂交种从市场购得详见表1，127份核心资源为山东省农业科学院蔬菜花卉研究所大白菜课题组自主创制，详见表2。

表1 40个杂交种信息

表2 127份种质资源信息

1.2供试材料基因组DNA提取

参照刘栓桃等(农业生物技术学报，2014,22(7):853～861)的方法。

1.3InDels标记的开发和筛选标准

标记开发见张志刚等(农业生物技术学报，2016,24(4):510～518)的方法，即通过对06-247与He102进行全基因组重测序、筛选测序数据中插入缺失差异在5bp以上的位点，于两侧保守区设计引物，进行PCR扩增和PAGE检测。选择那些有多态性的特异性良好的引物组合，即在06-247与He102中有差异且分别只能够扩增出单一条带的引物组合，对杂交种和核心种质进行PCR扩增，毛细管电泳检测。

1.4标记赋值方法与赋值

将所有待检测标记按一定顺序排列，一批样本中标记的顺序不能更改。由于所选标记特异性好，在单一样本中只能扩增出1-2条带，单个多态性标记在所有材料中的检测结果按目的片段由大到小依次赋值为A、G、T、C，如果单一标记在所有检测样本中的目的片段大小大于四种，则淘汰这一标记。由于大白菜是二倍体作物，则单个标记在特定样品中的检测结果将由两个字母组成，纯合型为AA、GG、TT、CC，杂合型赋值在一批样本中的顺序要么是相对大的片段赋值在先、相对小的片段赋值在后，即可能是AG、AT、AC、GT、GC、TC，或者反之即相对小的片段赋值在先、相对大的片段赋值在后，即CT、CG、CA、TG、TA、GA，在一批样本中遵循一个顺序即可。另外，所选标记有可能在部分检测样本中是完全缺失的，如果缺失样本所占比例超过检测样本的百分之六十以上，淘汰该标记，缺失条带以NN表示。

1.5结果的输出

按照上述方法，一个样本用X个标记进行检测，将得到由2X个字母组成的一段“DNA”序列，这样的序列文件可以很容被核酸多样性分析软件如DNAMAN、clusterW等识别。

2结果

2.1筛选的标记

如图1所示筛选标记时的PAGE检测结果，图中数字是标记编号，每个标记对应两个泳道，左侧以06-247为模板，右侧以He102为模板，根据检测结果，淘汰那些没有多态性标记(如9号、17号)、显性标记(如11号)以及扩增条带复杂的标记(如3号、4号、6号等)，只选择那些在06-247与He102中分别能扩增出单一多态性条带的标记如1号、16号和18号。采用这种严格的筛选方法，共选择80对标记进行后续的研究，其编号从X1到X80。

2.2对杂交种的鉴定

用DNAMAN和MEGA6.0软件对40个杂交种的亲缘关系鉴定结果如图2和3所示，在已有的文献中没有关于杂交种之间亲缘关系鉴定的有关报道。通过上述鉴定结果，可以很容易鉴别新上市杂交种与已经销售的品种之间的亲缘关系，知道它是那个品种的替代品或升级版。通过与旧的品种对照，可以筛选到与改良性状连锁的分子标记并用于种质创新。

2.3对核心种质的鉴定

用MEGA6.0对127份核心种质的进行UPGMA聚类分析，结果如图4所示，该结果与NTsys2.0的分析结果(如图5)基本一致。已有文献中未见用MEGA软件分析种质资源相互关系的有关报道。

2.4杂交种系谱关系鉴定

通过一个杂交种的特有标记判断其亲本的来源，需要分析杂交种和种质之间的亲缘关系，在已有文献中没有关于这方面的研究。采用本发明的赋值方法，可以十分方便地分析杂交种的系谱关系，如图6是所有40个杂交种与127份种质的关系，从中可以比较容易判断出某杂交种的双亲来源。

随着杂交种的普及和推广，农家品种几近消亡，导致收集杂交种也成为种质资源收集的一种重要形式，对收集的杂交种进行田间农艺性状和综合抗性鉴定之后再自交分离优良株系，通过回交转育改良已有品系，是目前大白菜种质创新的一种主要形式。为了避免双亲同质化，需要预先对收集的资源进行分子标记鉴定，判断其同已有种质的亲缘关系，找亲缘关系比较接近的材料进行回交转育，以有目的地进行种质创新、避免盲目性。