一种基于微滴式数字PCR的空肠弯曲菌重组质粒标准品定量检测方法与流程

本发明涉及重组质粒标准品量化定标方法领域，具体涉及一种基于微滴式数字PCR的空肠弯曲菌重组质粒标准品定量检测方法。

背景技术：

空肠弯曲菌是一种人畜共患病病原菌，可以引起人和动物发生多种疾病，并且是一种重要的食源性致病菌，是导致人类细菌性腹泻的主要原因之一。近年来对空肠弯曲菌的研究逐渐增多，建立了多种基因检测方法。其中实时荧光定量PCR方法的应用最广，被国内外多个权威检测机构所认可。在基因检测方法的研究中，标准品是关键因素之一。目前标准品使用较多的是细菌的稀释液和目的片段的重组质粒。细菌稀释液一般采用平板培养法计数，但培养过程往往受多种因素影响，因此平板计数所得到的细菌数量与实际值偏差较大。目的片段重组质粒一般采用分光光度法测得核酸质量，然后通过质量摩尔数公式来进行理论推算，因此计算的数值与实际有效扩增片段的数量差异较大。如果应用上述两种方法得出的标准物质来建立空肠弯曲菌的基因检测方法，则在方法研究所得到的灵敏度、重复性方面会存在不可避免的偏差。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种准确性高、灵敏度高、重复性好、适用性广的、基于微滴式数字PCR的空肠弯曲菌重组质粒标准品定量检测方法。

本发明的目的采用如下技术方案实现。

一种基于微滴式数字PCR的空肠弯曲菌重组质粒标准品定量检测方法，包括如下步骤：

(1)配制含有ddPCR^TMSupermix for Probes、引物、探针和模板的反应体系；

(2)采用微滴发生器将反应体系进行微滴化处理；

(3)将微滴化处理后的反应体系转移至PCR仪上，进行PCR扩增反应；

(4)使用微滴读取仪读取结果数据，计算重组质粒标准品浓度。

优选的技术方案中，所述反应体系含有ddPCR^TMSupermix for Probes 10μL、上下游引物各0.5μL、探针0.25μL、去离子水3.75μL、模板5μL。

优选的技术方案中，PCR扩增反应条件如下：95℃变性5min；94℃变性30s、60℃退火40s，共40个循环；98℃保持10min。

优选的技术方案中，PCR扩增反应中，升温速度为1-5℃/秒，降温速度为1-5℃/秒。

优选的技术方案中，微滴发生器和微滴读取仪来自Bio-Rad公司QX200^TM Droplet Digital^TM PCR系统。

优选的技术方案中，所述重组载体是将空肠弯曲菌完整的或部分hipO基因插入pCzn1载体后得到的；或者所述重组载体是将空肠弯曲菌完整的或部分hipO基因插入pCzn1载体、经酶切线性化后得到的。

优选的技术方案中，所述引物包括C5-F和C5-R，所述C5-F的序列如SEQ ID NO:2所示，所述C5-R的序列如SEQ ID NO:3所示；所述探针的序列如SEQ ID NO:4所示，5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

优选的技术方案中，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为BHQ。

本发明提供的定量检测方法，具有准确性高、灵敏度高、重复性好、适用性广的特点，表现在：

(1)灵敏度高：ddPCR方法检测空肠弯曲菌重组质粒标准品的灵敏度可达到3.2copy/μL。

(2)重复性好：使用ddPCR方法检测空肠弯曲菌重组质粒标准品，其三个连续稀释度的检测结果具有较好的10倍比例关系，且复孔之间的检测结果值的相对标准偏差(RSD)较小。因此，使用ddPCR方法检测空肠弯曲菌重组质粒标准品的重复性较好。

(3)适用性广：利用ddPCR方法分别检测较大目的片段的重组质粒、较小目的片段的重组质粒和经Xba I酶切后的大片段重组质粒标准品，灵敏度、重复性都很好。因此ddPCR方法可用来检测多种类型的重组质粒标准品，适用性广。

附图说明

图1是ddPCR方法检测重组质粒A标准品的结果图，横坐标代表微滴数，单位：个，纵坐标代表荧光强度。

图2是ddPCR方法检测重组质粒C的结果图，横坐标代表微滴数，单位：个，纵坐标代表荧光强度。

图3是ddPCR方法检测重组质粒B的结果图，横坐标代表微滴数，单位：个，纵坐标代表荧光强度。

具体实施方式

本发明中使用Bio-Rad公司QX200^TM Droplet Digital^TM PCR系统，该系统包括微滴发生器、封膜仪、微滴读取仪及QuantaSoft分析软件。

实施例1构建空肠弯曲菌重组质粒标准品

重组质粒A：扩增空肠弯曲菌的HipO基因(1152bp，序列如SEQ ID NO：1所示)，将该片段亚克隆到载体pCzn1(购自钟鼎生物)的Nde I和Xba I位点之间，获得含有目的基因的重组质粒pCzn1-HipO，记为重组质粒A。

重组质粒B：将重组质粒A采用Xba I在37℃消化2h，进行酶切线性化。酶切体系见表1。

表1质粒酶切体系

其中，10×M buffer和Xba I购自Takara。BSA是牛血清白蛋白。

重组质粒C：扩增目的片段：HipO基因第524～633位核苷酸片段。将该目的片段亚克隆到载体pCzn1的Nde I和Xba I位点之间，获得重组质粒C。

实施例2使用ddPCR方法定量检测重组质粒标准品的灵敏度

利用微滴式数字PCR(ddPCR)方法定量检测重组质粒B标准品(实施例1方法获得)，将该标准品做10倍系列稀释。

1.选择4个连续稀释度(分别为10^-3、10^-4、10^-5、10^-6)，每个稀释度做3个复孔；

2.配制ddPCR反应体系：ddPCR反应体系包括：ddPCR^TMSupermix for Probes(Bio-Rad公司，产品编号1863010)10μL、上下游引物各0.5μL、探针0.25μL、去离子水3.75μL、模板(重组质粒B标准品)5μL，总体积20μL。其中上下游引物的浓度均为10μM，探针的浓度为10μM。上游引物为C5-F，C5-F的序列(SEQ ID NO:2)如下:5’-CGGATAGTTATAGTATTGAAGTTATTGG-3’。下游引物为C5-R，C5-R的序列(SEQ ID NO:3)如下:5’-GAAGCAGCATAAATAGGATCTTTTG-3’。探针的核苷酸序列(SEQ ID NO:4)如下:5’-TTCTGGAGCACTTCCATGACCACC-3’，探针的5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ。

阴性对照(NTC)中以去离子水替代模板。

3.生成微滴：将配制好的反应体系，放置微滴发生器中自动生成微滴。

4.PCR扩增：将微滴化处理后的反应体系转移至PCR仪上，进行PCR扩增反应。PCR扩增反应条件如下：95℃变性5min；94℃变性30s、60℃退火40s，共40个循环；98℃保持10min。PCR扩增反应中，升温速度为2℃/s，降温速度为2℃/s。

5.结果读取与分析：使用微滴读取仪读取结果数据，QuantaSoft分析软件分析数据，计算得到不同稀释度重组质粒的浓度，结果见表2。

表2 ddPCR方法检测空肠弯曲菌重组质粒标准品浓度结果

注：表2中“KONG”表示代表空肠弯曲菌，“No call”表示无计数结果。

根据实验结果可知，ddPCR方法检测空肠弯曲菌重组质粒标准品的灵敏度可达到3.2copy/μL。

实施例3使用ddPCR方法检测重组质粒标准品的重复性

利用ddPCR方法检测空肠弯曲菌重组质粒C标准品(实施例1方法获得)，将标准品做10倍系列稀释。

1.选择3个连续稀释度(分别为10^-5、10^-6、10^-7)，每个稀释度做3个复孔；

2.配制ddPCR反应体系：ddPCR反应体系包括：ddPCR^TMSupermix for Probes(Bio-Rad公司1863010)10μL、上下游引物各0.5μL、探针0.25μL、去离子水3.75μL、模板(重组质粒C标准品)5μL，总体积20μL。其中上下游引物的浓度均为10μM，探针的浓度为10μM。上游引物为C5-F，C5-F的序列(SEQ ID NO:2)如下:5’-CGGATAGTTATAGTATTGAAGTTATTGG-3’。下游引物为C5-R，C5-R的序列(SEQ ID NO:3)如下:5’-GAAGCAGCATAAATAGGATCTTTTG-3’。探针的核苷酸序列(SEQ ID NO:4)如下:5’-TTCTGGAGCACTTCCATGACCACC-3’，探针的5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ。阴性对照(NTC)中以去离子水替代模板。

3.生成微滴：将配制好的反应体系，放置微滴发生器中自动生成微滴。

4.PCR扩增：将微滴化处理后的反应体系转移至PCR仪上，进行扩增反应。PCR扩增反应条件如下：95℃变性5min；94℃变性30s、60℃退火40s，40个循环；98℃保持10min。PCR扩增反应中，升温速度为2℃/s，降温速度为2℃/s。

5.结果读取与分析：使用微滴读取仪读取结果数据，QuantaSoft分析数据，计算得到不同稀释度重组质粒的浓度，结果见表3。

表3 ddPCR方法检测空肠弯曲菌重组质粒标准品浓度结果

注：表3中“KONG”表示空肠弯曲菌，“No call”表示无计数结果。

根据实验结果可知，使用ddPCR方法检测空肠弯曲菌重组质粒标准品，其三个连续稀释度的浓度结果具有较好的10倍比例关系，且复孔之间的浓度结果值的相对标准偏差(RSD)较小(分别为：3.48％、2.86％、3.61％)。因此，使用ddPCR方法检测空肠弯曲菌重组质粒标准品浓度的重复性较好。

实施例4使用ddPCR方法检测重组质粒标准品的适用性

利用ddPCR方法分别检测空肠弯曲菌重组质粒A、重组质粒B和重组质粒C(实施例1方法获得)，将各标准品做10倍系列稀释。

1.选择3个连续稀释度，每个稀释度做3个复孔；

2.配制ddPCR反应体系：ddPCR反应体系包括：ddPCR^TMSupermix for Probes(Bio-Rad公司，产品编号1863010)10μL、上下游引物各0.5μL、探针0.25μL、去离子水3.75μL、模板5μL，总体积20μL。其中上下游引物的浓度均为10μM，探针的浓度为10μM。上游引物为C5-F，C5-F的序列(SEQ ID NO:2)如下：5’-CGGATAGTTATAGTATTGAAGTTATTGG-3’。下游引物为C5-R，C5-R的序列(SEQ ID NO:3)如下:5’-GAAGCAGCATAAATAGGATCTTTTG-3’。探针的核苷酸序列(SEQ ID NO:4)如下:5’-TTCTGGAGCACTTCCATGACCACC-3’，探针的5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ。阴性对照(NTC)中以去离子水替代模板。

3.生成微滴：将配制好的反应体系，放置微滴发生器中自动生成微滴。

4.PCR扩增：将微滴化处理后的反应体系转移至PCR仪上，进行扩增反应。PCR扩增反应条件如下：95℃变性5min；94℃变性30s、60℃退火40s，40个循环；98℃保持10min。PCR扩增反应中，升温速度为2℃/s，降温速度为2℃/s。

5.结果读取与分析：使用微滴读取仪读取结果数据，QuantaSoft分析数据，计算得到不同稀释度重组质粒的浓度，结果见表4。其中ddPCR方法检测重组质粒A的结果如图1-3。

表4 ddPCR方法检测3种重组质粒标准品的浓度结果

注：表4中“KONG”表示空肠弯曲菌，“No call”表示无计数结果。

由结果看出，利用ddPCR方法分别检测空肠弯曲菌重组质粒A、重组质粒B和重组质粒C的准确性高、灵敏度、重复性都较好，说明ddPCR方法可用来检测多种类型的重组质粒标准品，适用性较广。

SEQUENCE LISTING

<110> 张家港出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心

南京晓庄学院

<120> 一种基于微滴式数字PCR的空肠弯曲菌重组质粒标准品定量检测方法

<130> 20180316

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1152

<212> DNA

<213> 空肠弯曲菌

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atgaatttaa ttccagaaat actagactta caaggcgaat ttgaaaaaat tcgtcatcaa 60

attcatgaaa atcctgagct tggttttgat gaattatata ctgcaaaatt agtggcacaa 120

aaattaaaag aatttggtta tgaggtttat gaagaaatag gaaaaacagg cgttgtgggg 180

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<212> DNA

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<223> 探针

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