银纳米线阵列制备方法及其在干细胞质粒转化中的应用与流程

本发明涉及银纳米线阵列的应用，特别是银纳米线阵列在制备哺乳动物细胞和各类哺乳动物干细胞质粒DNA的输送装置中的应用。

背景技术：

将质粒转入哺乳动物细胞是进行基因表达分析和细胞工程的一个重要步骤。目前将质粒导入哺乳动物细胞常用的方法主要分为两大类：一类是电转化方法。该方法采用电穿孔仪器，利用脉冲场电流，将质粒通过细胞膜上的小孔瞬时导入细胞。细胞电转仪的厂商主要有美国伯乐(BioRad)公司，美国BTX公司，美国Invitrogen公司和德国Eppendorf公司等。电转方法不但需要严格控制条件，如电转时的电压强度、电流强度和电击时间等，而且细胞被电击之后存活率大大降低，会激发细胞内部分信号转导通路，间接影响细胞的表观遗传特性。

另一类是化学物质介导的转化方法，主要有(1)阳离子脂质体法。该方法采用带正电的阳离子脂质体与带负电的核酸形成复合物，结合到细胞膜上，通过细胞是内吞作用而被进入细胞。代表性的有美国invitrogen公司，瑞士Roche公司，美国Promega公司的相关产品。但阳离子脂质体遇到血清时，转染效率就大为降低，因此转染前后需要更换培养基，并且需要优化脂质体和质粒的合理比例，以及转化的孵育时间。该物质对细胞具有一定毒性，需要及时移除。(2)阳离子聚合物。阳离子和质粒DNA结合，被细胞吞噬而进入细胞内，具有较好的转染效率，主要厂商有德国Qiagen公司，美国Sigma-Aldrich公司等，但是需要适当调节聚合物和质粒的混合比例，细胞孵育时间等，才能获得最佳效果。(3)二乙胺基乙基(DEAE)-葡聚糖法，将质粒DNA与DEAE-葡聚糖混合后，和细胞共孵育。细胞的转染效率还可以接受，但是不组织和物种来源的细胞之间转化率差异较大。(4)磷酸钙法。将质粒DNA与磷酸钙载体混合，通过磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞。不同组织和物种来源的细胞转染效率不同，而且总体效率不高。总的来说，这些化学物质介导的转化方法相对于电击法温和，但需要解决它们的细胞毒性，提高稳定的转化效率，简化的操作程序，便于大规模应用。

近年来，随着纳米科学的发展，作为一维纳米材料的纳米线、纳米管等因其优异的光学性能、电学性能及力学性能等特性，应用于生物医学将会解决很多以往的难题。现代生物技术的快速发展，纳米线在生物医学中的应用研究也逐渐得到更多的关注。本发明提出一种可以用于哺乳类细胞物质输送的纳米线阵列装置。纳米线在直径为纳米尺度的情况下，犹如注射器进入人体，由纳米线介导质粒DNA大分子，容易进入细胞的内部进行转化。运用纳米线阵列可以使质粒进入到各种细胞中(含各类哺乳动物干细胞)，转化效率非常高，不需要进行前期的化学包装或处理，不需要调节各种实验条件，可以同时进行多个样本。短期的3～4天培养，对细胞的存活力基本没有影响。

技术实现要素：

本发明的一个目的在于提供一种银纳米线阵列制备方法。

本发明的另一个目的在于提供一种干细胞质粒转化装置，提高干细胞转化的效率。

本发明的又一个目的在于提供一种哺乳动物细胞质粒转化装置，提高哺乳动物细胞转化的效率。

本发明提供的一种银纳米线阵列制备方法，包括如下步骤：

以多孔氧化铝板为阴极，碳棒为阳极，AgNO₃和H₂SO₄混合制成电解液，交流电压12伏，室温下电沉积29分钟，沉积过程中磁子对溶液不停进行搅拌，以免溶液局部过热，之后将多孔氧化铝模板用去离子水冲洗干净，去除模板上的H₂SO₄溶液。

将沉积着银纳米线的多孔氧化铝模板放入0.2摩尔/升的氢氧化钠溶液中，溶解铝基，制备出有基底的银纳米线阵列。

本发明提供的一种干细胞质粒转化装置，包括纳米线阵列制成的圆盘片。

常用的圆盘片为直径6mm～150mm，或者根据需要制备成更大直径，不同形状的模板。高压灭菌，烘干。

根据需要选择不同规格的纳米线阵列盘片放入常用的96，48，24，12，6孔细胞培养板，也可以放入常用的直径35mm，60mm，90mm和150mm等细胞培养皿中，或选择其它合适的规格，放入细胞培养管、细胞培养瓶中。纳米线阵列独立放入细胞培养容器中，或与容器内表面紧密结合。这种带有纳米线阵列的细胞培养板、培养皿、细胞培养管和细胞培养瓶就是一种有效的哺乳动物细胞质粒转化的纳米线阵列装置。

接触细胞的一面为纳米线阵列，将干细胞和其它哺乳类动物细胞和质粒DNA加入该装置中，即可获得高效的转化率。

本发明技术方案实现的有益效果：

本发明中细胞和质粒比例不需要严格控制，哺乳动物细胞与质粒DNA共同孵育时间一般2天～3天基本达到80％～90％的转化率。在细胞生长缓慢的情况下，通过延长孵育时间的方式，有助于转化率的提高，尤其是在干细胞培养时需要结合实际情况充分考虑，干细胞与质粒DNA共同孵育时间一般3天～5天。

本发明提供的装置可以一次转化不限量的细胞，操作简单，符合高通量试验和生产要求。同时转化过程不涉及脂质体和阳离子聚合物，以及电场对靶细胞的冲击，降低了对靶细胞表观遗传的影响，也解决了干细胞转化效率低的问题，可以安全用于体外转化。

附图说明

图1为放置银纳米线阵列圆盘片的35mm细胞培养皿；其中：1标识细胞培养皿，2标识银纳米线阵列圆片；

图2为放置银纳米线阵列圆盘片的6孔细胞培养板；其中：2标识银纳米线阵列圆片，3标识6孔细胞培养板。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

实施例1

以多孔氧化铝板为阴极，碳棒为阳极，H₂SO₄/AgNO₃混合溶液为电解液，交流电压12伏左右，室温下电沉积29分钟，沉积过程中磁子对溶液不停进行搅拌，以免溶液局部过热，之后将多孔氧化铝模板用去离子水冲洗干净，去除模板上的H₂SO₄溶液。

将沉积有银纳米线的多孔氧化铝模板放入0.2摩尔/升的氢氧化钠溶液中，将铝基溶解，制备出有基底的银纳米线阵列。

实施例2

将银纳米线阵列冲成直径33mm圆盘片并高压灭菌圆盘并高压灭菌，放入直径35mm的细胞培养皿中(图1)，制备成纳米线阵列输送装置。将含有7721肝癌细胞的DMEM培养基加入到该装置中，滴加绿色荧光蛋白的表达质粒。细胞经过3天培养后，在倒置荧光显微镜检测下，90％的细胞有绿色荧光产生，这表明含有绿色荧光蛋白的表达质粒已经输送进细胞内，并且具有生物活性表达成功。细胞的存活率也维持在90％。

实施例3

将银纳米线阵列冲成32mm圆盘片，放入常用的6孔细胞培养培养板中，制备成纳米线阵列输送装置(参见图2)。将2ml含有小鼠神经干细胞C17.2的DMEM培养基(10％胎牛血清(GIBICO)，5％马血清(GIBICO)加入到该装置中，滴加绿色荧光蛋白的表达质粒pEGFP-C1。神经干细胞经过3天～5天培养后，在倒置荧光显微镜检测下，90％的活细胞有绿色荧光产生，这表明含有绿色荧光蛋白的表达质粒已经输送进细胞内，并且具有生物活性表达成功。神经干细胞C17.2的存活率也维持在80％～90％。