本发明属于微生物发酵生产多聚物领域，涉及一种利用极端嗜盐古菌H.mediterranei发酵生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)和胞外聚合物(EPS)过程中进行产物调控的技术方法。
背景技术：
PHA是一种由微生物胞内合成的一类聚合物的总称。由于其具有石油衍生塑料相似的性质，且具有生物相容性及生物可降解性等特点，成为了石油衍生塑料的理想替代品。除了在包装领域有广泛应用外，PHA还可用于日常用品及生物医学材料等领域。
极端嗜盐古菌H.mediterranei具有同时合成PHA和EPS的能力。然而，同时合成EPS与PHA导致碳源利用效率低，不利于工业生产中有目的地合成某一特定聚合物。例如，专利申请号201410324698.2提出H.mediterranei在开放条件下连续处理糖蜜酒精废水生产PHA的方法，但是在PHA生产过程中产生大量EPS，导致PHA的合成量低，大量分泌的EPS成为无效的副产物。专利申请号201210181052.4为了提高PHA的合成效率，利用基因工程敲掉胞外多糖合成基因，构建EPS合成缺陷株工程菌成功地实现了控制EPS合成，倾向性地合成PHA的目标。然而重组菌株的成本高，操作复杂，不易于工程实现。
本发明所提及的方法是不进行基因工程改变的条件下实现H.mediterranei纯菌株倾向性合成PHA，提高PHA产量的技术方法。该方法工艺方法简单，染菌率较低，实现方便，易于工程操作。
技术实现要素：
本发明的目的是针对H.mediterranei同时合成PHA和EPS的特性，通过对运行工艺的调控抑制EPS产量，提高PHA产量。
调控野生菌株极H.mediterranei PHA和EPS产量，其特征在于：开放环境下，通过调节底物中NaCl的浓度，抑制EPS产量，提高PHA产量的方法，即利用控制发酵液中的NaCl的浓度实现对PHA和EPS产量的调控。
控制NaCl盐浓度在200-250g/L时定向促进PHA的合成抑制EPS的产量。
主要过程包括如下：
(1)将野生菌株H.mediterranei按照公知的方法进行菌种活化及富集培养；
(2)按公知成分配备生产PHA的发酵用底物，将发酵用底物中的NaCl的浓度控制在200-250g/L，连续发酵直至PHA积累量达到最大；
(3)停止发酵，收获发酵物，提取PHA。
本发明具有以下优点：
(1)本发明中使用的极端嗜盐古菌H.mediterranei，优点在于：其高浓度的氯化钠生长环境下，抑制了其他细菌的生长，可以简化灭菌过程降低灭菌成本。
(2)本发明中采用控制底物中NaCl浓度的方法不改变原有发酵方式，运行成本低，调控方法，能很好的控制发酵成本。
附图说明
图1为抑制嗜盐古菌Haloferax mediterranei EPS产量提高PHA产量的方法的实现流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明，但本发明并不限于以下实施例。
本发明将野生菌株H.mediterranei按照公知的方法进行菌种活化及富集培养的过程中采用的种子培养基的量在后面的发酵过程中相对发酵用培养基可以忽略不计；发酵用培养基中的氯化钠浓度基本为底物的浓度。
对比例1
在实施例中，所用菌种为Haloferax mediterranei，菌种编号ATCC 33500。
该菌株的种子培养基包含：每1L去离子水中含蛋白胨7.5g，酵母提取物10g，柠檬酸钠3g，硫酸镁20g，氯化钾2g，亚铁离子0.01g，氯化钠200g。并调节pH至7.2。
发酵用培养基配方为每1L蒸馏水中氯化钠75g，葡萄糖10g，氯化铵0.48g，六水合氯化镁13g，二水合氯化钙0.69g，七水合硫酸镁20g，氯化钾4g，碳酸氢钠0.25g，溴化钠0.5g，磷酸二氢钾0.439g，微量元素溶液1ml(微量元素溶液按公知方法配备，每100ml含七水合硫酸锌0.1g，四水合氯化镁0.03g，硼酸0.3g，六水合氯化钴0.2g，二水合氯化铜0.01g，六水合氯化镍0.02g，一水合钼酸钠0.03g)，pH值为7.2。
具体实施步骤如下：
(1)将H.mediterranei按照公知的方法进行活化和富集培养；
(2)配备发酵用培养基，向盛有菌株及种子培养基的发酵罐中加入发酵用培养基，种子培养基与发酵用培养基的投加比例为1:20，初始混合液中细胞干重为0.73g/l，连续曝气发酵72h，维持温度37℃，pH值为6.5-7.4，曝气量为2g/l；
(3)每间隔4-12h对发酵培养基进行取样，提取并检测PHA和EPS.
(4)该发酵中生产的PHA为共聚物PHBV，其产量占细胞干重的46.7％，碳源转化率为28.9％；EPS的产量为371.4mg EPS/g CDW,碳源转化率为22.6％.
对比例2
在实施例中，所用菌种为Haloferax mediterranei，菌种编号ATCC 33500。
该菌株的种子培养基包含：每1L去离子水中含蛋白胨7.5g，酵母提取物10g，柠檬酸钠3g，硫酸镁20g，氯化钾2g，亚铁离子0.01g，氯化钠200g。并调节pH至7.2。
发酵用培养基配方为每1L蒸馏水中氯化钠150g，葡萄糖10g，氯化铵0.48g，六水合氯化镁13g，二水合氯化钙0.69g，七水合硫酸镁20g，氯化钾4g，碳酸氢钠0.25g，溴化钠0.5g，磷酸二氢钾0.439g，微量元素溶液1ml(微量元素溶液按公知方法配备，微量元素溶液每100ml含七水合硫酸锌0.1g，四水合氯化镁0.03g，硼酸0.3g，六水合氯化钴0.2g，二水合氯化铜0.01g，六水合氯化镍0.02g，一水合钼酸钠0.03g)，pH值为7.2。
具体实施步骤如下：
(1)将H.mediterranei按照公知的方法进行活化和富集培养；
(2)配备发酵用培养基，向盛有菌株及种子培养基的发酵罐中加入发酵用培养基,种子培养基与发酵用培养基的投加比例为1:20，初始混合液中细胞干重为0.73g/l，连续曝气发酵72h，维持温度37℃，pH值为6.5-7.4，曝气量为2g/l；
(3)每间隔4-12h对发酵培养基进行取样，提取并检测PHA和EPS.
(4)该发酵中生产的PHA为共聚物PHBV，其产量占细胞干重的57.7％，碳源转化率为36.8％；EPS的产量为345.6mg EPS/g CDW,碳源转化率为18.2％.
实施例1
在实施例中，所用菌种为Haloferax mediterranei，菌种编号ATCC 33500。
该菌株的种子培养基包含：每1L去离子水中含蛋白胨7.5g，酵母提取物10g，柠檬酸钠3g，硫酸镁20g，氯化钾2g，亚铁离子0.01g，氯化钠200g。并调节pH至7.2。
发酵用培养基配方为每1L蒸馏水中氯化钠200g，葡萄糖10g，氯化铵0.48g，六水合氯化镁13g，二水合氯化钙0.69g，七水合硫酸镁20g，氯化钾4g，碳酸氢钠0.25g，溴化钠0.5g，磷酸二氢钾0.439g，微量元素溶液1ml(微量元素溶液按公知方法配备，微量元素溶液每100ml含七水合硫酸锌0.1g，四水合氯化镁0.03g，硼酸0.3g，六水合氯化钴0.2g，二水合氯化铜0.01g，六水合氯化镍0.02g，一水合钼酸钠0.03g)，pH值为7.2。
具体实施步骤如下：
(1)将H.mediterranei按照公知的方法进行活化和富集培养；
(2)配备发酵用培养基，向盛有菌株及种子培养基的发酵罐中加入发酵用培养基，种子培养基与发酵用培养基的投加体积比例为1:20，初始混合液中细胞干重为0.73g/l，连续曝气发酵72h，维持温度37℃，pH值为6.5-7.4，曝气量为2g/l；
(3)每间隔4-12h对发酵培养基进行取样，提取并检测PHA和EPS.
(4)该发酵中生产的PHA为共聚物PHBV，其产量占细胞干重的61.1％，碳源转化率为39.7％；EPS的产量为313.93mg EPS/g CDW,碳源转化率为16.0％.
实施例2
在实施例中，所用菌种为Haloferax mediterranei，菌种编号ATCC 33500。
该菌株的种子培养基包含：每1L去离子水中含蛋白胨7.5g，酵母提取物10g，柠檬酸钠3g，硫酸镁20g，氯化钾2g，亚铁离子0.01g，氯化钠200g。并调节pH至7.2。
发酵用培养基配方为每1L蒸馏水中氯化钠250g，葡萄糖10g，氯化铵0.48g，六水合氯化镁13g，二水合氯化钙0.69g，七水合硫酸镁20g，氯化钾4g，碳酸氢钠0.25g，溴化钠0.5g，磷酸二氢钾0.439g，微量元素溶液1ml(微量元素溶液按公知方法配备，微量元素溶液每100ml含七水合硫酸锌0.1g，四水合氯化镁0.03g，硼酸0.3g，六水合氯化钴0.2g，二水合氯化铜0.01g，六水合氯化镍0.02g，一水合钼酸钠0.03g)，pH值为7.2。
具体实施步骤如下：
(1)将H.mediterranei按照公知的方法进行活化和富集培养；
(2)配备发酵用培养基，向盛有菌株及种子培养基的发酵罐中加入发酵用培养基，种子培养基与发酵用培养基的投加比例为1:20，初始混合液中细胞干重为0.73g/l，连续曝气发酵72h，维持温度37℃，pH值为6.5-7.4，曝气量为2g/l；
(3)每间隔4-12h对发酵培养基进行取样，提取并检测PHA和EPS.
(4)该发酵中生产的PHA为共聚物PHBV，其产量占细胞干重的71.1％，碳源转化率为42.2％；EPS的产量为319.74mg EPS/g CDW,碳源转化率为15.1％。