大白菜ssr核心引物及品种检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了大白菜SSR核心引物及品种检测试剂盒。本发明提供了鉴定待测大白菜品种的SSR引物组，由单独使用的如下28个引物对组成，本发明的实验证明，本发明开发的大白菜SSR核心引物及品种检测试剂盒，可以用来鉴定待测大白菜品种，使得辨别品种真伪的操作变得准确便捷。
【专利说明】大白菜SSR核心引物及品种检测试剂盒 【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及大白菜SSR核心引物及品种检测试剂盒。 【背景技术】
[0002] 近年来，随着大白菜育种的发展，品种数目急剧增多，存在一品多名和一名多品等 现象，如何快速准确地进行品种鉴定对白菜种业的可持续发展具有重要意义。与田间小区 种植鉴定方法相比，DNA指纹图谱技术具有高效、准确、不受环境条件影响、实验操作简单和 周期短等优势。其中以PCR为基础的第二代分子标记技术SSR (Simple sequence repeat) 具有共显性、多态性丰富、扩增带型稳定、操作简单及成本低廉等特点，而且白菜基因组测 序已完成，使得规模化开发SSR标记成为可能，定位于白菜分子遗传图谱上的SSR标记已超 过2000个，这为SSR标记技术应用于大白菜品种鉴定具备了良好的前提条件。
[0003] 目前，在玉米上已经开发了以SSR标记为基础的品种DNA指纹检测试剂盒产品，可 以简单快速地进行玉米品种的真伪鉴定。但在大白菜上相应的研究起步较晚，尚无类似的 产品出现。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是提供鉴定待测大白菜品种的SSR引物组。
[0005] 本发明提供的引物组，由单独使用的如下28个引物对组成：
[0006] BVSSRA01-1，其由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的 单链DNA分子组成；
[0007] BVSSRA01-2,其由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的 单链DNA分子组成；
[0008] BVSSRA01-3,其由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的 单链DNA分子组成；
[0009] BVSSRA02-1，其由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的 单链DNA分子组成；
[0010] BVSSRA02-2,其由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序列10所示的 单链DNA分子组成；
[0011] BVSSRA02-3,其由序列表中序列11所示的单链DNA分子和序列表中序列12所示 的单链DNA分子组成；
[0012] BVSSRA03-1，其由序列表中序列13所示的单链DNA分子和序列表中序列14所示 的单链DNA分子组成；
[0013] BVSSRA03-2,其由序列表中序列15所示的单链DNA分子和序列表中序列16所示 的单链DNA分子组成；
[0014] BVSSRA03-3,其由序列表中序列17所示的单链DNA分子和序列表中序列18所示 的单链DNA分子组成；
[0015] BVSSRA04-1，其由序列表中序列19所示的单链DNA分子和序列表中序列20所示 的单链DNA分子组成；
[0016] BVSSRA04-2,其由序列表中序列21所示的单链DNA分子和序列表中序列22所示 的单链DNA分子组成；
[0017] BVSSRA05-1，其由序列表中序列23所示的单链DNA分子和序列表中序列24所示 的单链DNA分子组成；
[0018] BVSSRA05-2,其由序列表中序列25所示的单链DNA分子和序列表中序列26所示 的单链DNA分子组成；
[0019] BVSSRA05-3,其由序列表中序列27所示的单链DNA分子和序列表中序列28所示 的单链DNA分子组成；
[0020] BVSSRA06-1，其由序列表中序列29所示的单链DNA分子和序列表中序列30所示 的单链DNA分子组成；
[0021] BVSSRA06-2,其由序列表中序列31所示的单链DNA分子和序列表中序列32所示 的单链DNA分子组成；
[0022] BVSSRA06-3,其由序列表中序列33所示的单链DNA分子和序列表中序列34所示 的单链DNA分子组成；
[0023] BVSSRA07-1，其由序列表中序列35所示的单链DNA分子和序列表中序列36所示 的单链DNA分子组成；
[0024] BVSSRA07-2,其由序列表中序列37所示的单链DNA分子和序列表中序列38所示 的单链DNA分子组成；
[0025] BVSSRA07-3,其由序列表中序列39所示的单链DNA分子和序列表中序列40所示 的单链DNA分子组成；
[0026] BVSSRA08-1，其由序列表中序列41所示的单链DNA分子和序列表中序列42所示 的单链DNA分子组成；
[0027] BVSSRA08-2,其由序列表中序列43所示的单链DNA分子和序列表中序列44所示 的单链DNA分子组成；
[0028] BVSSRA08-3,其由序列表中序列45所示的单链DNA分子和序列表中序列46所示 的单链DNA分子组成；
[0029] BVSSRA09-1，其由序列表中序列47所示的单链DNA分子和序列表中序列48所示 的单链DNA分子组成；
[0030] BVSSRA09-2,其由序列表中序列49所示的单链DNA分子和序列表中序列50所示 的单链DNA分子组成；
[0031] BVSSRA09-3,其由序列表中序列51所示的单链DNA分子和序列表中序列52所示 的单链DNA分子组成；
[0032] BVSSRA10-1，其由序列表中序列53所示的单链DNA分子和序列表中序列54所示 的单链DNA分子组成；
[0033] BVSSRA10-2,其由序列表中序列55所示的单链DNA分子和序列表中序列56所示 的单链DNA分子组成。
[0034] 上述的引物组中，每个所述引物对中各条引物的摩尔比为1:1。
[0035] 本发明的第二个目的是提供鉴定待测大白菜品种PCR试剂组。
[0036] 本发明提供的PCR试剂组，由单独使用的28个PCR试剂组成；
[0037] 每个PCR试剂由上述引物组中的一种引物对、PCR反应缓冲液和水组成；
[0038] 所述引物对中每条引物在其隶属的PCR试剂中的终浓度均具体为0. 5 μ mol/L。
[0039] 本发明第三个目的是提供鉴定待测大白菜品种的PCR试剂盒。
[0040] 本发明提供的PCR试剂盒，包括上述的引物组或上述的PCR试剂组。
[0041] 上述的引物组或上述的PCR试剂组或上述的PCR试剂盒在鉴定待测大白菜品种中 的应用也是本发明保护的范围。
[0042] 上述的引物组或上述的PCR试剂组或上述的PCR试剂盒在大白菜品种真伪性鉴别 中的应用也是本发明保护的范围。
[〇〇43] 本发明第三个目的是提供鉴定或辅助鉴定待测大白菜品种的方法。
[0044] 本发明提供的方法，包括如下步骤：
[0045] 1)构建DNA指纹图谱库；
[0046] 所述构建DNA指纹图谱库的方法包括如下步骤：
[0047] (1)利用上述的引物组中的28种引物分别242个标准品种进行SSR扩增，得到不 同引物对的SSR扩增产物；
[0048] (2)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测不同引物对的SSR扩增产物，得到242个标准 品种不同引物对的电泳图谱；
[0049] (3)将242个标准品种不同引物对的电泳图谱利用GGT2. 0软件构建242个标准品 种DNA指纹图谱，将242个标准品种的DNA指纹图谱组成DNA指纹图谱库；
[0050] 2)重复上述1)的方法中的1)-3)，仅将242个标准品种替换为待测样本，其余步 骤不变，得到待测样本DNA指纹图谱；
[0051] 3)使用Mega5. 0软件的UPGMA法比对待测样本DNA指纹图谱和所述DNA指纹图谱 库，若所述待测样本DNA指纹图谱为DNA指纹图谱库中哪个品种的DNA指纹图谱，则所述待 测样本为或候选为该品种；若所述待测样本DNA指纹图谱不为DNA指纹图谱库中哪个品种 的DNA指纹图谱，则所述待测样本不为或候选不为该品种；
[0052] 所述242个标准品种为表2和表3所示的品种。
[0053] 上述方法中，所述SSR扩增的模板为待测大白菜的基因组DNA。
[0054] 所述SSR扩增采用Touchdown程序：94°C预变性5min ;94°C变性35s，62°C复性 45s(每个循环降低1°C )，72°C延伸45s，共10个循环；94°C变性35s，52°C复性45s，72°C延 伸45s，共23个循环；72°C延伸6min ;12°C保存。
[0055] 本发明的实验证明，本发明开发的大白菜SSR核心引物及品种检测试剂盒，可以 用来鉴定待测大白菜品种和新种质，使得辨别品种真伪的操作变得准确便捷，利用该试剂 盒还包括大白菜谱带标准，不仅检测结果稳定可靠、操作便捷和成本低廉，而且有利于技术 的标准化，尤其是建立了每对引物扩增等位位点的参照标准样品，它是本试剂盒的一个重 要组成部分，这为大白菜品种质量监控和品种权保护提供了技术支持。 【专利附图】
【附图说明】
[0056] 图1为引物BVSSRA01-3、BVSSRA05-3和BVSSRA07-1扩增等位基因的梯度分子量 标准
[0057] 图2为242份品种的基因分型图
[0058] 图3为28对SSR核心引物对242份大白菜品种的聚类结果 【具体实施方式】
[0059] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0060] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0061] 实施例1、大白菜28对SSR核心引物及含有其试剂盒的制备
[0062] 一、SSR核心引物的制备
[0063] 从大白菜2000多对SSR引物中经过大量的筛选试验挑选出来表1所示的28对 SSR核心引物。
[0064] 表1为28对SSR核心引物序列
[0065]
[0066]
【权利要求】
1.鉴定待测大白菜品种的SSR引物组，由单独使用的如下28个引物对组成： BVSSRA01-1，其由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链 DNA分子组成； BVSSRA01-2,其由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单链 DNA分子组成； BVSSRA01-3,其由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链 DNA分子组成； BVSSRA02-1，其由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链 DNA分子组成； BVSSRA02-2,其由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序列10所示的单链 DNA分子组成； BVSSRA02-3,其由序列表中序列11所示的单链DNA分子和序列表中序列12所示的单 链DNA分子组成； BVSSRA03-1，其由序列表中序列13所示的单链DNA分子和序列表中序列14所示的单 链DNA分子组成； BVSSRA03-2,其由序列表中序列15所示的单链DNA分子和序列表中序列16所示的单 链DNA分子组成； BVSSRA03-3,其由序列表中序列17所示的单链DNA分子和序列表中序列18所示的单 链DNA分子组成； BVSSRA04-1，其由序列表中序列19所示的单链DNA分子和序列表中序列20所示的单 链DNA分子组成； BVSSRA04-2,其由序列表中序列21所示的单链DNA分子和序列表中序列22所示的单 链DNA分子组成； BVSSRA05-1，其由序列表中序列23所示的单链DNA分子和序列表中序列24所示的单 链DNA分子组成； BVSSRA05-2,其由序列表中序列25所示的单链DNA分子和序列表中序列26所示的单 链DNA分子组成； BVSSRA05-3,其由序列表中序列27所示的单链DNA分子和序列表中序列28所示的单 链DNA分子组成； BVSSRA06-1，其由序列表中序列29所示的单链DNA分子和序列表中序列30所示的单 链DNA分子组成； BVSSRA06-2,其由序列表中序列31所示的单链DNA分子和序列表中序列32所示的单 链DNA分子组成； BVSSRA06-3,其由序列表中序列33所示的单链DNA分子和序列表中序列34所示的单 链DNA分子组成； BVSSRA07-1，其由序列表中序列35所示的单链DNA分子和序列表中序列36所示的单 链DNA分子组成； BVSSRA07-2,其由序列表中序列37所示的单链DNA分子和序列表中序列38所示的单 链DNA分子组成； BVSSRA07-3,其由序列表中序列39所示的单链DNA分子和序列表中序列40所示的单 链DNA分子组成； BVSSRA08-1，其由序列表中序列41所示的单链DNA分子和序列表中序列42所示的单 链DNA分子组成； BVSSRA08-2,其由序列表中序列43所示的单链DNA分子和序列表中序列44所示的单 链DNA分子组成； BVSSRA08-3,其由序列表中序列45所示的单链DNA分子和序列表中序列46所示的单 链DNA分子组成； BVSSRA09-1，其由序列表中序列47所示的单链DNA分子和序列表中序列48所示的单 链DNA分子组成； BVSSRA09-2,其由序列表中序列49所示的单链DNA分子和序列表中序列50所示的单 链DNA分子组成； BVSSRA09-3,其由序列表中序列51所示的单链DNA分子和序列表中序列52所示的单 链DNA分子组成； BVSSRA10-1，其由序列表中序列53所示的单链DNA分子和序列表中序列54所示的单 链DNA分子组成； BVSSRA10-2,其由序列表中序列55所示的单链DNA分子和序列表中序列56所示的单 链DNA分子组成。
2. 根据权利要求1所述的引物组，其特征在于：每个所述引物对中各条引物的摩尔比 为 1:1。
3. 鉴定待测大白菜品种PCR试剂组，由单独使用的28个PCR试剂组成； 每个PCR试剂由权利要求1或2所述引物组中的一种引物对、PCR反应缓冲液和水组 成； 所述引物对中每条引物在其隶属的PCR试剂中的终浓度均具体为0. 5 μ mol/L。
4. 鉴定待测大白菜品种的PCR试剂盒，包括权利要求1或2所述的引物组或权利要求 3所述的PCR试剂组。
5. 权利要求1或2所述的引物组或权利要求3所述的PCR试剂组或权利要求4或5所 述的PCR试剂盒在鉴定待测大白菜品种中的应用。
6. 权利要求1或2所述的引物组或权利要求3所述的PCR试剂组或权利要求4或5所 述的PCR试剂盒在大白菜品种真伪性鉴别中的应用。
7. 鉴定或辅助鉴定待测大白菜品种的方法，包括如下步骤： 1)构建DNA指纹图谱库； 所述构建DNA指纹图谱库的方法包括如下步骤： (1)利用权利要求1或2所述的引物组中的28种引物分别242个标准品种进行SSR扩 增，得到不同引物对的SSR扩增产物； ⑵非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测不同引物对的SSR扩增产物，得到242个标准品种 不同引物对的电泳图谱； (3)将242个标准品种不同引物对的电泳图谱利用GGT2. 0软件构建242个标准品种 DNA指纹图谱，将242个标准品种的DNA指纹图谱组成DNA指纹图谱库； 2) 重复上述1)的方法中的1)-3)，仅将242个标准品种替换为待测样本，其余步骤不 变，得到待测样本DNA指纹图谱； 3) 使用Mega5. 0软件的UPGMA法比对待测样本DNA指纹图谱和所述DNA指纹图谱库， 若所述待测样本DNA指纹图谱为DNA指纹图谱库中哪个品种的DNA指纹图谱，则所述待测 样本为或候选为该品种；若所述待测样本DNA指纹图谱不为DNA指纹图谱库中哪个品种的 DNA指纹图谱，则所述待测样本不为或候选不为该品种； 所述242个标准品种为表2和表3所不的品种。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于： 所述SSR扩增的模板为待测大白菜的基因组DNA。
【文档编号】C12Q1/68GK104087668SQ201410323328
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月8日 优先权日:2014年7月8日
【发明者】于拴仓, 苏同兵, 隋光磊, 张凤兰, 余阳俊, 张德双, 赵岫云, 卢桂香, 汪维红, 徐家炳 申请人:北京市农林科学院