本发明属于生物工程领域，具体涉及一种富含芪类化合物食药真菌发酵产物的制备方法。
背景技术：
桑黄(Phellinus igniarius)属担子菌亚门，层孔菌纲，锈革孔菌科，针层孔菌属。桑黄菌提取物在抑制癌细胞转移和防止癌症手术后复发等的临床应用中具有显著效果，是目前国际公认的生物治癌药剂中有效率最高的一种食药真菌。
由于受生理状态的特殊性和复杂性以及外部环境的制约，造成桑黄在自然界中形成子实体稀少，特别是形成可用子实体需要多年。而且人工栽培极其困难，培养条件苛刻，且生长周期长达3-4年，难以满足日益膨胀的市场需要。采用桑黄液体发酵的方法生产桑黄药用活性成分因为具有生产周期短、节约劳动力以及受外部环境影响小等优点被认为是一种有效的方法。目前，国内外对桑黄菌丝体培养生产活性药用成分研究和工艺应用主要集中在发酵条件及产物提取分离等层面上，整体发酵水平不高。
芪类化合物是具有1,2-二苯乙烯骨架的单体及其低聚体的总称。芪类化合物及其低聚物由于化学结构的复杂性和多样的生物活性，正受到生物界和化学界越来越多的重视。芪类化合物既存在于首乌、虎杖、大黄、藜芦等中草药中，也存在于葡萄、花生、桑葚等食用植物中，具有很多生理及诸多生理活性(赵艳敏,郭燕,尚冀宁.芪类化合物的分布和生理活性[J].化工科技,2015,23(1):77-80.)。
近年来，报道的芪类化合物有白藜芦醇、白皮杉醇、虎杖苷等。芪类化合物的生理活性，除早期发现的抗菌活性外，近年来又发现一些芪类化合物有抗肿瘤作用、杀虫作用、抗病毒作用、抗炎作用、抗老年痴呆、扩张冠状血管及降压作用、抗变态反应、保护肝细胞和降血脂等多种生理活性。芪类化合物属于植物的应激产物，一般在植物中含量普遍较低，目前芪类化合物多从植物中获得，但单纯依靠从植物中获得芪类化合物将耗费大量的植物资源，成本高且不环保。利用桑黄等食药用菌，制备富含白藜芦醇、白皮杉醇等芪类化合物的发酵产物的技术方法还未见报道。
冷激蛋白(cold shock domain proteins，CSPs)是广泛存在于生物体中的一种应激蛋白。冷激蛋白在细菌、植物与动物中均有发现，是一类高度保守的核酸结合蛋白，其通过RNA分子伴侣活性参与转录、翻译、生长发育及逆境胁迫应答等细胞生理活动(Chaikam V,Karlson DT(2010),Comparison of structure,function and regulation of plant cold shock domain proteins to bacterial and animal cold shock domain proteins.BMB Rep,43(1):1-8.)。冷激蛋白的其它用途还暂未见报道，有待进行一些应用性的研究。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种富含芪类化合物食药真菌发酵产物的制备方法，该方法操作简单，转化率高，绿色环保，为得到富含芪类化合物的产物提供了新的途径。
本发明发现冷激蛋白有利于食药真菌发酵过程中芪类化合物的生物合成。本发明利用花生、桑葚果、葡萄、首乌、大黄等植物中含有少量的白藜芦醇，结合芪类化合物合成代谢途径的特点，经桑黄固体发酵和液体发酵工艺，并在特定的发酵阶段添加冷激蛋白，能有效增加生物合成抗氧化、抗肿瘤等活性更强的维尼非林、紫檀芪等多种聚合衍生物芪类化合物的含量。
本发明采用的技术方案是：
一种富含芪类化合物食药真菌发酵产物的制备方法，包括步骤：
(1)桑黄种子液的制备：将活化后的桑黄菌种接种于液体种子培养基中培养，得到桑黄种子液；
(2)固体发酵培养：将步骤(1)中桑黄种子液按占固体培养基体积8％-20％的用量接入添加有外源物的固体培养基中，在15℃-28℃培养3天-35天后，将培养产物干燥、粉碎后得外源物固体发酵培养物；所述外源物选用花生、桑葚果、葡萄、首乌、大黄中的一种或者两种以上；
(3)液体发酵培养：将步骤(1)中桑黄种子液按占液体发酵培养基体积2％-15％的量接种于添加有外源物固体发酵培养物的液体发酵培养基中，在22℃-28℃下培养1天-8天后，加入冷激蛋白，将温度调整为15℃-25℃，继续培养1天-10天后，终止发酵，得到富含芪类化合物的桑黄发酵产物。
所述的桑黄菌种可采用任意一种桑黄菌种，可采用市售产品。例如桑黄(Phellinus linteus)ACCC51181菌种，来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心。
为了达到更好的发明效果，进行以下优选：
步骤(1)中，所述活化后的桑黄菌种在液体种子培养基中培养的温度为自然环境温度，优选为20℃-30℃。一般1L液体种子培养基中接入1cm2-4cm2大小活化后的桑黄菌种菌块。
所述活化后的桑黄菌种接种于液体种子培养基中培养的时间一般为2天-8天，得到桑黄种子液。
桑黄菌种的活化方法为本领域常规的菌种活化方法，一般包括：将斜面保藏的桑黄菌种接种到PDA平板培养基上，在22℃-30℃活化培养3天-10天，得到活化后的桑黄菌种。
所述PDA平板培养基和液体种子培养基均采用本领域种子培养常用的培养基，可采用市售产品。进一步优选，所述的PDA平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂15g-20g，用水定容至1000mL。进一步优选，所述的液体种子培养基：葡萄糖5g-20g、酵母粉4g、蛋白胨3g、KH2PO4 1g和MgSO4 0.5g，用水定容至1000mL。
步骤(2)中，所述添加有外源物的固体培养基由外源物加入固体培养基中得到，每升固体培养基中外源物的添加量为2g-20g。
所述固体培养基可采用本领域固体发酵培养常用的培养基，优选由以下质量百分比的组分组成：酵母粉0.4％-1.0％、蛋白胨0.2％-0.8％、K2HPO4 0.1％-0.25％、MgSO40.05％-0.15％和余量的水。
所述花生、桑葚果、葡萄、首乌、大黄可预先破碎成小块、小颗粒状、粉末状或者糊状等状态之后再加入固体培养基中，发酵效果更好。
步骤(3)中，加入冷激蛋白步骤之前的培养温度高于加入冷激蛋白步骤之后的培养温度，效果更好。
步骤(3)中，所述添加有外源物固体发酵培养物的液体发酵培养基由外源物固体发酵培养物加入液体发酵培养基中得到，每升液体发酵培养基中外源物固体发酵培养物的添加量为0.5g-10g。
所述冷激蛋白的使用量优选：每毫升液体发酵培养基中冷激蛋白的添加量为0.3mg-5mg。
所述冷激蛋白的来源广泛，均可实现桑黄发酵中芪类化合物的有效生成、提高桑黄发酵产物中芪类化合物的含量，来源可为细菌、植物中的一种或两种；例如来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的冷激蛋白、来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的冷激蛋白、来源于嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的冷激蛋白等中的一种或者两种以上，即从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中分离出的冷激蛋白、从大肠杆菌(Escherichia coli)中分离出的冷激蛋白、从嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)中分离出的冷激蛋白等中的一种或者两种以上。
所述冷激蛋白采用从细菌或者植物中分离得到的冷激蛋白，可以选用市售产品，也可以采用现有方法制备，如来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的冷激蛋白，可采用以下制备方法制备，包括：将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)或者嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)从37℃降到15℃培养1min-20min，将菌体匀浆后加入木瓜蛋白酶，在40℃-50℃酶解至少1h，3℃-5℃条件下离心收集上清液；上清液采用截留分子质量为2kD-5kD膜超滤，截留液调pH至5.0，过夜，离心所得上清液干燥得到蛋白样品；将蛋白样品配成溶液，上样于葡聚糖凝胶过滤柱(例如Sephadex G-25)，用Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液洗脱，流速0.5mL/min，自动收集洗脱液并于紫外280nm检测，收集280nm有吸收的组分，干燥得到冷激蛋白。所述木瓜蛋白酶的加入量优选为菌体质量的1％-3％。所述Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液的浓度为0.01mol/L。所述干燥选用真空冷冻干燥。
所述液体发酵培养基可采用本领域液体发酵培养常用的培养基，优选液体发酵培养基的组成为：葡萄糖18g、蛋白胨6g、牛肉浸膏2g、KH2PO4 1.2g和MgSO4 0.75g，用水定容至1000mL。
本发明所用的培养基均需灭菌后使用，灭菌的条件采用本领域的常规条件，例如可在120℃-125℃下灭菌20min-30min。
本发明，所述富含芪类化合物的桑黄发酵产物经过后续的分离处理后即可测定芪类化合物的含量。所述的分离处理为本领域常规的分离方法，例如离心或者过滤等分离方法。
本发明中所述芪类化合物包括白藜芦醇、白皮杉醇、虎杖苷、维尼非林、紫檀芪等一种或多种聚合衍生物。
花生(Arachis hypogaea Linn.)，是蔷薇目豆科合萌族落花生属一年生草本植物花生的果实，是我国产量丰富、食用广泛的一种坚果，又称：落花生，长生果，泥豆，番豆，地豆等。本发明花生采用去掉花生壳的花生仁。
桑葚果(Mulberry)，是桑科落叶乔木植物桑(Morus alba)的干燥果穗。
葡萄为葡萄科葡萄属木质藤本植物葡萄(Vitis vinifera L.)的果实。
首乌又名何首乌，是蓼科蓼属植物何首乌(Polygonum multiflorum Thunb.)的块根。
大黄为蓼科大黄属多年生植物掌叶大黄(Rheum palmatum L.)、药用大黄(Rheum offcinale Baill.)、唐古特大黄(Rheum tanguticum Maxim.ex Regel)等大黄的干燥根和根茎。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1.本发明通过微生物发酵生物合成芪类化合物，生产过程安全，有利于保护环境，且不受季节限制，可规模化生产；制成的富含芪类化合物的桑黄发酵产物，吸收利用率高，其生物效价高，可开发成富含芪类化合物的功能食品和药品。
2.本发明利用花生、桑葚果、葡萄、首乌、大黄等植物中含有少量的白藜芦醇，结合芪类化合物合成代谢途径的特点，经桑黄固体发酵和液体发酵工艺，并在特定的发酵阶段添加冷激蛋白，能有效生物合成抗氧化、抗肿瘤等活性更强的维尼非林、紫檀芪等多种聚合衍生物芪类化合物。
3.本发明采用的冷激蛋白可从大多数细菌及植物等原料中提取，来源广泛，成本较低，制备方法也相对简单，可规模提取生产，对桑黄等食药用菌的发酵生产具有很好的促进效果。
具体实施方式
下面结合部分具体实施例对本发明内容进行进一步阐明，但本发明的内容并不仅限于下面的实施例。
桑黄(Phellinus linteus)ACCC51181菌种，来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心。
来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的冷激蛋白的制备：将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)从37℃降到15℃培养20min，将菌体放入匀浆机中在60MPa下匀浆2次，加入占菌体质量2％的木瓜蛋白酶，在50℃下酶解1h，4℃条件下12000rpm离心20min，收集上清液；上清液采用截留分子质量为2kD-5kD膜超滤，截留液调pH至5.0，过夜，12000r/min离心20min，离心所得上清液真空冷冻干燥得到蛋白样品。将蛋白样品溶于0.02mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中配成20mg/mL溶液，上样于葡聚糖凝胶过滤柱Sephadex G-25，用0.01mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液洗脱，流速0.5mL/min，每管收集2ml，自动收集洗脱液并于紫外280nm检测，收集280nm有吸收的组分，真空冷冻干燥得到来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的冷激蛋白。
来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的冷激蛋白的制备：将大肠杆菌(Escherichia coli)从37℃降到15℃培养12min，将菌体放入匀浆机中在60MPa下匀浆2次，加入占菌体质量1％的木瓜蛋白酶，在40℃下酶解1h，3℃条件下12000rpm离心20min，收集上清液；上清液采用截留分子质量为2kD-5kD膜超滤，截留液调pH至5.0，过夜，12000r/min离心20min，离心所得上清液真空冷冻干燥得到蛋白样品。将蛋白样品溶于0.02mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中配成20mg/mL溶液，上样于葡聚糖凝胶过滤柱Sephadex G-25，用0.01mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液洗脱，流速0.5mL/min，每管收集2ml，自动收集洗脱液并于紫外280nm检测，收集280nm有吸收的组分，真空冷冻干燥得到来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的冷激蛋白。
来源于嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的冷激蛋白的制备：将嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)从37℃降到15℃培养1min，将菌体放入匀浆机中在60MPa下匀浆2次，加入占菌体质量3％的木瓜蛋白酶，在46℃下酶解1h，5℃条件下12000rpm离心20min，收集上清液；上清液采用截留分子质量为2kD-5kD膜超滤，截留液调pH至5.0，过夜，12000r/min离心20min，离心所得上清液真空冷冻干燥得到蛋白样品。将蛋白样品溶于0.02mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中配成20mg/mL溶液，上样于葡聚糖凝胶过滤柱Sephadex G-25，用0.01mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液洗脱，流速0.5mL/min，每管收集2ml，自动收集洗脱液并于紫外280nm检测，收集280nm有吸收的组分，真空冷冻干燥得到来源于嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的冷激蛋白。
样品中芪类化合物含量的检测：
安捷伦1200高效液相色谱仪；HIQ Sil C18W(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱；检测波长为291nm；检测温度为35℃；流动相为乙腈-水(26∶74)，体积比；流速为1mL/min。以白藜芦醇、维尼非林等为相应标准品，外标法进行定量。
实施例1
一、材料准备
PDA平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂15g，用水定容至1000ml，自然pH，在121℃下灭菌20min。
将斜面保藏的桑黄菌种接种到PDA平板培养基上在22℃活化培养10天，得到活化后的桑黄菌种。
液体种子培养基：葡萄糖12g、酵母粉4g、蛋白胨3g、KH2PO4 1g和MgSO4 0.5g，用水定容至1000mL，pH自然，在121℃下灭菌20min。
固体培养基由以下质量百分比的组分组成：酵母粉0.4％、蛋白胨0.2％、K2HPO40.2％、MgSO40.1％和余量的水，pH自然，在121℃下灭菌20min。
液体发酵培养基的组成为：葡萄糖18g、蛋白胨6g、牛肉浸膏2g、KH2PO4 1.2g和MgSO4 0.75g，用水定容至1000mL，pH自然，在121℃下灭菌20min。
富含芪类化合物的桑黄发酵产物的制备：
(1)桑黄种子液的制备：取3cm2大小活化后的桑黄菌种接种于1L液体种子培养基中在25℃培养5天，得到桑黄种子液；
(2)固体发酵培养：将步骤(1)中桑黄种子液按占固体培养基体积15％的用量接入添加有外源物的固体培养基中，在22℃培养20天后，将培养产物真空冷冻干燥、粉碎后得外源物固体发酵培养物；外源物为花生仁经粉碎后得到的花生仁碎和桑葚果捣碎后得到的桑葚果浆；每升固体培养基中花生仁碎的添加量为6g，桑葚果浆的添加量为6g。
(3)液体发酵培养：将步骤(1)中桑黄种子液按占液体发酵培养基体积7％的量接种于添加有外源物固体发酵培养物的液体发酵培养基中，在22℃培养4天后，加入来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的冷激蛋白，然后调整温度在15℃继续培养5天，终止发酵后，得到富含芪类化合物的桑黄发酵产物；每升液体发酵培养基中外源物固体发酵培养物的添加量为6g；每毫升液体发酵培养基中冷激蛋白的添加量为2mg。
检测结果见表1。
实施例2
一、材料准备
PDA平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂20g，用水定容至1000ml，自然pH，在121℃下灭菌20min。
将斜面保藏的桑黄菌种接种到PDA平板培养基上在30℃活化培养3天，得到活化后的桑黄菌种。
液体种子培养基：葡萄糖5g、酵母粉4g、蛋白胨3g、KH2PO4 1g和MgSO4 0.5g，用水定容至1000mL，pH自然，在121℃下灭菌20min。
固体培养基由以下质量百分比的组分组成：酵母粉1％、蛋白胨0.2％、K2HPO40.1％、MgSO40.15％和余量的水，pH自然，在121℃下灭菌20min。
液体发酵培养基的组成为：葡萄糖18g、蛋白胨6g、牛肉浸膏2g、KH2PO4 1.2g和MgSO4 0.75g，用水定容至1000mL，pH自然，在121℃下灭菌20min。
富含芪类化合物的桑黄发酵产物的制备：
(1)桑黄种子液的制备：取1cm2大小活化后的桑黄菌种接种于1L液体种子培养基中在20℃培养8天，得到桑黄种子液；
(2)固体发酵培养：将步骤(1)中桑黄种子液按占固体培养基体积8％的用量接入添加有外源物的固体培养基中，在15℃培养35天后，将培养产物真空冷冻干燥、粉碎后得外源物固体发酵培养物；外源物为花生仁经粉碎后得到的花生仁碎；每升固体培养基中花生仁碎的添加量为2g。
(3)液体发酵培养：将步骤(1)中桑黄种子液按占液体发酵培养基体积15％的量接种于添加有外源物固体发酵培养物的液体发酵培养基中，在28℃培养1天后，加入来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的冷激蛋白，然后调整温度在25℃继续培养10天，终止发酵后，得到富含芪类化合物的桑黄发酵产物；每升液体发酵培养基中外源物固体发酵培养物的添加量为10g；每毫升液体发酵培养基中冷激蛋白的添加量为5mg。
检测结果见表1。
实施例3
一、材料准备
PDA平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂15g，用水定容至1000ml，自然pH，在121℃下灭菌20min。
将斜面保藏的桑黄菌种接种到PDA平板培养基上在26℃活化培养6天，得到活化后的桑黄菌种。
液体种子培养基：葡萄糖20g、酵母粉4g、蛋白胨3g、KH2PO4 1g和MgSO4 0.5g，用水定容至1000mL，pH自然，在121℃下灭菌20min。
固体培养基由以下质量百分比的组分组成：酵母粉0.7％、蛋白胨0.8％、K2HPO40.25％、MgSO40.05％和余量的水，pH自然，在121℃下灭菌20min。
液体发酵培养基的组成为：葡萄糖18g、蛋白胨6g、牛肉浸膏2g、KH2PO4 1.2g和MgSO4 0.75g，用水定容至1000mL，pH自然，在121℃下灭菌20min。
富含芪类化合物的桑黄发酵产物的制备：
(1)桑黄种子液的制备：取4cm2大小活化后的桑黄菌种接种于1L液体种子培养基中在30℃培养2天，得到桑黄种子液；
(2)固体发酵培养：将步骤(1)中桑黄种子液按占固体培养基体积20％的用量接入添加有外源物的固体培养基中，在28℃培养3天后，将培养产物真空冷冻干燥、粉碎后得外源物固体发酵培养物；外源物为桑葚果捣碎后得到的桑葚果浆；每升固体培养基中桑葚果浆的添加量为7g。
(3)液体发酵培养：将步骤(1)中桑黄种子液按占液体发酵培养基体积2％的量接种于添加有外源物固体发酵培养物的液体发酵培养基中，在25℃培养8天后，加入来源于嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的冷激蛋白，然后调整温度在20℃继续培养1天，终止发酵后，得到富含芪类化合物的桑黄发酵产物；每升液体发酵培养基中外源物固体发酵培养物的添加量为0.5g；每毫升液体发酵培养基中冷激蛋白的添加量为0.3mg。
检测结果见表1。
实施例4
除了外源物为花生仁经粉碎后得到的花生仁碎、桑葚果捣碎后得到的桑葚果浆、葡萄捣碎后得到的葡萄浆、首乌经粉碎后得到的首乌粉末和大黄经粉碎后得到的大黄粉末；每升固体培养基中花生仁碎的添加量为4g，桑葚果浆的添加量为4g、葡萄浆的添加量为4g、首乌粉末的添加量为4g、大黄粉末的添加量为4g；其余操作同实施例1，得到富含芪类化合物的桑黄发酵产物。
实施例5
除了外源物为首乌经粉碎后得到的首乌粉末；每升固体培养基中首乌粉末的添加量为16g；其余操作同实施例1，得到富含芪类化合物的桑黄发酵产物。
对照例1
(1)摇瓶种子培养
1L液体种子培养基：葡萄糖15g/L、酵母粉4g/L、蛋白胨3g/L、KH2PO41g/L、MgSO40.5g/L和余量为水。pH自然，在121℃下灭菌20min。
将实施例1中活化后的桑黄菌种取3cm2大小的菌块接入灭菌后1L液体种子培养基中，26℃，120r/min下摇床培养5天，得到培养好的桑黄液体菌种。
(2)液体发酵培养：将步骤(1)中的桑黄液体菌种按占液体发酵培养基体积12％的接种量接入液体发酵培养基中，在25℃，120r/min摇床中培养9天后，终止发酵，得到桑黄发酵产物；
1L液体发酵培养基组成为：葡萄糖18g/L、牛肉浸膏2g/L、蛋白胨6g/L、KH2PO41.2g/L、MgSO40.75g/L和余量的水，pH自然，在121℃下灭菌20min。
检测结果见表1。
对照例2
除了步骤(3)中不使用冷激蛋白，其余操作同实施例1，得到桑黄发酵产物。
检测结果见表1。
表1发酵液中芪类化合物含量检测结果
注：与对照例比较，Δ：P<0.05；ΔΔ：P<0.01。
由表1的数据显示，本发明根据食药真菌桑黄发酵产物芪类化合物特定代谢产物合成代谢途径的特点，利用花生、桑葚果、葡萄、首乌、大黄等植物中含有少量的白藜芦醇，经桑黄固体发酵和液体发酵工艺，并在特定的发酵阶段添加冷激蛋白，发挥各外源刺激物间协同作用，大幅度提高白藜芦醇、维尼非林等芪类化合物的含量。与常规培养方法相比，采用本发明方法发酵培养的桑黄发酵产物中白藜芦醇产量提高了174.47％-229.79％，维尼非林产量提高了193.83％-266.37％。
在本发明制备方法限定的范围内各参数的变化并不影响桑黄液体发酵代谢产物芪类化合物产量的提高，因此本发明制备方法中任意参数的组合均可实现桑黄液体发酵代谢产物芪类化合物产量的提高。在此不再赘述。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。