专利名称：大白菜est-ssr标记引物及其在品种鉴定中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及大白菜EST-SSR标记引物及其在品种鉴定中的应用，属于分子生物学技术领域。
背景技术：
大白菜(Brassica rapa L. ssp. pekinensis)为十字花科芸薹属植物,是我国和东亚国家的重要蔬菜。品种的差异直接影响着大白菜的生产和食用品质，因此大白菜品种鉴别和纯度鉴定工作非常重要。传统的最可靠的种子纯度检测方法是GOT (grow-out test)法，它是通过田间种植，根据形态学特征对杂交种进行鉴定。GOT法的最大缺点是费时费力、容易受环境和主观因素的影响。近年来，同工酶、蛋白质电泳法可以用于蔬菜种子纯度的鉴·定，然而，一些亲缘关系近、来自同一地区的蔬菜品种由于蛋白质电泳的多态性少，往往难以区分。因此，建立一套快速、精确、廉价的蔬菜种子纯度检测技术，显得非常必要。随着现代分子生物学的发展，分子标记越来越多的被应用于种子纯度鉴定中，如以分子杂交为基础的RFLP、以酶切和PCR为基础的AFLP等、以PCR反应为基础的RAPD、SCAR、SSR、ISSR等。与其它分子标记相比，SSR标记具有许多独特的优点。SSR标记在单个座位上能检测到的多态性远高于其它几种分子标记，而且它广泛、随机地分布于整个基因组，具有共显性遗传的特点；SSR标记可以准确高效地鉴别大量等位基因；利用杂交种双亲在一些SSR位点的差异，可以将呈父母本互补带型的杂交种与其双亲、甚至也可以将一些异源花粉造成的杂交种区分开。由于上述特点，SSR标记逐步成为蔬菜作物品种鉴定的理想分子标记之一。迄今为止简单重复序列(Simple sequence repeat, SSR)标记已在多种农作物种子的品种纯度鉴定中得到应用。根据建立SSR标记序列性质不同，SSR标记可分为，基因组SSR (gSSR)和表达序列标签SSR (EST-SSR)0与构建小片段基因组文库进行SSR的筛选建立gSSR标记相比，从EST数据库中获得SSR建立EST-SSR标记要经济得多；而且EST-SSR标记来源于DNA的转录区域，比gSSR标记具有更高的通用性。李新海等利用SSR标记研究了 70份我国主要玉米自交系的遗传变异(参见《中国农业科学》，2003年第36卷第6期，《利用SSR标记划分70份我国玉米自交系的杂种优势群》)；番兴明等利用SSR标记将我国温带玉米主要杂种优势群进行了划分(参见《作物学报》，2003年11月，第29卷第6期，《利用SSR标记对29个热带和温带玉米自交系进行杂种优势群的划分》)；李稳香等用SSR标记对10个杂交水稻组合的子一代种子纯度进行了鉴定(参见《福建农林大学》，2006年，利用SSR标记构建水稻特征指纹及种子纯度分析的研究);彭锁堂等对我国9个主要的杂交水稻组合及其亲本进行了 SSR标记分析(参见《中国水稻科学》，2003年01期，我国主要杂交水稻组合及其亲本SSR标记和纯度鉴定)。陈琢等开发了甘蓝的EST-SSR标记(参见《园艺学报》，2010年02期，甘蓝EST-SSR标记的开发与应用)。李丽和郑晓鹰建立了用于白菜和大白菜品种鉴定的由3个引物对组成的6套EST-SSR复合标记组合(参见《园艺学报》，2009年11期，用于白菜和大白菜品种鉴定的EST-SSR复合标记的建立)。但是有关大白菜EST-SSR引物的开发远未达到饱和。为了提高EST-SSR标记的密度和提高大白菜品种鉴定的效果，有必要开发更多的EST-SSR标记。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供大白菜EST-SSR标记引物及其在品种鉴定中的应用。大白菜EST-SSR标记引物BRE28，它由核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示的下游引物组成。大白菜EST-SSR标记引物BRE121，它由核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示的上游引 物和核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示的下游引物组成。大白菜EST-SSR标记引物BRE131，它由核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示的下游引物组成。上述大白菜EST-SSR标记引物BRE28、大白菜EST-SSR标记引物BRE121和/或大白菜EST-SSR标记引物BRE131在大白菜品种鉴定中的应用。上述应用，步骤如下(I)利用改良的CTAB法提取待鉴定样品总DNA ；(2)以步骤(I)提取的待鉴定样品总DNA为模板DNA，引物为大白菜EST-SSR标记引物BRE28、大白菜EST-SSR标记引物BRE121或大白菜EST-SSR标记引物BRE131进行PCR扩增，PCR采用20 μ L反应体系40ng 模板 DNA, I XPCR buffer (含 20mmol · L-1 MgCl 2),200 μ mol · L 1 NTPs,引物 O. I μ mol · L \IU TaqDNA 聚合酶；PCR扩增条件如下95°C 预变性 5min ;94°C变性 45s，56°C退火 45s，72°C 延伸 lmin，共计 35 个循环；72°C延伸 10min,4°C IOmin 终止反应；(3)将步骤(2) PCR扩增后的产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染显影并与标准样品聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染显影的泳带进行对照。所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳为6%聚丙烯酰胺凝胶电泳。所述步骤(3)的具体步骤如下将步骤(2) PCR扩增后的产物与上样缓冲液混匀后，取4μ I点样，进行电泳分离，电极缓冲液为IXTBE (Tris-硼酸)，在25°C、2000V恒压下电泳2h，通过银染法显影，将显影后的泳带与标准样电泳后显影的泳带进行对照。上述电泳在Sequi-Gen GT核酸电泳系统(Bio-Rad，USA)中进行。上述上样缓冲液为常用缓冲液，也可采用如下成分的缓冲液，配制过程按本领域常用技术98%的去离子甲酰胺，IOmM EDTA (pH8. O)，O. 025% 二甲苯青，O. 025%溴酚兰。改良的CTAB法、银染显影均可按现有技术进行，其他操作如无特别说明均为本领域常用技术。本发明的有益效果
为了提闻SSR标记的密度和提闻大白菜品种鉴定的效果,本发明提供了 3对新的EST-SSR引物，分别被命名为大白菜EST-SSR标记引物BRE28、大白菜EST-SSR标记引物BRE121和大白菜EST-SSR标记引物BRE131，并将它们应用于品种纯度鉴定中。利用3对EST-SSR引物对13个大白菜品种的DNA进行扩增，并利用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染检测。发现这3对EST-SSR引物的扩增产物都呈现双亲互补带型，而且带型间大小差异明显，能够很好的区分杂交种和亲本自交系、鉴别不同的品种。对同一品种内的个体间的扩增产物，其带型一致，3对EST-SSR引物用于品种纯度检测，体现品种内的一致性。
图I是本发明涉及的3对EST-SSR标记引物对18个大白菜样品的检测结果；其中泳道I、大白菜691，2、大白菜690，3、大白菜杂交种773，4、大白菜668，5、大白菜663,6、大白菜杂交种761,7、大白菜691,8、大白菜690,9、大白菜杂交种773,10、大白 菜夏白I号，11、大白菜夏白45,12、大白菜夏优2号，13、大白菜夏优5号，14、大白菜高抗2号，15、大白菜丰抗78,16、大白菜早熟5号，17、大白菜夏白I号，18、大白菜夏白45。图2是引物BRE131对8个亲本691个体、6个690个体以及I个杂交种773(691 X 690)个体DNA的扩增结果；图3是引物BRE121对10个大白菜品种夏白45个体DNA的扩增结果；图4是引物BRE28对12个大白菜夏白I号个体DNA的扩增结果。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。实施例中大白菜691 (自交系)、大白菜690 (自交系)、大白菜668 (自交系)、大白菜663 (自交系)、大白菜夏白I号、大白菜夏白45、大白菜夏优2号、大白菜夏优5号、大白菜高抗2号、大白菜丰抗78、大白菜早熟5号均为市售产品，也可购自山东省农业科学院蔬菜研究所。大白菜杂交种773为大白菜691 (父本)与大白菜690 (母本)杂交获得的一代杂交种。大白菜杂交种761为大白菜668 (父本)与大白菜663 (母本)杂交获得的一代杂交种。实施例中所用大白菜EST-SSR标记引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。实施例I.大白菜EST-SSR标记引物的开发开发引物所用的大白菜EST 序列来自 GenBank(http://www. ncbi. nlm. nih. gov),时间截止到2007年10月31日，共有大白菜(B. rapa ssp. pekinensis)EST序列147217个。本研究采用147217个大白菜EST序列开发SSR引物。对下载到的大白菜EST序列参照葛佳等中的方法进行前期处理(参见《农业生物技术学报》，2005年第04期，《大白菜表达序列标签SSR标记分析》)，包括除去EST序列中存在的载体序列5’端polyT和3’端polyA序列以及含有歧义碱基的序列，除去小于IOObp的序列。然后利用SeqMan程序(Lasergene软件包，DNAStar Inc.)对处理后的EST序列进行重叠群(contigs)构建。用 MISA 软件(http://www. pgrc. ipk-gatersleben. de/misa)在构建的重叠群中筛选SSR标记，标准参见Zhang L D, Yuan D，Yu S，Li Z, Cao Y，MiaoZ, Qian H, Tang K. Preference of simple sequence repeats in coding and non-codingregions of Arabidopsis thaliana[J]· Bioinformatics, 2004，20:1081-1086。对结果进行分析筛选，最终选取其中的3对引物用于品种鉴定分析，分别命名为大白菜EST-SSR标记引物BRE28 (上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示)、大白菜EST-SSR标记引物BRE121 (上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示)和大白菜EST-SSR标记引物BRE131 (上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示)。2.大白菜EST-SSR标记引物在品种鉴定中的应用大白菜品种鉴定的步骤如下(I)利用改良的CTAB法提取待鉴定样品总DNA ； 选用大白菜品种(系)691 (自交系)、690 (自交系)、杂交种773 (691 X690)、668(自交系)、663 (自交系)、杂交种761 (668X663)、大白菜夏白I号、夏白45、夏优2号、夏优5号、高抗2号、丰抗78、早熟5号。(2)以步骤(I)提取的待鉴定样品总DNA为模板DNA，引物为大白菜EST-SSR标记引物BRE28、BRE121和BRE131进行PCR扩增，PCR采用20 μ L反应体系:40ng 模板 DNA, I XPCR buffer (含 20mmol · L-1 MgCl2),200 μ mol · L-1 NTPs，引物 0. I μ mol · ΛIU TaqDNA 聚合酶；PCR扩增条件如下95°C 预变性 5min ;94°C变性 45s，56°C退火 45s，72°C 延伸 lmin，共计 35 个循环；72°C延伸 10min,4°C IOmin 终止反应；(3)将步骤(2) PCR扩增后的产物与上样缓冲液(98%的去离子甲酰胺IOmMEDTA (pH8. 0)，0. 025% 二甲苯青，0. 025%溴酚兰)混合均匀后，取10 μ I点样，在Sequi-GenfGT核酸电泳系统(Bio-Rad, USA)中通过6%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，电极缓冲液为IXTBE (Tris-硼酸)，在25°C、2000V恒压下电泳2h。通过银染法显影，拍照、记录结果(见附图I)。上述改良的CTAB法提取总DNA，采用如下操作进行I)向15ml离心管中预先加入5ml CTAB抽提液及0. Iml的β -巯基乙醇，混匀，65 °C预热，得抽提液；2)取Ig样品幼叶用液氮磨成粉末，转入步骤I)制得的抽提液中，摇匀；于65°〇水浴45min,每10 15分钟颠倒I次,得DNA初提液；3)向步骤2)制得的DNA初提液中加入等体积氯仿与异戊醇的混合液(二者体积比为24 : I),颠倒混勻，乳化IOmin后,IOOOOrpm室温离心IOmin,取上清液；4)向步骤3)制得的上清液中加入等体积的异丙醇和1/10 1/5体积的醋酸钠溶液(3M),颠倒混勻I 2分钟,于4°C、IOOOOrpm离心IOmin,取白色沉淀；5)用75%乙醇漂洗3次,然后用无水乙醇漂洗I次，室温干燥去除乙醇后，在65°C水浴中，用200 μ I TriS-EDTA溶解沉淀，即得总DNA溶液。上述银染法显影，采用如下操作进行I、电泳完毕后，胶板用10wt%醋酸溶液缓慢摇动并固定15分钟，然后，去离子水漂洗3次；2、将漂洗后的胶板用含有O. lwt%硝酸银和O. 15wt%甲醒的溶液染色30分钟；3、染色后，用去离子水漂洗胶板，然后，用含有3%碳酸钠和O. 15%甲醛的溶液染色3-5分钟，缓慢摇动，直到条带清晰；然后放入10%醋酸溶液固定10分钟，然后用去离子水漂洗5 10分钟，晾干，照相记录。利用本发明所述3对EST-SSR引物对13个大白菜品种的DNA进行扩增，并利用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染检测。发现这3对EST-SSR引物的扩增产物都呈现双亲互补带 型，而且带型间大小差异明显，能够很好的区分杂交种和亲本自交系。图中I 9泳道是3组亲本自交系，10 18泳道是商业杂交种。可以看出，通过特征条带完全可以区分不同的亲本自交系和杂交种。另外，我们利用大白菜EST-SSR引物BRE131对自交系690、691以及杂交种773的种子进行了鉴定，利用大白菜EST-SSR引物BRE121对大白菜夏白45进行了品种纯度鉴定，利用大白菜EST-SSR引物BRE28对夏优I号大白菜种子进行了鉴定(如图2，3，4所示)。具体操作同上述方法，先提取个体植株的DNA，然后进行EST-SSR引物扩增，再进行电泳和银染显色。结果显示，相同品种(材料)不同个体的带型一致。这些结果说明，这3对大白菜EST-SSR引物用于大白菜品种纯度检测，可以体现品种内的一致性。
权利要求
1.大白菜EST-SSR标记引物BRE131，它由核苷酸序列如SEQID NO. 5所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示的下游引物组成。
2.权利要求I所述大白菜EST-SSR标记引物BRE131在大白菜品种鉴定中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤如下 (1)利用改良的CTAB法提取待鉴定样品总DNA； (2)以步骤(I)提取的待鉴定样品总DNA为模板DNA，引物为大白菜EST-SSR标记引物BRE131进行PCR扩增，PCR采用20 μ L反应体系 40ng 模板 DNA，I XPCR buffer,200 μ mol · L-1NTPs,引物 O. I μ mol · Λ IU TaqDNA聚合酶； PCR扩增条件如下 95°C预变性5min ;94°C变性45s，56°C退火45s，72°C延伸lmin，共计35个循环；72°C延伸IOmin, 4。。IOmin终止反应； (3)将步骤(2)PCR扩增后的产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染显影并与标准样品聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染显影的泳带进行对照。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳为6%聚丙烯酰胺凝胶电泳。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)中的聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤如下将步骤(2) PCR扩增后的产物与上样缓冲液混匀后，取4μ I点样，进行电泳分离，电极缓冲液为1ΧΤΒΕ，在25°C、2000V恒压下电泳2h。
全文摘要
本发明涉及大白菜EST-SSR标记引物及其在品种鉴定中的应用，属于分子生物学技术领域。本发明提供大白菜EST-SSR标记引物BRE131的序列及上述标记引物在大白菜品种鉴定中的应用。本发明所述EST-SSR引物的扩增产物都呈现双亲互补带型，而且带型间大小差异明显，能够很好的区分杂交种和亲本自交系、鉴别不同的品种。对同一品种内的个体间的扩增产物，其带型一致。
文档编号C12N15/11GK102876671SQ20121040480
公开日2013年1月16日 申请日期2010年7月26日 优先权日2010年7月26日
发明者高建伟, 刘立锋, 周新成, 李化银, 李利斌, 张庶 申请人:山东省农业科学院蔬菜研究所