多基因组逆转录病毒载体制剂及用于产生及使用该制剂的方法和系统与流程
本发明提供新型多基因组逆转录病毒载体，以及用于制备所述逆转录病毒载体的方法和包装系统。
背景技术：
逆转录病毒载体是用于基因递送的常用工具，因为逆转录病毒载体能够递送感兴趣的核酸进入多种多样的细胞，这使它们非常适于将基因转移进入细胞。逆转录病毒载体已被用于针对感染性疾病和癌症的基因治疗和治疗性疫苗。然而，来自单一逆转录病毒载体基因组的多种转基因的表达(多顺反子表达)常常导致不等同表达水平的重组蛋白，这归因于，例如，不同的启动子对转录因子的竞争，或内部核糖体进入位点(ires)的功能的变化性。在将核酸递送至树突细胞的情况中，已观察到表达、抗原加工或呈递(尤其是某些肿瘤抗原)水平上的干扰现象。
本发明提供了经改善的逆转录病毒载体以及制备该载体的方法，其促进多种转基因的表达。
技术实现要素：
本发明的一方面提供一种重组多基因组逆转录病毒载体制剂，其包含：a)第一逆转录病毒颗粒，其包含两个拷贝的第一逆转录病毒载体基因组，该第一逆转录病毒载体基因组含有感兴趣的第一序列；b)第二逆转录病毒颗粒，其包含两个拷贝的第二逆转录病毒载体基因组，该第二逆转录病毒载体基因组含有感兴趣的第二序列；c)第三逆转录病毒颗粒，其包含一个拷贝的含有感兴趣的第一序列的第一逆转录病毒载体基因组，和一个拷贝的含有感兴趣的第二序列的第二逆转录病毒载体基因组；其中，所述感兴趣的第一和第二序列是不同的；其中，所述第一和第二逆转录病毒载体基因组是缺陷型逆转录病毒基因组(例如，不编码必需病毒蛋白，例如功能性gag或pol蛋白，且在进入靶细胞之后无法产生感染性颗粒)，并且其中，所述逆转录病毒载体制剂采用异源性包膜糖蛋白假型化(pseudotyped)。在本文所述的重组多基因组逆转录病毒载体制剂的某些实施方式中，第三逆转录病毒颗粒占该制剂中总逆转录病毒颗粒的至少60％，70％，80％，90％或95％。在本文所述的重组多基因组逆转录病毒载体制剂的另一实施方式中，所述异源性包膜糖蛋白选自下组：vsvg，麻疹包膜糖蛋白，和辛德毕斯包膜糖蛋白。在具体实施方式中，所述异源性包膜糖蛋白包含变体辛德毕斯病毒e2糖蛋白，且在一些实施方式中，所述变体辛德毕斯病毒e2糖蛋白结合至dc-sign。在一个实施方式中，本文所述的重组多基因组逆转录病毒载体制剂是慢病毒载体制剂。
在本文所述的重组多基因组逆转录病毒载体制剂的另一实施方式中，感兴趣的第一序列编码肿瘤相关抗原或一种或多种肿瘤抗原(neoantigen)，且感兴趣的第二序列编码免疫调节分子。在另一实施方式中，感兴趣的第一序列编码肿瘤相关抗原，且感兴趣的第二序列编码不同的肿瘤相关抗原。在另一实施方式中，感兴趣的第一序列编码肿瘤相关抗原，且感兴趣的第二序列编码一种或多种肿瘤抗原。在另一个实施方式中，所述一种或多种肿瘤抗原源自感兴趣的第一序列的肿瘤相关抗原。
在另一实施方式中，本文所述的重组多基因组逆转录病毒载体制剂还包含：e)第四逆转录病毒颗粒，其包含两个拷贝的第三逆转录病毒载体基因组，该第三逆转录病毒载体基因组含有感兴趣的第三序列；f)第五逆转录病毒颗粒，其包含一个拷贝的含有感兴趣的第一序列的第一逆转录病毒载体基因组和一个拷贝的含有感兴趣的第三序列的第三逆转录病毒载体基因组；和g)第六逆转录病毒颗粒，其包含一个拷贝的含有感兴趣的第二序列的第二逆转录病毒载体基因组和一个拷贝的含有感兴趣的第三序列的第三逆转录病毒载体基因组。在一个实施方式中，用以产生本文所述的多基因组逆转录病毒载体制剂的逆转录病毒载体基因组是缺陷型逆转录病毒基因组(例如，不编码必需病毒蛋白质，例如功能性gag或pol蛋白，且在进入靶细胞之后无法产生感染性颗粒)。
本发明的另一方面提供一种用于产生假型多基因组逆转录病毒载体制剂的逆转录病毒载体包装系统，其包含：a)第一核酸分子，其编码病毒包膜蛋白；b)第二核酸分子，其编码gag和pol蛋白；c)第三核酸分子，其编码rev；d)第四核酸分子，其包含含有感兴趣的第一序列的第一慢病毒载体基因组；e)第五核酸分子，其包含含有感兴趣的第二序列的第二慢病毒载体基因组；f)任选地，第六核酸分子，其编码vpx；和g)包装细胞或细胞系。在本文所述的逆转录病毒载体包装系统的某些实施方式中，所述逆转录病毒载体制剂是慢病毒载体制剂。在一个实施方式中，用以产生本文所述的多基因组逆转录病毒载体制剂的载体基因组是缺陷型逆转录病毒基因组(例如，不编码必需病毒蛋白质，例如功能性gag或pol蛋白，且在进入靶细胞之后无法产生感染性颗粒)。在本文所述的逆转录病毒载体包装系统的另一实施方式中，感兴趣的第一序列编码肿瘤相关抗原或一种或多种肿瘤抗原，且感兴趣的第二序列编码免疫调节分子。在另一实施方式中，感兴趣的第一序列编码肿瘤相关抗原，且感兴趣的第二序列编码不同的肿瘤相关抗原。在一个实施方式中，感兴趣的第一序列编码肿瘤相关抗原，且感兴趣的第二序列编码一种或多种肿瘤抗原。在权利要求13所述的逆转录病毒载体包装系统的另一实施方式中，其中，所述病毒包膜蛋白选自下组：vsvg，麻疹包膜糖蛋白，和辛德毕斯包膜糖蛋白。在某些实施方式中，所述病毒包膜蛋白包含辛德毕斯病毒e2糖蛋白或其能够感染树突细胞的变体。在所述逆转录病毒载体包装系统的另一实施方式中，采用等量的第四核酸分子和第五核酸分子。在另一实施方式中，用于包装系统的第四核酸分子与第五核酸分子的相对输入比率是60:40。
在本文所述的逆转录病毒载体包装系统的另一实施方式中，第一慢病毒载体基因组和第二慢病毒载体包含回文二聚体起始位点(dis)序列。在某个实施方式中，第一慢病毒载体基因组和第二慢病毒载体中的回文二聚体起始位点(dis)序列是相同的。在另一实施方式中，第一慢病毒载体基因组包含第一回文dis序列，且第二慢病毒载体包含第二回文二聚体起始位点(dis)序列。因此，在某些实施方式中，该逆转录病毒载体包装系统优先产生纯合逆转录病毒载体颗粒。在本文所述的逆转录病毒载体包装系统的另一实施方式中，第一慢病毒载体基因组包含第一dis序列，且第二慢病毒载体包含第二二聚体起始位点(dis)序列，其中，在包装过程中，第一dis序列与第二dis序列配对，从而该逆转录病毒载体包装系统优先产生杂合逆转录病毒载体颗粒。
在本文所述的逆转录病毒载体包装系统的某些实施方式中，pol蛋白具有非功能性整合酶。在一个实施方式中，用以产生本文所述的多基因组逆转录病毒载体制剂的载体基因组是缺陷型逆转录病毒基因组(例如，不编码必需病毒蛋白质，例如功能性gag或pol蛋白，且在进入靶细胞之后无法产生感染性颗粒)。因此，在某些实施方式中，用以产生本文所述的任何多基因组载体制剂的载体基因组不包含编码功能性gag或pol蛋白的序列。
本发明的另一方面提供一种多基因组逆转录病毒载体包装系统，其包含：a)至少两种核酸分子，其各自包含含有感兴趣的独特序列的逆转录病毒载体基因组；b)一种或多种核酸分子，其编码产生假型逆转录病毒载体颗粒所必需的组分；c)任选地，编码vpx的核酸分子；和d)包装细胞系。在一个实施方式中，该至少两种逆转录病毒载体基因组是缺陷型逆转录病毒基因组(例如，不编码必需病毒蛋白质，例如功能性gag或pol蛋白，且在进入靶细胞之后无法产生感染性颗粒)。在一个实施方式中，该多基因组逆转录病毒载体包装系统由2-8个核酸分子组成，所述核酸分子各包含含有感兴趣的独特序列的逆转录病毒载体基因组。在某些实施方式中，感兴趣的独特序列选自下组：编码magea1，magea4，nyeso1，magea3，magea10，scfv抗pd1，il12，il23，cd40，scfv抗pdl1，和scfv抗ctla4，或前述任一的免疫原性变体的序列。在一个实施方式中，产生逆转录病毒载体颗粒所必需的组分包括gag，pol，rev和包膜蛋白。在另一实施方式中，该包装细胞系稳定表达产生逆转录病毒载体颗粒所必需的组分中的一种或多种。在所述多基因组逆转录病毒载体包装系统的一个具体实施方式中，所述逆转录病毒载体基因组是慢病毒载体基因组。
本发明的另一方面提供一种用于产生假型多基因组逆转录病毒载体制剂的方法，所述方法包括：培养本文所述的多基因组逆转录病毒载体包装系统的包装细胞系，其中，所述包装细胞系由如下物质转染：a)至少两种核酸分子，其各自包含含有感兴趣的独特序列的逆转录病毒载体基因组；b)一种或多种核酸分子，其编码产生假型逆转录病毒载体颗粒所必需的组分；和c)任选地，编码vpx的核酸分子，和，收获该假型多基因组逆转录病毒载体颗粒。本发明的一方面提供由该方法产生的假型多基因组逆转录病毒载体制剂。
本发明的另一方面提供诱导对象中免疫应答的方法，所述方法包括：给予本文所述的多基因组逆转录病毒载体制剂，在某些实施方式中，给予表达一种或多种肿瘤抗原和/或一种或多种免疫调节分子的那些制剂。
本发明的另一方面提供治疗对象癌症的方法，所述方法包括：给予所述多基因组逆转录病毒载体制剂，其表达一种或多种肿瘤抗原和/或一种或多种免疫调节分子。
本发明的另一方面提供一种用于向对象体内递送并表达多种感兴趣的序列的方法，所述方法包括，给予本文所述的多基因组逆转录病毒载体制剂。
本发明的另一方面提供本文所述的任一实施方式中的重组多基因组逆转录病毒载体制剂用于治疗的用途。
本发明的另一方面提供本文所述的任一实施方式中的重组多基因组逆转录病毒载体制剂用于治疗患者的方法的用途。
本发明的另一方面提供本文所述的任一实施方式中的重组多基因组逆转录病毒载体制剂用于治疗患者癌症的方法的用途。
本发明的另一方面提供本文所述的任一实施方式中的重组多基因组逆转录病毒载体制剂用于刺激患者中的免疫应答的方法的用途。
本发明的这些和其它方面将在参考以下详细说明和附图之后变得显而易见。
附图说明
图1的图显示多基因组逆转录病毒载体制剂的产生方式。如本文所述，在多基因组系统中产生的杂合病毒颗粒可称作重配体。
图2的柱状图汇总了balb/c小鼠中由单一、混合、共同免疫的和多基因组病毒载体制剂诱导的针对ny-eso-1的cd8+t细胞免疫应答。
图3的柱状图汇总了balb/c小鼠中由单一、混合、共同免疫的和多基因组病毒载体制剂诱导的针对mage-a3的cd8+t细胞免疫应答。
图4的柱状图汇总了balb/c小鼠中由单一、混合、共同免疫的和多基因组病毒载体制剂诱导的针对ny-eso-1的cd4+t细胞免疫应答。
图5包括了来自balb/c雌性小鼠的抗原特异性cd8t细胞应答的图，该小鼠经尾底注射多基因组慢病毒载体制剂以递送表达nyeso1/magea3/magea10的载体。
图6的图显示用多基因组慢病毒载体治疗的小鼠的肺中肿瘤结节形成减少，和增加的抗原特异性cd8+t细胞。balb/c雌性小鼠用cin.23细胞静脉内接种。接种后第3天，小鼠用慢病毒载体免疫，如图所示(也参见实施例4)。接种后第17天，收获肺用于结节枚举(6a)；脾细胞用mhc多聚体染色供流式细胞术分析(6b)。误差线表示平均值±sem。*p<0.05；**p<0.005。
图7的图显示来自balb/c小鼠的抗原特异性cd8t细胞应答，所述小鼠经尾底注射多基因组慢病毒载体制剂以递送表达magea1/a3/a4和a10[m1，m3，m4，m10]的载体，与接受各自表达单一抗原的载体混合物的小鼠或接受多种表达单一抗原的载体注射剂的小鼠做比较。7a：用magea1池体外刺激的cd8+t细胞的多重ics染色；7b：用magea3池体外刺激的cd8+t细胞的多重ics染色；7c：用magea4池体外刺激的cd8+t细胞的多重ics染色；7d：用magea10池体外刺激的cd8+t细胞的多重ics染色。
图8的图显示balb/c小鼠中的抗原特异性cd8t细胞应答，所述小鼠经尾底注射多基因组慢病毒载体制剂以递送表达三种抗原(nyeso1/magea3/a10[ny，m3，m10])和mil12或gfp的载体，以两种不同的剂量进行。8a：用nyeso1肽池体外刺激的cd8+t细胞的％ifng+；8b：用magea3肽池体外刺激的cd8+t细胞的％ifng+；8c：用magea10池体外刺激的cd8+t细胞的％ifng+。％疫苗摄用(vaccinetake)以相关短线示于上方。*统计学显著性采用曼-惠特尼检验获得。
图9显示慢病毒载体制剂的基因特异性基因组效价，所述慢病毒载体制剂采用野生型和经修饰的dis序列制得。9a：gcn/gcn＝采用单一载体基因组质粒制得的慢病毒载体制剂，该单一载体基因组质粒编码具有野生型dis(gcgcgc，seqidno:1)的nyeso1；ggn/ggn＝采用单一载体基因组质粒制得的慢病毒载体制剂，该单一载体基因组质粒编码具有突变的dis(gggggg，seqidno:4)的nyeso1。9b：gcn/gcn＝采用单一载体基因组质粒制得的慢病毒载体制剂，该单一载体基因组质粒编码具有野生型dis(gcgcgc，seqidno:1)的nyeso1；gcn/gcm＝采用两种不同的载体基因组质粒制得的多基因组慢病毒载体制剂，该两种不同的载体基因组质粒各自包含seqidno:1的野生型hivdis序列：gcn：编码nyeso的基因组；gcm：编码magea3的基因组；ggn/ccm＝采用两种不同的载体基因组制得的多基因组慢病毒载体制剂：ggn：编码具有突变的dis序列gggggg(seqidno:4)的nyeso1的载体基因组；ggm：编码具有突变的dis序列cccccc(seqidno:5)的magea3的载体基因组。
序列鉴定物简述
seqidno1–seqidno:14是可用于本文所述的逆转录病毒载体基因组和包装系统的二聚体起始位点(dis)序列。gcgcgc(seqidno:1)；gcccgg(seqidno:2)；ccgggc(seqidno:3)；gggggg(seqidno:4)；cccccc(seqidno:5)；gugcac(seqidno:6)；gcgcgg(seqidno:7)；cgcgcc(seqidno:8)；gggcgg(seqidno:9)；cccgcc(seqidno:10)；cgcgcg(seqidno；11)；cgggcc(seqidno:12)；ggcccg(seqidno:13)；cacgug(seqidno:14)。
具体实施方式
已证实慢病毒载体是体内递送核酸的工具。美国专利8,187,872描述了整合缺陷型、dc靶向型的经修饰的第三代慢病毒载体平台，其当前处于考察其引发针对肿瘤相关抗原(taa)的免疫应答能力的2期研究评价。对于慢病毒载体技术，荷载的大小通常限于8-10kb，这尽管具有意义，但会阻碍对于多种肿瘤抗原(ta)的靶向，并阻碍感兴趣的其它序列(例如编码免疫调节分子的那些)的纳入。此外，在单一载体构建体中表达多种蛋白质(例如抗原)的常规方法(例如，内切蛋白酶切割，内部核糖体进入位点(ires)等)，常常会导致感兴趣的蛋白质的表达减少和/或，在疫苗设计中，使针对一种或多种编码的抗原的抗原特异性t细胞应答的诱导显著减少。
因此，本文中，设计多基因组逆转录病毒载体制剂来克服单一基因组载体平台在高效共同表达任何组合的所需基因方面的限制。不像其它载体，本发明的多基因组载体制剂不需要用以修饰载体骨架的多重克隆步骤，它们通常会导致编码的基因产物的不可预测的表达概况。本发明克服了现有技术载体系统的限制，并且成功允许多基因体内递送。本发明提供下一代逆转录病毒载体系统，其能够实现，包括，对于多种肿瘤抗原的有效靶向。载体生产的在转染阶段以可控比率混合抗原表达型质粒的能力实现了在其它情况下无法实现的生产多基因组载体的组合的灵活性，并且，其生产的多功能性与敏捷性使其有可能成为用于强化癌症免疫治疗的肿瘤抗原和免疫调节剂的共同表达的一流载体系统。因其在多种感兴趣抗原和/或表位(包括肿瘤抗原表位)之间产生强力抗原特异性t细胞应答的能力，本发明的多基因组逆转录病毒载体系统有望成为用以产生在多种肿瘤类型中具有优越抗肿瘤控制力的物质的有力平台。本发明提供其它益处，如本文所述。
本发明描述了在单一生产步骤中产生逆转录病毒载体颗粒，其表达一种(同源载体)或两种(异源载体)转基因。这是产生逆转录病毒载体制剂的新方法，其能递送并表达两种或更多种感兴趣的蛋白质，并克服构建双或多顺反子载体的当前限制，所述限制包括插入大小、受影响的基因表达、受损的功能性基因产物的生物合成性、缺乏对相对表达水平的有效控制等限制。
本发明在一个方面中描述了杂合逆转录病毒载体颗粒和用以产生所述载体颗粒的方法，所述载体颗粒包含两种rna基因组，其各自编码在生产过程期间通过受控且定向的遗传重配产生的不同的转基因(参见图1)。该过程产生慢病毒载体颗粒的混合物，其中一些为杂合的，一些为纯合的。如本文中的更详细描述，该过程可控，从而可按需修改病毒载体制剂中杂合与纯合颗粒之比率。包含杂合颗粒的这些多基因组病毒载体制剂可用于单独或联合地，在靶细胞(例如，树突细胞，t细胞或其它靶细胞)中体内或体外递送并表达两种或更多种不同的感兴趣核酸，例如编码癌症抗原(包括肿瘤抗原)、细胞因子、免疫检验点抑制剂，或任何其它感兴趣蛋白质的核酸。本发明允许快速构建现成的，半定制和定制的癌症疫苗，该癌症疫苗相比现有技术中构建带载体的癌症疫苗的方法具有优越的免疫原性和保护宽度。
来自重配逆转录病毒载体的多种转基因的表达能够克服这些问题。然而多顺反子载体的克隆需要对感兴趣的转基因在传递载体基因组中的定位最优化，而重配载体可通过采用包含各自表达不同转基因的多种逆转录病毒传递载体(逆转录病毒基因组)的质粒混合物来转染生产细胞/包装细胞而更快速地产生。
有时，多种转基因的表达通过在转导细胞之前合并单顺反子载体制剂来实现。这要求合并的载体混合物以高感染复数(moi)使用以供体外转导，这会造成载体制剂的无效利用。此外，该方法在疫苗或治疗设置中的无效程度较高，因为在体内给予之后，共同转导的实现是不可预测的。本发明允许两种转基因在体内且在体外以极低的moi共同表达。
本发明允许基于载体混合物制造定制癌症疫苗，该载体混合物通过采用现成转移载体的多重质粒转染产生。这还允许产生由不同的转基因组成的疫苗，其作用机制受益于在相同细胞中的体内共同表达。一个示例是编码辅助t细胞表位与ctl-或b-细胞表位的转基因的共同表达，用于诱导有力的适应性免疫应答和免疫记忆。第二示例是抗原与胞内免疫调节因子，例如irf-3，或cpg基序，的共同表达。第三示例是异质二聚体功能性分子例如白介素-12的个体亚基的共同表达，该共同表达以避免由工程改造的接头结构域所致的“非自体”肿瘤抗原表位的可能性的方式进行。第四示例是自复制型复制子，非常大因而无法有效被包装进入lv的转录本的表达。通过将大的复制子rna分成两个独立但互补的载体构建体，可以用各自足够小以进行包装的插入物实现复制子功能性。
此外，通过在生产步骤期间改变输入质粒的相对量(如本文表1和表2中汇总)，本发明允许有效控制各载体基因组的掺混比率。使用多顺反子载体不能可靠地实现这一点。
此外，本发明提供其它益处：通过修改各逆转录病毒载体基因组的二聚体起始信号以促进纯合相互作用或杂合相互作用，能够控制任何给定制剂中杂合或纯合载体的占比。就此而言，已知两种逆转录病毒rna拷贝在病毒出芽前(甚至在它们与gag蛋白相互作用之前)于宿主细胞中相遇(参见例如，moore等，aidsrev.2009四月–六月；11(2):91–102)。在hiv-1中，例如，存在称为sl1的rna中的茎环，其暴露回文序列gcgcgc(seqidno:1)。该序列以沃森-克里克(watson-crick)方式与其它rna伴侣上的相同序列相互作用。修饰该序列可打开或关闭二聚化。该特征可用于使给定基因组适于特定所需的二聚化性质。本文设想采用源自任何逆转录病毒的回文二聚化序列。作为另一示例，hiv-1亚型c具有回文gugcac(seqidno:6)。
作为一个示例，为了降低基因组a与基因组b二聚化的可能性，不同的回文序列可用于基因组b(不与基因组a的回文序列成对的序列)，这允许它仅与其自身二聚化。该序列可经设计，从而其将允许与基因组a的同源二聚化而非异源二聚化。这在这样的情况中将是有利的：其中感兴趣的具体序列因处于纯合载体中而具有益处，例如，用于产生免疫应答。
作为另一示例，回文二聚化序列可经修饰，从而无法发生同源二聚化(例如，该序列经修饰为非回文的)。不同的是，该序列经工程改造以与同源伴侣形成强碱基配对。例如，序列如基因组a的gcccgg(seqidno:2)和基因组b的ccgggc(seqidno:3)。该序列构造有利于异源性二聚体成对和杂合载体颗粒形成。通过该方式，制剂中杂合载体颗粒(重配体)的所得占比是可控的，并且可设计为包含多于50％重配体。这在一些情况中是有用的，例如，免疫调节分子与特定抗原一起递送且最好递送至相同宿主细胞时(例如，其中采用需要被共同递送的irf3、cd40、sirna或其它感兴趣的序列时)。优选促进杂合配对的另一示例是以尽可能少的同源二聚体表达tcr-α和β链以供cart生产。本文设想的其它二聚化基序包括gggggg(seqidno:4)和cccccc(seqidno:5)，分别用于a和b。一种或多种a-u碱基配对的添加可用于修改相互作用的结合强度。参见例如，baig等，2008retrovirl5:65；lu等，2011jmolbiol410:609；moore等，2007jvirol81:4002；moore等，2009aidsrev.11:91；tran等，2015retrovirol12:83。
a.病毒载体包膜
本文所述的病毒载体通常用来自异源病毒的包膜蛋白假型化(pseudotyped)。“假型”、“假型化”或“假型化的”慢病毒是具有由不同于慢病毒基因组的病毒编码的一种或多种包膜糖蛋白的慢病毒颗粒。如本文所述，可以修饰、突变或工程改造包膜糖蛋白。具有合适的靶向特征和本领域技术人员已知的其它特征的任何包膜糖蛋白可用于使本文中的病毒载体假型化。在某些实施方式中，病毒载体用vsvg包膜糖蛋白假型化。在其它实施方式中，病毒载体可用衍生自异源hiv(例如hiv-2)或其它异源逆转录病毒如猫免疫缺陷病毒(fiv)、马传染性贫血病毒、猿猴免疫缺陷病毒(siv)或梅迪/维斯纳(maedi/visna)病毒的包膜糖蛋白进行假型化。而在其它实施方式中，本文所述的病毒载体用麻疹病毒包膜糖蛋白假型化。
在具体的实施方式中，本文所述的病毒载体用衍生自虫媒病毒的包膜糖蛋白假型化。节肢动物传播的病毒(虫媒病毒)是通过感染的节肢动物载体如蚊子传播给宿主如人、马或鸟的病毒。虫媒病毒进一步分为病毒亚科，包括甲病毒和黄病毒，它们具有正极性的单链rna基因组和含有糖蛋白的包膜。例如，登革热病毒、黄热病病毒和西尼罗河病毒属于黄病毒科，辛德毕斯病毒、塞姆利基森林病毒和委内瑞拉马脑炎病毒是甲病毒科成员(wang等，j.virol.66，4992(1992))。辛德毕斯病毒的包膜包括两种跨膜糖蛋白(mukhopadhyay等，naturerev.microbio.3,13(2005))：据信，e1负责融合，e2负责细胞结合。已知辛德毕斯病毒包膜糖蛋白可以假型化其它逆转录病毒，包括致癌逆转录病毒和慢病毒。
辛德毕斯病毒和其它甲病毒包膜纳入到病毒颗粒膜的脂质双层中，并且通常包括两种糖蛋白e1和e2的多个拷贝。每个糖蛋白都有膜跨越区；e2具有约33个残基的胞质结构域，而e1的胞质尾部非常短(约2个残基)。e1和e2都在膜跨越区域内或附近附着有棕榈酸。e2最初被合成为前体蛋白，其被弗林蛋白酶或其它ca2+依赖性丝氨酸蛋白酶切割成e2和称为e3的小糖蛋白。位于编码e2和e1的序列之间的是编码称为6k的蛋白质的序列。e3和6k是信号序列，其分别用于将e2和e1糖蛋白转位至膜中。在辛德毕斯病毒基因组中，辛德毕斯包膜蛋白的编码区包括编码e3，e2，6k和e1的序列。如本文所用，虫媒病毒的“包膜”至少包括e2，并且还可以包括e1、6k和e3。辛德毕斯病毒株hr的包膜糖蛋白的示例性序列如wo2011/011584的seqidno.17所示。其它虫媒病毒的包膜糖蛋白序列可以在例如genbank中找到。例如，编码登革病毒糖蛋白的序列可以在登录号gq252677(以及genbank中的其它登录号)以及ncbi的病毒变异数据库(genbank登录号和病毒变异数据库通过参考包膜糖蛋白序列而纳入)中找到，编码委内瑞拉马脑炎病毒包膜糖蛋白的序列可以在登录号np040824(通过参考包膜糖蛋白序列而纳入)中找到。
虽然树突细胞上的甲病毒，特别是辛德毕斯病毒，的细胞受体迄今尚未明确鉴定，但一种受体似乎是dc-sign(klimstra等，jvirol77：12022，2003)。术语“附着”，“结合”，“靶向”等的使用可互换使用，并不意味着指示辛德毕斯病毒包膜糖蛋白与细胞组分之间相互作用的机制。dc-sign(树突细胞特异性icam-3(细胞间粘附分子3)-吞噬非整合素；也称为cd209)是能够快速结合并内吞物质的c型凝集素样受体(geijtenbeek,t.b.等.annu.rev.immunol.22:33-54,2004)。e2似乎通过dc-sign将病毒靶向树突细胞。如本文所示，相比不表达dc-sign的同基因细胞，表达dc-sign的细胞通过用辛德毕斯病毒e2假型化的病毒载体颗粒更好地进行转导(至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少6倍，至少7倍，至少8倍，至少9倍或至少10倍更好)。e2糖蛋白如何促进病毒感染的机制似乎涉及dc-sign，可能通过直接结合至dc-sign或导致构象改变或一些其它机制。不管实际的机制如何，e2的靶向对于表达dc-sign的细胞(即树突细胞)是优先的。
辛德毕斯病毒似乎也通过硫酸乙酰肝素结合细胞(klimstra等,jvirol72:7357,1998；burmes和griffin,jvirol72:7349,1998)。因为在大多数细胞类型的表面上发现硫酸乙酰肝素和其它细胞表面葡糖胺聚糖，所以希望减少硫酸乙酰肝素和辛德毕斯包膜糖蛋白之间的相互作用。这可以通过减少辛德毕斯病毒包膜与硫酸乙酰肝素的结合或增加辛德毕斯病毒包膜与树突细胞的结合(例如增加亲合力)或两者来实现。结果，与其它分子的非特异性结合减少，所述分子通过其它细胞类型表达并且即使包膜对dc-sign特异也可能发生，并且改善的特异性可用于避免不希望的副作用，例如可能降低所需免疫应答的副作用或与其它细胞类型的脱靶转导相关的副作用。作为替代或除了表达dc-sign的细胞的相对特异性转导的优点之外，用辛德毕斯病毒包膜e2糖蛋白假型化的病毒颗粒可提供相比用糖蛋白如vsvg假型化的病毒颗粒的其它优点。这些优点的示例包括减少补体介导的裂解和/或减少的神经元细胞靶向，这两者都被认为与给予vsv-g假型化的病毒颗粒有关。
在各种示例中，慢病毒载体颗粒特异性结合至表达dc-sign的细胞并且与硫酸乙酰肝素的结合减少或消除。也就是说，辛德毕斯病毒包膜e2糖蛋白可以被修饰以将病毒相对于其它细胞类型优先引导病毒至表达dc-sign的树突细胞。基于从结构研究和分子建模以及其它研究获得的信息，设计和生成包膜蛋白(尤其是e2和e1糖蛋白)的变体序列，使得糖蛋白保持其作为包膜蛋白的功能，但具有所需的结合特异性、亲合性、或结合水平。可以为每个糖蛋白创建候选变体序列，并使用本文所述方法或本领域已知的其它方法分析以鉴定具有最期望特征的包膜糖蛋白。
b.慢病毒载体基因组
病毒载体颗粒包含基因组，其包含一种或多种感兴趣的序列。可以包括其它序列，例如允许基因组被包装到病毒颗粒中的序列和在转导靶细胞后促进感兴趣序列表达的序列。基因组可以源自大量合适、可用的逆转录病毒如慢病毒，基于基因组的载体，包括经鉴定用于人类基因组治疗应用的那些，例如由pfeifer和verma所描述的那些(annu.rev.genomicshum.genet.2:177-211,2001)中的任一种。
1.骨架
合适的逆转录病毒载体基因组可以源自任何逆转录病毒，包括α逆转录病毒(rous肉瘤病毒)，β逆转录病毒(小鼠乳腺肿瘤病毒)，γ逆转录病毒(鼠白血病病毒；猫白血病病毒)，δ逆转录病毒(牛白血病病毒；人t淋巴细胞病毒(htlv))，ε逆转录病毒，泡沫病毒(猿猴泡沫病毒)和慢病毒。具体的说明性逆转录病毒载体基因组包括慢病毒载体基因组。慢病毒载体基因组包括基于人免疫缺陷病毒(hiv-1)、hiv-2、猫免疫缺陷病毒(fiv)、马传染性贫血病毒、猿猴免疫缺陷病毒(siv)和梅迪/维斯纳(maedi/visna)病毒的基因组。慢病毒的理想特征是它们能够感染分裂和非分裂细胞，不必使靶细胞分裂(或刺激靶细胞分裂)。通常，基因组和包膜糖蛋白将基于不同的病毒，使得所得病毒载体颗粒被假型化。载体基因组的安全特征理想地被并入。安全性特征包括自灭活ltr和非整合基因组。
在一些示例性实施方式中，病毒载体基因组包含来自慢病毒基因组(例如hiv-1基因组或siv基因组)的序列。病毒基因组构建体可以包含来自慢病毒的5'和3'ltr的序列，并且具体地可以包含来自慢病毒的5'ltr的r和u5序列以及来自慢病毒的经灭活的或自灭活3'ltr。ltr序列可以是来自任何物种的任何慢病毒的ltr序列。例如，它们可能是来自hiv，siv，fiv或biv的ltr序列。通常，所述ltr序列是hivltr序列。
载体基因组可包含经灭活的或自灭活3'ltr(zufferey等，jvirol72:9873,1998；miyoshi等，jvirol72:8150,1998)。自灭活载体通常具有来自3'长末端重复序列(ltr)的增强子和启动子序列的缺失，其在载体整合过程中被复制到5'ltr中。在一个示例中，3'ltr的u3元件含有其tata盒、sp1、nf-κb位点和增强子序列的缺失。自灭活3'ltr导致在进入和逆转录后产生的前病毒将包含灭活的5'ltr。其基本原理是通过降低载体基因组动员的风险和ltr对附近细胞启动子的影响来提高安全性。自灭活3'ltr可以通过本领域已知的任何方法构建。
任选地，来自慢病毒5'ltr的u3序列可以用病毒构建体中的启动子序列(如异源启动子序列)替代。这可以增加从包装细胞系回收病毒的滴度。增强子序列也可以包括在内。可以使用增加包装细胞系中病毒rna基因组表达的任何增强子/启动子组合。在一个示例中，使用cmv增强子/启动子序列(us5385839和us5168062)。
逆转录病毒载体基因组一般是gag和/或pol缺陷型(参见coffin,j.,刊于：《rna肿瘤病毒》(rnatumorviruses),weiss,r.等(编)冷泉港实验室(coldspringharborlaboratory),第2卷,第36-73页,1985)。因此，本文中适用的逆转录病毒载体基因组通常是缺陷型逆转录病毒载体基因组，其一旦被包装即能感染靶细胞，使其rna基因组逆转录，并且在某些实施方式中，将逆转录的dna整合进入靶细胞基因组(或保留为附加型)，但无法在靶细胞内复制以产生感染性逆转录病毒颗粒。这些所谓的第三和第四代逆转录病毒载体所具有的基因组本质上去除了大多数或全部hiv蛋白。然后，在包装系统中以反式提供颗粒生产所需的病毒蛋白，提供重要的安全性益处。因此，在某些实施方式中，该载体基因组包含不含功能性gag/pol开放阅读框的多核苷酸。因此，在某些实施方式中，合适的载体基因组不编码功能性gag或pol蛋白。在某些实施方式中，合适的载体基因组不编码功能性gag、pol或env蛋白。本领域普通技术人员应理解，在某些实施方式中，可能希望在包装信号附近保留一些gag序列，以促进克隆和/或有效包装，然而不存在gag/pol的完全编码区域。
在某些实施方式中，通过将慢病毒载体基因组构建为整合缺陷型来使插入型诱变的风险最小化。可以采用多种方法来产生非整合型载体基因组。这些方法需要将突变构建到pol基因的整合酶组分中，从而其编码具有失活的整合酶的蛋白质。载体基因组本身可以被修饰以通过例如突变或缺失两个附着位点之一或两者或经由缺失或修饰使3'ltr近端多嘌呤道(ppt)非功能来防止整合。此外，还可采用非遗传型方法；这些包括抑制整合酶的一种或多种功能的药理学试剂。这些方法不是相互排斥的，也就是说，一次可以使用其中的多于一种。例如，整合酶和附着位点都可以是非功能性的，或者整合酶和ppt位点可以是非功能性的，或者附着位点和ppt位点可以是非功能性的，或者它们都可以是非功能性的。
如上所述，一种方法是制造和使用非功能性整合酶。整合酶涉及切割病毒双链钝末端dna并将两端连接到染色体靶位点的两条链中的5'-磷酸酯。整合酶有三个功能结构域：n-末端结构域，其含有锌结合基序(hhcc)，中央结构域核心，其包含催化核心和保守的dd35e基序(hiv-1中的d64，d116，e152)，和具有dna结合特性的c末端结构域。引入整合酶的点突变足以破坏正常功能。已经构建和表征了许多整合酶突变(参见，philpott和thrasher,humangenetherapy18:483,2007；apolonia,提交至伦敦大学学院的理论(thesissubmittedtouniversitycollegelondon),2009年4月,第82-97页；engelman等，jvirol69:2729,1995；nightingale等.moltherapy,13:1121,2006)。编码整合酶蛋白的序列可以缺失或突变以使蛋白质灭活，优选不显著损害逆转录酶活性或核靶向，从而仅防止前病毒整合入靶细胞基因组。可接受的突变可以减少整合酶催化，链转移，与att位点的结合，与宿主染色体dna的结合以及其它功能。例如，hiv或siv整合酶残基35处的单个天冬氨酸至天冬酰胺的取代完全消除了病毒dna整合。整合酶的缺失通常限于c端域。缺失残基235-288的编码序列产生有用的非功能性整合酶(engelman等，jvirol69:2729，1995)。作为进一步的示例，可以产生突变，例如asp64(针对hiv-1的残基编号，来自其它慢病毒或逆转录病毒的整合酶的相应残基编号可由本领域技术人员容易地确定)(例如d64e，d64v)，asp116(例如d116n)，asn120(例如n120k)，glu152，gln148(例如q148a)，lys156，lys159，trp235(例如，w235e)，lys264(例如k264r)，lys266(例如k266r)，lys273(例如k273r)。可以构建其它突变并测试整合，转基因表达和任何其它期望的参数。这些功能的测定是众所周知的。可通过多种技术中的任何技术产生突变，包括核酸序列的化学合成和定点诱变。可以进行一个突变或者可以在整合酶中存在多于一个这些突变。例如，整合酶可在两个氨基酸，三个氨基酸，四个氨基酸等处具有突变。
替代性或联合性地，利用整合酶突变体，u3和u5中的附着位点(att)也可以被突变。整合酶与这些位点结合，并且3'末端二核苷酸在载体基因组的两端被切割。ca二核苷酸位于3'末端的凹陷处；ca是加工所需的，核苷酸的突变阻断向宿主染色体的整合。ca二核苷酸的a是整合的最关键的核苷酸，并且基因组两端的突变将产生最佳结果(brown等，jvirol73:9011(1999))。在一个示例中，每端的ca被改为tg。在其它示例中，每端的ca在一端改为tg，在另一端改为gt。在其它示例中，缺失每端的ca；在其它示例中，ca的a在每个末端缺失。
整合也可以通过位于3'ltr附近的3’聚嘌呤道(ppt)(wo2009/076524)的突变或缺失来抑制。ppt是约15个核苷酸的多嘌呤序列，其可以用作正链dna合成的引物结合位点。在这种情况下，ppt的突变或缺失靶向逆转录过程。不希望受到机制的影响，通过突变或缺失ppt，线性dna的产生从根本上减少并且基本上仅产生1-ltrdna环。整合需要线性双链dna载体基因组，在其缺乏的情况下整合基本上被消除。如上所述，可以通过突变或缺失使ppt失去功能。通常，约15nt的ppt整体缺失，尽管在一些实施方式中，可制备更短的14nt，13nt，12nt，11nt，10nt，9nt，8nt，7nt，6nt，5nt，4nt，3nt和2nt的缺失。当进行突变时，通常产生多重突变，特别是在ppt的5'半部分中(mcwilliams等人，jvirol77:11150,2003)，尽管前四个碱基中的单和双突变仍然减少转录。在ppt的3'末端产生的突变通常具有更显著的效果(powell和levinjvirol70:5288,1996)。
产生载体基因组非整合的这些不同方法可以单独使用或组合使用。可以使用多种方法来通过冗余机制构建容错(fail-safe)载体。因此，可以将ppt突变或缺失与att位点突变或缺失组合或与整合酶突变组合，或者可以将ppt突变或缺失与att位点突变或缺失以及整合酶突变组合。类似地，att位点突变或缺失和整合酶突变可以相互组合或与ppt突变或缺失相组合。
2.调节元件
如本文中所述，病毒载体基因组包含希望在靶细胞中表达的一种或多种感兴趣的核酸。出于简化目的，术语“感兴趣的序列”(soi)用以表示一种或多种感兴趣的序列(例如抗原，其具有或不具有一种或多种其它免疫刺激分子，细胞因子或一种或多种其它抗原)。通常，感兴趣序列位于5'ltr和3'ltr序列之间。此外，感兴趣的序列优选与其它遗传元件(例如，包括启动子或增强子的转录调节序列)功能性相关，从而以特定方式调节感兴趣的序列的表达。在某些情况中，有用的转录调节序列是那些在时间和空间上都对活性高度调节的序列。可用于调节组分表达的表达控制元件是本领域已知的，并且包括但不限于诱导型启动子，组成型启动子，分泌信号，增强子或其它调节元件。
感兴趣的序列和任何其它可表达序列通常与内部启动子/增强子调节序列功能性相关。“内部”启动子/增强子位于病毒载体构建体中5'ltr和3'ltr序列之间，并且可操作地连接感兴趣的序列。内部启动子/增强子可以是任何启动子，增强子或已知以功能性关系的方式增强基因表达的启动子/增强子组合。“功能性关系”和“可操作地连接”非限制性地表示，就启动子和/或增强子而言，序列处于正确的位置和方向，当启动子和/或增强子与合适分子接触时，感兴趣的序列将会被表达。
内部启动子/增强子的选择是基于感兴趣的序列所需的表达模式以及已知启动子/增强子的特殊性质。因此，内部启动子可以是组成型活性的。可以使用的组成型启动子的非限制性示例包括泛素启动子(us5510474；wo98/32869)，cmv(thomsen等，pnas81:659,1984；us5168062)，β-肌动蛋白(gunning等，1989proc.natl.acad.sci.usa84:4831-4835)和pgk(参见例如，adra等，1987gene60:65-74；singer-sam等，1984gene32:409-417；和dobson等，1982nucleicacidsres.10:2635-2637)。
或者，该启动子可以是组织特异性启动子。在一些优选实施方式中，启动子是靶细胞特异性启动子。例如，启动子可以来自由树突细胞表达的任何产物，包括cd11c，cd103，tlr，dc-sign，bdca-3，dec-205，dcir2，甘露糖受体，dectin-1，clec9a，mhcii类。此外，可以选择启动子以允许感兴趣序列的诱导型表达。用于诱导型表达的许多系统是本领域已知的，包括四环素响应系统，lac操纵子-阻遏物系统，以及对多种环境或生理变化响应的启动子，包括对热休克，金属离子，如金属硫蛋白启动子，对干扰素，缺氧，类固醇，如孕酮或糖皮质激素受体启动子，对辐射，如vegf启动子。也可用启动子组合获得想要的感兴趣基因表达。普通技术人员将能够基于生物体或感兴趣靶细胞想要的基因表达方式来选择启动子。
病毒基因组可以包含至少一个rna聚合酶ii或iii响应性启动子。可以将该启动子可操作地连接至感兴趣的序列，并且也可以连接至终止序列。此外，可以纳入超过一个rna聚合酶ii或iii启动子。rna聚合酶ii和iii启动子为本领域普通技术人员熟知。合适范围的rna聚合酶iii启动子可在例如paule和white,nucleicacidsresearch.,28卷,1283-1298页(2000)中找到。rna聚合酶ii或iii启动子还包括任何合成的或工程改造的dna片段，其可以指导rna聚合酶ii或iii转录下游rna编码序列。此外，rna聚合酶ii或iii(polii或iii)启动子或用作病毒载体基因组部分的启动子可以是诱导型的。本发明所述方法可以使用任何合适的诱导型polii或iii启动子。特别适合的polii或iii启动子包括四环素响应性启动子，在ohkawa和taira，humangenetherapy,11卷,577-585页(2000)和meissner等nucleicacidsresearch,29卷,1672-1682页(2001)中提供。
病毒构建体中可能还存在内部增强子以增强感兴趣的基因的表达。例如，可以使用cmv增强子(boshart等，cell,41:521,1985)。哺乳动物基因组中和病毒基因组(如hiv、cmv)中许多增强子已经被鉴定和表征(参见genbank)。增强子可与异源启动子联用。本领域普通技术人员能够根据想要的表达方式选择适当的增强子。
病毒载体基因组通常含有被靶细胞识别的启动子，其可操作地连接到感兴趣序列、病毒组分和本文所述的其它序列。启动子是由允许rna聚合酶结合并发生转录的核酸序列形成的表达控制元件。启动子可以是诱导型，组成型，时间活性或组织特异性的。诱导型启动子的活性由存在或不存在生物或非生物因素来诱导。诱导型启动子可以成为基因工程中有用的工具，因为它们可操作地连接的基因的表达可以在生物体的某些发育阶段、其生产或特定组织中打开或关闭。诱导型启动子可以分组为化学调节的启动子和物理调节的启动子。典型的化学调节的启动子包括但不限于醇调节的启动子(例如醇脱氢酶i(alca)基因启动子)，四环素调节的启动子(例如四环素响应性启动子)，类固醇调节的启动子(例如，基于大鼠糖皮质激素受体(gr)的启动子，基于人雌激素受体(er)的启动子，基于蛾蜕皮激素受体的启动子和基于类固醇/类视黄醇/甲状腺受体超家族的启动子)，金属调节的启动子(例如基于金属硫蛋白基因的启动子)和发病机理相关的启动子(例如基于拟南芥和玉米病原体相关(pr)蛋白的启动子)。典型的物理调节的启动子包括但不限于温度调节的启动子(例如热休克启动子)和光调节的启动子(例如大豆ssu启动子)。其它示例性启动子在其它地方描述，例如，在2009年5月18日访问的patentlens网站的“用于调节基因表达的启动子(promotersusedtoregulategeneexpression)”中。
本领域技术人员将能够根据具体情况选择合适的启动子。许多不同的启动子在本领域中是众所周知的，用于将启动子可操作地连接到待表达的基因的方法也是众所周知的。天然启动子序列和许多异源启动子都可用于在包装细胞和靶细胞中指导表达。然而，异源启动子是优选的，因为与天然启动子相比，它们通常允许更高的转录和更高产量的所需蛋白质。
启动子可以获自例如多瘤病毒，禽痘病毒，腺病毒，牛乳头瘤病毒，禽肉瘤病毒，巨细胞病毒，逆转录病毒，乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(sv40)等病毒的基因组。启动子还可以是例如异源哺乳动物启动子，例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，热休克启动子或通常与天然序列关联的启动子，条件是这种启动子与靶细胞相容。在一个实施方式中，启动子是病毒表达系统中天然病毒启动子。在一些实施方式中，启动子是树突细胞特异性启动子。树突细胞特异性启动子可以是，例如，cd11c启动子。
通过将增强子序列插入载体可以增加转录。增强子通常是dna的顺式作用元件，通常长约10-300bp，作用于启动子以增加其转录。现在已知哺乳动物基因(球蛋白，弹性蛋白酶，白蛋白，甲胎蛋白和胰岛素)和真核细胞病毒中的许多增强子序列。示例包括复制起点后侧的sv40增强子(bp100-270)，巨细胞病毒早期启动子增强子，复制起点后侧的多瘤增强子和腺病毒增强子。增强子可以在抗原特异性多核苷酸序列的5'或3'位置剪接入载体，但优选位于启动子的5'位点。
表达载体还可以含有终止转录和稳定mrna所需的序列。这些序列通常在真核或病毒dna或cdna的5'(偶尔在3')非翻译区中发现，并且是本领域公知的。
病毒载体基因组还可以含有其它遗传元件。可以包括在构建体中的元件的类型不受任何限制，并且可以对其进行选择以获得特定结果。例如，可以包含促进靶细胞中病毒基因组核进入的信号。这种信号的一个示例hiv-1cppt/cts信号(dna侧翼)。此外，可以包括有助于表征靶细胞中前病毒整合位点的元件。例如，构建体中可以包括trna琥珀抑制子序列。病毒基因组构建体中也可以包括来自例如鸡β-球蛋白的绝缘子序列。由于甲基化和异染色质化作用，该元件降低在靶细胞中使整合的前病毒沉默的可能性。此外，绝缘子可以使内部增强子、启动子和外源基因免受染色体上整合位点周围dna的正向或负向位置效应的影响。此外，载体基因组可以包括设计成增强感兴趣的基因表达的一个或多个遗传元件。例如，可将土拨鼠肝炎病毒响应性元件(wre)置于构建体中(zufferey等，1999.j.virol.74:3668-3681；deglon等，2000.hum.genether.11:179-190)。
病毒载体基因组通常以可转染到包装或生产细胞系中的质粒形式构建。质粒通常包含用于在细菌中复制质粒的序列。这样的质粒为本领域熟知。此外，包括原核生物复制起点的载体也可以包括其表达赋予可检测或选择性标志物例如耐药性的基因。典型的细菌耐药性产品是赋予氨苄青霉素或四环素抗性的产品。
含有本文所述的一种或多种组分的质粒可以使用本领域公知的标准技术容易地构建。为了分析以确认构建的质粒中的正确序列，可以将质粒在大肠杆菌(e.coli)中复制，纯化，并通过限制性内切酶消化进行分析或通过常规方法确定其dna序列。
也可以使用构建用于在哺乳动物细胞中瞬时表达的载体。瞬时表达涉及使用能够在宿主细胞中高效复制的表达载体，使得宿主细胞积累表达载体的许多拷贝，继而合成高水平的由表达载体中的抗原特异性多核苷酸编码的多肽。参见sambrook等，同上，第16.17-16.22页。适于多肽表达的其它载体和方法在本领域中是公知的，并且容易适应具体情况。
使用本文提供的教导，本领域技术人员将认识到，可通过用包含编码报告蛋白的基因的载体转染包装细胞并使用合适的技术(例如测量来自绿色荧光蛋白缀合物的荧光)测量表达来测试特定表达系统的功效。合适的报告基因在本领域中是众所周知的。
3.二聚体起始位点(dis)序列
逆转录病毒选择性地包装两个拷贝的未剪接的rna基因组。已知两个逆转录病毒rna拷贝在病毒出芽前(甚至在它们与gag蛋白相互作用之前)于宿主细胞中相遇(参见例如，moore等，aidsrev.2009四月–六月；11(2):91–102；lu等，jmolbiol2011410:609-633)。例如，在hiv-1中，于基因组的5’端附近的rna中，更主要在5’未翻译区域(5’utr)内存在茎环(称作sl1)，其暴露回文序列gcgcgc(seqidno:1)。该序列以沃森-克里克(watson-crick)方式与其它rna伴侣上的相同序列相互作用。修饰该序列可打开或关闭二聚化。该特征可用于使给定基因组适于特定所需的二聚化性质。本文设想应用源自任何逆转录病毒的回文或非回文二聚体起始位点(dis)序列。本文也设想采用合成的回文或非回文dis序列。作为另一示例，hiv-1亚型c具有回文gugcac(seqidno:6)。
作为一个示例，为了降低基因组a与基因组b二聚化的可能性，不同的回文序列可用于基因组b(不与基因组a的回文序列成对的序列)，这允许它仅与其自身二聚化。该序列可经设计，从而其将允许与基因组a的同源二聚化而非异源二聚化。这在这样的情况中将是有利的：其中感兴趣的具体序列因处于纯合载体中而具有益处，例如，用于产生免疫应答。
作为另一示例，回文dis序列可经修饰，从而减少同源二聚化(例如，该序列经修饰为非回文的)。不同的是，该序列经工程改造以与同源伴侣形成强碱基配对。例如，序列如基因组a的gcccgg(seqidno:2)和基因组b的ccgggc(seqidno:3)。该序列构造有利于异源性二聚体成对和杂合载体颗粒形成。通过该方式，制剂中杂合载体颗粒(重配体)的所得占比可经修饰，并且可设计为包含多于50％重配杂合颗粒。这在一些情况中是有用的，例如，免疫调节分子与特定抗原一起递送且最好递送至相同宿主细胞时(例如，其中采用需要被共同递送的irf3、cd40、sirna或其它感兴趣的序列时)。优选促进杂合配对的另一示例是以尽可能少的同源二聚体表达tcr-α和β链以供cart生产。本文设想的其它二聚化基序包括gggggg(seqidno:4)和cccccc(seqidno:5)，分别用于a和b。一种或多种a-u碱基配对的添加可用于修改相互作用的结合强度。可用于本文所述的载体的其它二聚化序列对包括gcgcgg(seqidno:7)，与cgcgcc(seqidno:8)配对；gggcgg(seqidno:9)，与cccgcc(seqidno:10)配对。还参见，lu等，2011jmolbiol410:609；baig等，2008retrovirl5:65；moore等，2007jvirol81:4002；moore等，2009aidsrev.11:91；tran等，2015retrovirol12:83。本文的病毒载体和包装系统设想采用其功能是促进一个基因组与另一基因组的所需成对的作用或作为二聚化序列起作用的任何rna序列或序列对。
4.感兴趣的序列(soi)
感兴趣的序列不受任何限制，并且包括普通技术人员希望在靶细胞中转录并表达的任何核酸。通常，感兴趣的序列对于逆转录病毒载体基因组为异源性，然而，在某些实施方式中，感兴趣的序列可编码逆转录病毒蛋白质。该产物可以是蛋白质或核酸。感兴趣序列可以编码蛋白质或核酸分子，包括sirna，微小rna，自互补双链rna(其中互补区长度大于约20个核糖核苷酸)或与信息rna互补的rna，其中所述互补(反义)rna与信息rna的结合阻断其翻译成蛋白质的能力。
在一些情况下，感兴趣序列可以编码抗原，其中针对该抗原的免疫应答是期望的。具体而言，肿瘤抗原，尤其是肿瘤抗原(neoantigen)，和来自诸如hiv、rsv、hbv、hsv、hcv、hpv、百日咳、金黄色酿脓葡萄球菌、疟疾，或结核的媒介物(agent)的感染性疾病抗原是合意的。与许多疾病和病症有关的抗原在本领域中是众所周知的。可预先知道抗原与疾病或病症相关，或可通过本领域已知的任何方法鉴定。例如，患者所患癌症的类型的抗原可能是已知的，例如肿瘤相关抗原或肿瘤抗原，或者可以通过本领域已知的多种方法中的任一种从肿瘤本身鉴定。
肿瘤相关抗原对于多种癌症是已知的，包括例如肉瘤、肾细胞癌、前列腺癌、黑素瘤和乳腺癌。例如，在一些乳腺癌中，her-2受体在癌细胞表面过表达。示例性的肿瘤抗原包括组织分化抗原、突变蛋白抗原、致癌病毒抗原、癌-睾丸抗原和血管或基质特异性抗原。本文中设想采用的肿瘤抗原包括但不限于，任何癌瘤睾丸抗原，任何一种或多种mage肿瘤抗原(例如，magea1、magea2、magea3、magea4、magea10)，bage，rage，和ny-eso-1，其为在睾丸的免疫特权区域中和多种肿瘤细胞中表达的未突变的抗原；种系特异性肿瘤抗原，例如黑素细胞-黑素瘤种系抗原mart-1/melan-a，gp100，gp75，mda-7，酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白，肾细胞癌–5t4，sm22-α，碳酸酐酶i和ix(也称作g250)，缺氧诱导型因子(例如，hif-1α和hif-2α)，vegf或前列腺特异性膜抗原(psma)，前列腺特异性抗原(psa)，前列腺酸性磷酸酯，和前列腺的六跨膜上皮抗原(steap)，nkx3.1，其为在源自相同组织的正常和肿瘤细胞中表达的抗原；源自相比正常细胞在肿瘤细胞中突变的基因或在肿瘤中以不同水平转录的基因的表位蛋白质/肽，例如端粒酶，生存素，间皮素，ssx2(hom-mel-40肿瘤抗原)，突变的ras，bcr/abl重排，her2/neu，egf受体(包括egfrviii突变)，突变的或野生型p53，细胞色素p4501b1，和异常表达的内含子序列例如n-乙酰基葡萄糖胺基转移酶-v；在骨髓瘤和b细胞淋巴瘤中产生独特个体基因型的免疫球蛋白基因的克隆重排；源自致癌病毒加工的表位蛋白质/肽，例如人乳头状瘤病毒蛋白e6和e7；肿瘤选择性表达的非突变的癌胚蛋白，例如癌胚抗原和α-胎蛋白。还设想胚胎转录因子短尾基因(brachyury)作为作为肿瘤相关抗原(参见例如，roselli等，clincancerres.2012年7月，15；18(14):3868-79；hamilton等,seminoncol.2012年6月；39(3):358-66；palena等,jnatlcancerinst.2014年5月9；106(5))。已经综述了许多肿瘤相关抗原(参见例如“t淋巴细胞识别的肿瘤抗原(tumor-antigensrecognizedbyt-lymphocytes)，“boont，cerottinijc，vandeneyndeb，vanderbruggenp，vanpela，annualreviewofimmunology12：337-365,1994；“t细胞识别的人类肿瘤抗原的列表(alistingofhumantumorantigensrecognizedbytcells)”，renkvistn，castellic，robbinspf，parmianig.cancerimmunologyimmunotherapy50:(1)3-152001年3月)。
在一个具体实施方式中，多基因组慢病毒载体制剂表达nyeso1和magea3为感兴趣的序列。在另一实施方式中，多基因组慢病毒载体制剂表达多种mage蛋白，伴随或不伴随免疫调节分子。在一些实施方式中，多基因组慢病毒载体制剂表达magea1，magea3，magea4，magea10和il-12。在另一个实施方式中，除一种或多种肿瘤抗原以外，多基因组慢病毒载体制剂还表达多种mage蛋白，伴随或不伴随免疫调节分子。就此而言，一种或多种肿瘤抗原可来自mage抗原或来自不同的蛋白质。
在某些实施方式中，感兴趣的序列编码一种或多种肿瘤抗原。肿瘤抗原为异常突变的蛋白质，其由癌细胞产生并被免疫系统识别(参见例如，martin等，2015annalsoncol.26:2367-2374；linnemann等，2015naturemedicine21:81-85；kreiter等，nature520,692–696；blood.2014年7月，17；124(3):453–462等)。肿瘤抗原可通过如下方式鉴定：对来自个体的肿瘤和正常组织的dna和rna进行测序，以鉴别肿瘤特异性突变；对个体进行hla分型并预测来自经鉴定的肿瘤抗原的hla结合表位。然后，肿瘤抗原在开放阅读框中合成并用于定制疫苗的制剂中。使用计算机预测和/或基于ms的肿瘤活检hla洗脱肽测序进行高通量测序和表位鉴定，以及免疫测定确认，可以鉴定来自患者的肿瘤抗原，并在定制疫苗中立即使用鉴定的肿瘤抗原。因此，用于产生多基因组载体制剂的本系统尤其适于产生患者特异性多基因组病毒载体制剂，其编码肿瘤抗原或肿瘤抗原多表位盒，以及任选地，伴随其它全长肿瘤抗原和/或免疫调节分子。
抗原也可以是与感染性疾病相关的抗原，例如hiv/aids。抗原可以是，例如，gp120(klimstra,w.b.等，2003.jvirol77:12022-12032；bernard,k.a.等，2000.virology276:93-103；byrnes,a.p.等，1998.jvirol72:7349-7356)。其它示例性抗原包括但不限于：gag、pol、env、tat、nef和rev(lieberman,j.等，1997.aidsreshumretroviruses13(5):383-392；menendez-arias,l.等，1998.viralimmunol11(4):167-181)。
病毒抗原的示例包括但不限于腺病毒多肽，α病毒多肽，杯状病毒多肽，例如杯状病毒衣壳抗原，冠状病毒多肽，瘟热病毒多肽，埃博拉病毒多肽，肠道病毒多肽，黄病毒多肽，肝炎病毒(ae)多肽例如乙型肝炎核心或表面抗原或丙型肝炎病毒e1或e2糖蛋白，核心或非结构蛋白，疱疹病毒多肽例如单纯疱疹病毒或水痘带状疱疹病毒糖蛋白，免疫缺陷病毒多肽例如人类免疫缺陷病毒包膜或蛋白酶，感染性腹膜炎病毒多肽，流感病毒多肽例如a型流感血凝素，神经氨酸酶或核蛋白，白血病病毒多肽，马尔堡病毒多肽，正粘病毒多肽，乳头瘤病毒多肽，副流感病毒多肽，例如血凝素/神经氨酸酶，副粘病毒多肽，细小病毒多肽，瘟病毒多肽，皮诺病毒多肽，例如脊髓灰质炎病毒衣壳多肽，痘病毒多肽，例如牛痘病毒多肽，狂犬病病毒多肽，例如狂犬病病毒糖蛋白g，呼肠孤病毒多肽，逆转录病毒多肽和轮状病毒多肽。
细菌抗原的示例包括但不限于放线菌多肽，芽孢杆菌多肽，拟杆菌多肽，博德特氏菌属多肽，巴尔多氏球菌多肽，疏螺旋体多肽，例如布氏梭菌ospa，布鲁氏菌多肽，弯曲杆菌多肽，噬二氧化碳胞菌多肽，衣原体多肽，梭菌多肽，棒状杆菌多肽，柯克斯体多肽，嗜皮菌多肽，肠球菌多肽，埃利希氏菌多肽，埃希氏菌属多肽，弗朗西斯氏菌多肽，梭杆菌多肽，血巴尔通体多肽，嗜血杆菌多肽，例如流感嗜血杆菌b型外膜蛋白，螺杆菌多肽，克雷伯菌多肽，l-型细菌多肽，钩端螺旋体多肽，李斯特菌多肽，分枝杆菌多肽，支原体多肽，奈瑟氏球菌多肽，新立克次氏体多肽，诺卡氏菌多肽，巴氏杆菌多肽，消化球菌多肽，消化链球菌多肽，肺炎球菌多肽，变形菌多肽，假单胞菌多肽，立克次氏体多肽，罗卡利马体多肽，沙门氏菌多肽，志贺菌多肽，葡萄球菌多肽，链球菌多肽，例如化脓性链球菌m蛋白，密螺旋体多肽和耶尔森氏菌多肽，例如鼠疫耶尔森氏菌f1和v抗原。
真菌抗原的示例包括但不限于：犁头霉菌多肽，支顶孢菌多肽，链格孢菌多肽，曲霉菌多肽，蛙粪霉菌多肽，离蠕孢菌多肽，芽生菌多肽，念珠菌多肽，孢子菌多肽，耳霉菌多肽，隐球菌多肽，弯孢菌多肽，表皮癣菌多肽，嗜热菌多肽，地霉菌多肽，组织胞浆菌多肽，马杜拉分支菌多肽，马拉色菌多肽，小孢霉菌多肽，丛梗孢菌多肽，被孢霉菌多肽，毛霉菌多肽，拟青霉菌多肽，青霉菌多肽，单胞瓶霉菌(phialemonium)多肽，拟盘孢菌多肽，原囊藻多肽，假埃希氏菌多肽，假微结节菌(pseudomicrodochium)多肽，腐霉菌多肽，鼻孢子菌多肽，根霉菌多肽，齿梗孢菌(scolecobasidium)多肽，孢子丝菌(sporothrix)多肽，匍柄霉菌(stemphylium)多肽，毛癣菌多肽，丝孢酵母菌多肽和斑替木丝霉菌(xylohypha)多肽。
原生动物寄生虫抗原的示例包括但不限于：巴贝虫多肽，巴龙盲蝽多肽，贝斯诺虫多肽，隐孢子虫多肽，艾美球虫多肽，脑包内原虫多肽，内阿米巴虫多肽，贾第鞭毛虫多肽，哈蒙虫多肽，肝簇虫多肽，等孢球虫多肽，利什曼虫多肽，微孢子虫多肽，新孢子虫多肽，龙船草多肽，毛滴科五鞭虫多肽，疟原虫多肽，例如卵形疟原虫环子孢子(pfcsp)，子孢子表面蛋白2(pfssp2)，肝脏状态抗原1的羧基末端(pflsaic-末端)和输出蛋白1(pfexp-1)，肺囊原虫多肽，肉孢子虫多肽，血吸虫多肽，泰勒虫多肽，弓形虫多肽和锥虫多肽。
蠕虫寄生虫抗原的示例包括但不限于：棘唇线虫多肽，猫圆线虫多肽，钩虫多肽，管圆线虫多肽，蛔虫多肽，布鲁线虫多肽，仰口线虫多肽，毛细线虫多肽，夏柏特线虫多肽，古柏线虫多肽，齿线虫(crenosoma)多肽，网尾线虫多肽，膨结线虫多肽，双瓣线虫多肽，裂头绦虫多肽，复孔绦虫多肽，恶丝虫多肽，龙线虫多肽，住肠线虫多肽，肺线虫(filaroides)多肽，血矛线虫多肽，兔唇蛔多肽，罗阿丝虫多肽，曼森线虫多肽，缪勒线虫多肽，侏体吸虫多肽，板口线虫多肽，细颈线虫多肽，结节线虫多肽，盘尾丝虫多肽，后睾吸虫多肽，奥斯特线虫多肽，副丝虫多肽，并殖吸虫多肽，副蛔虫多肽，泡翼线虫多肽，原圆线虫多肽，狗尾草(setaria)多肽，螺旋体多肽，迭宫绦虫多肽，冠丝虫多肽，粪线虫多肽，圆线虫多肽，吸吮线虫多肽，弓蛔虫多肽，弓首蛔虫多肽，旋毛虫多肽，毛样线虫多肽，毛首线虫多肽，钩线虫多肽和吴策线虫多肽。
外寄生虫抗原的示例包括但不限于来自下述的多肽(包括保护性抗原以及过敏原)：跳蚤；蜱，包括硬蜱和软蜱；苍蝇，如蠓，蚊，沙蝇，黑蝇，马蝇，角蝇，鹿蝇，采采蝇，舌蝇，厩蝇，引起蝇蛆病的苍蝇和咬人蠓虫；蚂蚁；蜘蛛，虱子；螨虫；和蝽类，比如臭虫和锥蝽。
一旦鉴定并选择了抗原，就鉴定了编码所需抗原的序列。在某些实施方式中，所述序列包含cdna。
在某些情况下，目的序列可以是编码下调分子表达的感兴趣的小抑制rna(sirna)或微小rna(mirna)的基因。例如，编码sirna或微小rna的基因可用于下调细胞中负调节物的表达，包括抑制树突细胞活化或成熟的那些。sirna和微小rna是本领域众所周知的(fire等，nature391:806,1998；还参见，应用生物系统的“rna干扰来源”(“thernainterferenceresource”ofappliedbiosystems),trang等，oncogene增刊2:s52,2008；taganov,k.等，2007.immunity26:133-137；dahlberg,j.e.和e.lund.2007.sci.stke387:pe25；tiemann和rossi,embomolmed1:142,2009)。或者，感兴趣序列可编码自互补双链rna，其中互补区域长度大于约20个核糖核苷酸，或编码大于约20个核糖核苷酸长度的反义rna。本领域普通技术人员将会理解，sirna，mirna，dsrna和反义rna分子可以从rna聚合酶iii启动子表达，或者可以是从rna聚合酶ii启动子转录的非编码rna的组分。
此外，感兴趣序列可编码多于一种产物。在一些构型中，待递送的序列可包含编码下述的多个基因：至少一种蛋白质，至少一种sirna，至少一种微小rna，至少一种dsrna或至少一种反义rna分子或其任何组合。例如，待递送的序列可以包括编码一种或多种抗原的一种或多种核酸，其中对于该一种或多种抗原的免疫应答是期望的。一个或多个抗原可与单一疾病或病症相关联，或者其可与多种疾病和/或病症相关联。在某些实施方式中，soi包含编码免疫调节蛋白的序列。在一些情况下，编码免疫调节蛋白的序列可与编码抗原(其中针对该抗原的免疫应答是期望的)的序列一同包括，并且该组合能够引发免疫应答并调节该免疫应答至所需的方向和幅度。在其它情况中，编码sirna、微小rna、dsrna或反义rna分子的序列可与编码抗原(其中针对该抗原的免疫应答是期望的)的基因一同构建，且该组合能够调节免疫应答的范围。该产物可以作为初始融合产物产生，其中编码序列与一个启动子具有功能性关系。或者，产物可以分开编码，并且各编码序列与启动子为功能性关系。启动子可以相同或不同。
在一些构型中，载体包括编码免疫调节分子的多核苷酸序列。示例性免疫调节分子包括多种细胞因子中的任何一种。本文所用“细胞因子”是由一个细胞群体释放的蛋白质的统称，其作用于另一细胞作为细胞间介导物。这类细胞因子的示例是淋巴因子、单核因子和传统多肽激素。细胞因子包括：生长激素，如人生长激素，n-甲硫氨酰基人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，如促卵泡激素(fsh)，促甲状腺激素(tsh)和黄体生成素(lh)；肝脏生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子-α和-β；苗勒管抑制剂；小鼠促性腺素-相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(tpo)；神经生长因子，如ngf-β；血小板-生长因子；转化生长因子(tgf)，如tgf-α和tgf-β；胰岛素样生长因子-i和-ii；红细胞生成素(epo)；骨诱导因子；干扰素，如干扰素α、β和γ；集落刺激因子(csf)，如巨噬细胞-csf(m-csf)；粒细胞-巨噬细胞-cgp(gm-csp)；粒细胞-巨噬细胞-csf(gm-csf)；和粒细胞-csf(g-csf)；白介素(il)，如il-1至il-36，包括il-1、il-1α、il-2、1l-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-11、il-12、il-15、il-18、il-21、il-23、il-27、tnf；以及其它多肽因子，包括lif和kit配体(kl)。本文设想采用的其它免疫调节分子包括irf3，b7.1，b7.2，4-1bb，cd40配体(cd40l)，药物诱导型cd40(icd40)等。在某些实施方式中，这些多核苷酸通常受控于一种或多种调控元件，其指导编码序列在树突细胞中的表达。
在某些实施方式中，由本文所述的逆转录病毒载体编码的免疫调节分子是检验点抑制剂分子。免疫检验点指免疫系统的多个抑制性通路，其对于维持自身耐受性和调控免疫应答的持续时间和幅度十分重要。肿瘤将某些免疫检验点通路作为免疫耐受的主要机制，特别是针对对肿瘤抗原有特异性的t细胞。(参见，例如，pardoll，2012nature12:252；chen和mellman2013immunity39:1)。本公开内容提供了编码免疫检查点抑制剂的载体。免疫检验点抑制剂包括以统计学显著的方式阻断或抑制免疫系统的抑制性通路的任何试剂。这类抑制剂可包括抗体或其抗原结合片段(其结合并阻断或抑制免疫检验点受体)或结合并阻断或抑制免疫检验点受体配体的抗体。可被靶向用于阻断或抑制的示例性免疫检验点分子包括但不限于，ctla-4、4-1bb(cd137)、4-1bbl(cd137l)、pdl1、pdl2、pd1、b7-h3、b7-h4、btla、hvem、tim3、gal9、lag3、tim3、b7h3、b7h4、vista、kir、2b4(属于cd2分子家族并表达在所有nk、γδ和记忆cd8+(αβ)t细胞上)、cd160(也称作by55)和cgen-15049。免疫检验点抑制剂包括这样的抗体或其抗原结合片段或其它结合蛋白，其结合并阻断或抑制以下一种或多种的活性：ctla-4、pdl1、pdl2、pd1、b7-h3、b7-h4、btla、hvem、tim3、gal9、lag3、tim3、b7h3、b7h4、vista、kir、2b4、cd160和cgen-15049。说明性免疫检验点抑制剂包括特姆单抗(tremelimumab)(ctla-4阻断抗体)、抗ox40、pd-l1单克隆抗体(抗b7-h1；medi4736)、mk-3475(pd-1阻断剂)、尼弗单抗(nivolumab)(抗pd1抗体)、ct-011(抗pd1抗体)、by55单克隆抗体、amp224(抗pdl1抗体)、bms-936559(抗pdl1抗体)、mpldl3280a(抗pdl1抗体)、msb0010718c(抗pdl1抗体)和易普利姆玛/伊匹单抗(抗ctla-4检验点抑制剂)。
在某些实施方式中，由慢病毒载体基因组表达的感兴趣的序列是嵌合抗原受体(car)(也称作嵌合t细胞受体)或重组t细胞受体，包括单一链或可溶性t细胞受体。在某些实施方式中，对靶t细胞的活化和共同刺激由包含胞质信号转导结构域(例如，ζ链信号转导结构域，具有或没有共刺激信号转导区域)和靶特异性抗原结合结构域的单一嵌合t细胞受体。本文的嵌合抗原受体还包含跨膜(tm)结构域，以将其锚着至t细胞表面。该tm可源自cd3ζ链或可源自另一跨膜分子，例如cd28或cd4。本领域技术人员将会意识到的是，可以使用能够正确工作的任何tm结构域以将嵌合受体锚着至膜。嵌合t细胞受体在已用本文所述的表达嵌合t细胞受体的慢病毒载体颗粒转导的t淋巴细胞中合适地产生。说明性的嵌合抗原受体描述于，例如，美国专利7,741,465；5,843,728；7,446,190；6,392,013；7,994,298；8,252,914；6,410,319；7,446,179；7,265,209；和公开申请us20130288368，wo2012/079000和wo2012/129514。
在另一实施方式中，感兴趣的序列编码"结合结构域"或"结合区域"或“结合元件”。本发明中，结合结构域可以是，例如，能够特异性识别并结合至生物分子(例如，细胞表面受体或肿瘤相关蛋白或其组分)的任何蛋白质，多肽，寡肽或肽。结合结构域包括对于感兴趣的生物分子的任何天然产生的、合成的、半合成的，或重组产生的结合伴侣。例如，结合结构域可以是抗体轻链和重链可变区，或该轻链和重链可变区可在单一链中以任一取向(例如，vl-vh或vh-vl)接合在一起。已知用于鉴定特异性地结合具体的靶标的本发明的结合结构域的多种试验，包括western印迹，elisa，流式细胞术，或表面等离子体共振分析(例如，采用biacore.tm.分析)。
在某些实施方式中，待通过结合结构域结合的靶分子可以是细胞表面表达的蛋白质，例如受体(例如，免疫检验点分子)或肿瘤抗原。在另一实施方式中，本文可用的通过结合结构域结合的靶分子是可溶抗原，例如细胞因子，白蛋白，或其它血清蛋白。说明性的结合结构域包括免疫球蛋白抗原结合结构域，例如scfv，sctcr，受体的胞外结构域，针对细胞表面分子/受体的配体，或其受体结合结构域，和肿瘤结合蛋白。在某些实施方式中，抗原结合结构域可以是scfv，vh，vl，结构域抗体变体(dab)，骆驼抗体(vhh)，纤连蛋白3结构域变体，锚蛋白重复序列变体和源自其它蛋白质支架的其它抗原特异性结合结构域。
可以包括编码可检测产物(通常是蛋白质)的序列以允许鉴定表达所需产物的细胞。例如，将荧光标志物蛋白如绿色荧光蛋白(gfp)与感兴趣序列(例如，编码抗原的序列)一起纳入构建体中。在其它情况下，蛋白质可以被抗体检测到，或者蛋白质可以是作用于底物以产生可检测产物的酶，或是允许对转染或转导的靶细胞进行选择的产物，例如赋予耐药性，如潮霉素抗性。典型的选择基因编码赋予对下述耐受的蛋白质：适用于真核细胞的抗生素或其它毒素(例如新霉素，甲氨蝶呤，杀稻瘟菌素等本领域已知的)或其它补体营养缺陷，或者从培养基中扣除的关键营养素供应。可选择标志物可以任选地存在于单独的质粒上并通过共转染引入。
如他处所述，本文所述的用于产生重配逆转录病毒载体的方法意在克服载体中多顺反子表达单元的某些限制。然而，在某些实施方式中，可能期望使用一种或多种多顺反子表达单元，所述一种或多种多顺反子表达单元包括在包装细胞中生产所需病毒所必需的两种或更多种元件(例如，一种或多种感兴趣的序列，包膜)。在某些实施方式中，多顺反子表达单元可包括在病毒载体基因组中。多顺反子载体的使用减少了所需的核酸分子的总数，并因此避免了与来自多个载体基因组的协同表达相关的可能困难。在多顺反子载体中，待表达的各种元件与一个或多个启动子(和必要时的其它表达控制元件)可操作地连接。在一些构型中，多顺反子载体包含感兴趣序列，编码报道产物的序列和病毒元件。感兴趣的序列通常编码抗原，免疫调节分子，或一种或多种抗原和一种或多种免疫调节分子的组合。有时，多顺反子载体包含编码抗原的基因，编码免疫调节分子的基因。
在多顺反子表达载体中表达的各组分可以例如通过内部核糖体进入位点(ires)元件或病毒2a元件分开，以允许来自相同启动子的各种蛋白质的分开表达。ires元件和2a元件是本领域已知的(美国专利号4,937,190；defelipe等.2004.traffic5:616-626)。在一个实施方式中，编码弗林蛋白酶切割位点序列(rakr)的寡核苷酸(fang等，2005.nat.biotech23:584-590)连接来自马鼻炎a病毒(erav)、明脉扁刺蛾β四体病毒(tav)和手足口病病毒(fmdv)的2a样序列(szymczak等，2004.nat.biotechnol.22:589-594)，用于分离多顺反子载体中的遗传元件。使用标准方法通过检测每种基因的表达可以容易地测试特定多顺反子载体的功效。
在具体的例子中，病毒载体基因组包含：巨细胞病毒(cmv)增强子/启动子序列；来自hiv5'ltr的r和u5序列；包装序列(ψ)；rre，hiv-1cppt/cts(dna侧翼)信号；内部增强子；内部启动子；感兴趣基因；土拨鼠肝炎病毒应答元件；trna琥珀抑制子序列；缺失其增强子序列的u3元件；鸡β-球蛋白绝缘子；和3'hivltr的r和u5序列。在一些示例中，载体基因组包含完整的慢病毒5'ltr和自灭活的3'ltr。(iwakuma等，virology15:120，1999)。
载体基因组的构建可使用本领域已知的任何合适的基因工程技术来完成，包括但不限于限制性内切核酸酶消化，连接，转化，质粒纯化和dna测序的标准技术，例如sambrook等，(1989.《分子克隆：实验室手册》(molecularcloning:alaboratorymanual).冷泉港实验室出版社，纽约),coffin等(《逆转录病毒》(retroviruses).冷泉港实验室出版社，纽约(1997))和《rna病毒：实践方法》(rnaviruses:apracticalapproach)(alanj.cann编，牛津大学出版社(2000)。
本文所述的任何感兴趣序列可包含感兴趣的序列的野生型形式的变体，其可为核苷酸序列或氨基酸序列，或两者。
对于多核苷酸序列(例如，包装系统中所用的dna/cdna质粒，rna基因组序列等)，多核苷酸变体可包含一个或多个取代、添加、缺失和/或插入，从而相对于由该多核苷酸序列编码的参比多肽，由变体多核苷酸编码的多肽的生物功能不显著减少。例如，某些多基因组慢病毒载体制剂可包括编码免疫调节分子的序列。编码免疫调节分子的多核苷酸序列的变体可包含一个或多个取代、添加、缺失和/或插入，从而，优选地，相对于由该多核苷酸序列编码的参比免疫调节分子，由此编码的分子的免疫调节活性不显著减少。就此而言，所述多核苷酸编码的多肽所具有的生物活性(例如，免疫调节活性)水平为参比多肽序列的至少约50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％。作为非限制性示例，免疫调节蛋白可为il-12。il-12活性可采用本领域普通技术人员已知的试验检测。变体il-12多肽的活性可经检测并与野生型il-12蛋白做比较。
在某些实施方式中，该变体可以是密码子优化的变体多核苷酸序列，其编码与参比蛋白质相同的蛋白质。
在另一实施方式中，变体可以是参比序列的不规则变化的(heteroclitic)类似物(参见例如，美国专利8741576)。不规则变化的表位是经修饰的t细胞表位，其诱导的t细胞应答强于由天然表位诱导的那些。不规则变化的类似物定义为对特定t细胞具有增加的刺激能力或功力的肽(或全长蛋白质中的表位)，由对于给定剂量增加的响应来度量，或由获得相同响应所需的量更少来度量。
临床应用中，与采用不规则变化的类似物相关联的益处如下。第一，通过逆转t细胞无反应性状态，激活t细胞的非耐受交叉反应性克隆，或通过介导"免疫偏差"，即，产生的ctl类型(例如th1或th2)，不规则变化的类似物能够突破/克服耐受性。近期研究显示，不规则变化的类似物是免疫原性的(zaremba等，cancerresearch,57:4570(1997)；rivoltoni等，cancerresearch,59:301(1999)；selby等，162(2):669(1999))其中它们能够诱导识别内源性加工表位的ctl。这通过在不同免疫学系统中进行的研究而被证实(zugel等，j.immunol.，161:1705(1998)，wang等，j.exp.med.，190:983(1999)，men等，j.immunol.，162:3566，(1999))。例如，zugel等的研究(zugel等，同上)显示，成年小鼠中，t细胞对于免疫显性t细胞表位的耐受可通过采用肽的不规则变化的交叉反应性肽类似物的免疫来克服。
在某些实施方式中，所述变体是免疫原性变体，其中，多核苷酸变体将包含一个或多个取代、添加、缺失和/或插入，从而，优选地，相对于由参比序列编码的多肽，由所述变体多核苷酸编码的多肽的免疫原性不显著减少。
在某些实施方式中，本文所述的多核苷酸，例如，多核苷酸变体，编码与参比多肽序列(例如，可获自公共序列数据库的肿瘤抗原序列)具有免疫学交叉反应性的多肽。在其它实施方式中，所述多核苷酸编码的多肽所具有的免疫原性活性水平为参比多肽序列的至少约50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％。
因此，在本发明的某些实施方式中，对于本文所述的感兴趣的序列的变体和/或衍生物的制剂，采用诱变方法，例如位点特异性诱变。通过该方法，可以通过诱变编码它们的潜在多核苷酸对多肽序列进行特异性修饰。该技术提供了直接的方法来制备和测试序列变体，例如，通过将一个或多个核苷酸序列变化引入到多核苷酸中，引入一个或多个前述考虑。
位点特异性诱变允许使用编码所需变体的dna序列的特定寡核苷酸序列以及足够数量的相邻核苷酸，以提供大小和序列复杂性足以在横跨序列两侧形成稳定双链体的引物序列，从而产生变体。可以在选择的多核苷酸序列中使用突变以改进、改变、降低、修饰或以其它方式改变多核苷酸自身的性质，和/或改变编码的多肽的性质、活性、组成、稳定性或一级序列。
在本发明的某些实施方式中，发明人设想对感兴趣的序列进行诱变，以改变编码的多肽的一种或多种性质，例如多肽疫苗的免疫原性。位点特异性诱变技术是本领域熟知的，并且广泛用以产生多肽和多核苷酸的变体。例如，位点特异性诱变常用于改变dna分子的特定部分。
c.多基因组病毒载体制剂的生产
一般而言，用于产生本文所述的逆转录病毒载体颗粒的方法为本领域已知的标准方法，不同之处在于，为了产生包含杂合(重配)逆转录病毒颗粒的多基因组病毒载体制剂，所述包装系统将包括至少两种不同的病毒载体基因组质粒(参见例如，图1)。由于逆转录病毒形成基因组重配体的倾向性，假设所得的载体制剂包含所有可能的纯合与杂合载体颗粒的混合物。
如本文他处所述，在某些实施方式中，本文设想采用至少两种不同的病毒载体基因组质粒包含缺陷型的逆转录病毒基因组。换言之，逆转录病毒(例如，慢病毒)载体基因组不包含功能性gag/pol开放阅读框。因此，在某些实施方式中，合适的载体基因组不编码功能性gag蛋白或功能gag或pol蛋白。在某些实施方式中，合适的载体基因组不编码功能性gag、pol或env蛋白。
通过改变生产步骤过程中输入质粒的相对量，本发明允许有效控制纯合与杂合载体基因组在多基因组病毒载体颗粒制剂中的最终比率。同样地，总输出基因组分布可通过改变生产步骤过程中输入质粒的相对量来控制。这些概念汇总于下表1、表2和表3。如他处所述，对于两种(或更多种)不同的感兴趣的序列表达的最终控制无法采用多顺反子载体(尤其是以现成方式)而可靠地实现。
*也≈输出载体基因组
*这是在，例如，实施例中所述的基因特异性qrt-pcr试验中生成的值。理论上，输出基因特异性基因组分布应等于输入质粒分布，留意试验的变异性和限制。
**这是包含任何给定输入基因组的载体颗粒的理论百分比。
因此，采用本文所述的病毒载体包装系统，可使用两种或更多种不同的病毒载体基因组。就此而言，可向包装系统添加各种不同比率的2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多种不同的病毒载体基因组质粒，以获得所需的多基因组逆转录病毒载体制剂。在某些实施方式中，可向包装系统添加各种不同比率的2-9，2-8，2-7，2-6，2-5，2-4，3-9，3-8，3-7，3-6，3-5，3-4，4-9，4-8，4-7，4-6，或4-5种不同的病毒载体基因组质粒，以获得所需的多基因组逆转录病毒载体制剂。
在某些实施方式中，不同的病毒载体基因组除感兴趣的序列以外是相同的。就此而言，病毒载体基因组将具有用于各感兴趣的序列的相同启动子。在其它实施方式中，不同的病毒载体基因组中的一种或多种可具有不同的启动子。因此，在某些实施方式中，不同的启动子可用于不同的感兴趣的序列。启动子和表达控制序列是本领域技术人员已知的，并且在本文他处更详细地描述。
此外，如本文他处更详细地描述(参见部分b.慢病毒载体基因组，子部分3.二聚体起始位点(dis)序列)，本发明提供其它益处：通过修饰各逆转录病毒载体基因组的二聚体起始信号以促进纯合相互作用或杂合相互作用，能够控制杂合或纯合载体颗粒在任何给定多基因组制剂中的占比。此外，本发明提供如下益处：能够控制输入载体基因组的特定配比。因此，在某些实施方式中，多于两种不同的病毒载体基因组质粒可用于本文所述的包装系统。例如，其中两种或更多种包含dis序列以促进特定的成对事件(以及由此获得的特定的纯合或杂合病毒载体颗粒)的2，3，4，5，6，7，8，9，10或甚至更多种不同的载体基因组质粒可用于本文所述的包装系统。
因此，本发明允许快速构建现成的，半定制和定制的癌症疫苗，该癌症疫苗相比现有技术中构建带载体的(vectored)癌症疫苗的方法具有优越的免疫原性和保护宽度。
来自多基因组逆转录病毒载体制剂的多种转基因的表达解决了多顺反子载体的克隆的问题，多顺反子载体的克隆要求对感兴趣的转基因在转移载体基因组中的定位最优化。多基因组病毒载体可通过用包含各自表达不同转基因的多种逆转录病毒转移载体(逆转录病毒基因组)的质粒的混合物转染生产细胞/包装细胞来产生。
本发明允许基于载体混合物制造定制癌症疫苗，该载体混合物通过采用现成转移载体的多重质粒转染产生。这还允许产生由不同的转基因组成的疫苗，其作用机制受益于在相同细胞中的体内共同表达。
如本文所述，采用本文所述的方法产生的病毒载体的混合群可称作“多基因组”病毒载体或多基因组病毒载体制剂。这有助于将本文载体和简单地采取两种病毒载体制剂并在其生产后即刻将其混合在一起的做法相区分。本领域技术人员应清楚，这样的混合的病毒载体制剂不包含任何杂合病毒颗粒。本文所述的多基因组病毒载体，如上所述，可包含颗粒的混合物，一些包含纯合基因组且一些包含杂合基因组。可采用本发明产生病毒载体的各种多基因组群(参见，例如，作为非限制性示例，表1和2)。所述多基因组病毒载体制剂可包含各种比率的纯合与杂合病毒载体颗粒，这取决于所用的输入载体基因组(例如，采用不同二聚体起始信号序列以促进纯合或杂合相互作用或通过采用全部包含相同dis序列的不同的病毒载体基因组并通过修改包装系统中所用的输入载体基因组质粒的量来控制输出群)。在包装系统中采用两种载体基因组(载体基因组a和b)的一个实施方式中，输出多基因组制剂可包含这样的颗粒，所述颗粒含有aa纯合基因组、bb纯合基因组(各以特定比率存在)，并且还包含ab杂合颗粒(以特定比率存在)。在另一实施方式中，输出多基因组制剂可包含至少约50％含有纯合基因组(aa和bb纯合基因组)的颗粒，且包含约50％ab杂合颗粒。在某些实施方式中，输出多基因组制剂可包含至少约60％含有纯合基因组(aa和bb纯合基因组)的颗粒，且包含约40％ab杂合颗粒。在某些实施方式中，输出多基因组制剂可包含至少约70％含有纯合基因组(aa和bb纯合基因组)的颗粒，且包含约30％ab杂合颗粒。在某些实施方式中，输出多基因组制剂可包含至少约80％含有纯合基因组(aa和bb纯合基因组)的颗粒，且包含约20％ab杂合颗粒。
在某些实施方式中，可能期望在多基因组病毒载体制剂中具有尽量高百分比的杂合颗粒。就此而言，本发明提供多基因组病毒载体制剂和用于产生包含至少60％杂合病毒载体颗粒的多基因组病毒载体制剂的方法。在某些实施方式中，本发明提供包含约50％至约99％杂合病毒载体颗粒的多基因组病毒载体制剂。在另一实施方式中，本发明提供包含至少约50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或甚至100％杂合病毒载体颗粒的多基因组病毒载体制剂。在某些实施方式中，本发明提供包含约40％至约80％，约45％至约75％，约50％至约70％，或约55％至约65％杂合病毒载体颗粒的多基因组病毒载体制剂。如本文所述，本发明提供特定的病毒载体基因组、用于制造混合型病毒载体制剂的方法和包装系统，所述混合型病毒载体制剂包含多个百分比的本文所述的杂合病毒载体颗粒。
在某些实施方式中，多基因组病毒载体制剂通过如下方式表征：度量与具体制剂的总基因组效价相比的具体特定基因组的百分比(参见例如，实施例1)。就此而言，在某些实施方式中，本发明提供多基因组病毒载体制剂，其在该制剂中包含约2％至约95％的特定基因组。在某些实施方式中，所述多基因组病毒载体制剂可在该制剂中包含约5％至约70％，约10％至约60％，约15％至约50％的特定基因组。取决于输入载体基因组质粒的数量和其所用的各个比率，最终多基因组慢病毒载体制剂中具体的特定基因组的百分比将不同(参见例如，表2和3)。
多基因组病毒载体制剂可包含具有本文所述的感兴趣的序列的任何组合的载体基因组。作为非限制性示例，多基因组病毒载体制剂可采用三种不同的病毒载体基因组制备，其各编码不同的肿瘤抗原，且还包括编码免疫调节分子的一种或多种病毒载体基因组。用以产生多基因组病毒载体制剂的病毒载体基因组的组合的说明性示例包括但不限于：1)lv-nyeso1，lv-magea3，lv-magea10，lv-scfv抗ctla4；2)lv-nyeso1，lv-magea3，lv-magea10，lv-il12；3)2)lv-nyeso1，lv-magea3，lv-magea10，lv-il23；4)lv-ny-eso-1，lv-magea3，lv-magea10，lv-cd40；5)lv-magea1，lv-magea3，lv-magea4，lv-magea10；6)lv-nyeso1，lv-magea3，lv-magea10，lv-scfv抗pd1；7)lv-nyeso1，lv-magea3，lv-magea10，lv-scfv抗pdl1；8)lv-nyeso1，lv-magea3，lv-magea10，lv-scfv抗pdl1，lv-scfv抗ctla4。
在某些实施方式中，多基因组病毒载体制剂可采用各编码不同的肿瘤抗原的四种或更多种不同的病毒载体基因组制得，伴有或不伴有编码免疫调节分子的一种或多种病毒载体基因组。用于产生多基因组病毒载体制剂的病毒载体基因组的组合的示例性示例包括但不限于：多种mage蛋白，伴有或不伴有免疫调节分子(例如，magea1、magea3、magea4、magea10，伴有或不伴有il-12)。
在某些实施方式中，多基因组病毒载体制剂可采用各编码不同的肿瘤抗原的多种不同的病毒载体基因组，各编码一种或多种肿瘤抗原的一种或多种病毒载体基因组制得，伴有或不伴有编码免疫调节分子的一种或多种病毒载体基因组。作为非限制性示例，用以产生多基因组病毒载体制剂的病毒载体基因组的组合包括但不限于：1)除一种或多种肿瘤抗原以外，多种mage蛋白质，伴有或不伴有免疫调节分子(例如，以下任意组合：一种或多种magea1、magea3、magea4、magea10、包含多种肿瘤抗原的肿瘤抗原盒(neoantigencassette)，伴有或不伴有il-12)。
本领域技术人员应理解，所述多基因组病毒载体制剂将包含不同的杂合和纯合病毒颗粒的混合物(参见例如，表2，其描述了采用三种病毒载体基因组的制剂中的不同可能的颗粒)。
在某些实施方式中，混合的病毒载体颗粒制剂包含一种或多种杂合病毒载体颗粒，其中，所述杂合病毒载体颗粒包含编码抗原的病毒载体基因组和编码免疫调节分子的病毒载体基因组。作为另一个非限制性示例，在一个实施方式中，杂合病毒载体颗粒包含编码第一抗原的第一载体基因组，和编码第二抗原的第二载体基因组，其中，第二抗原不同于第一抗原。在某些实施方式中，杂合病毒载体颗粒包含编码全长肿瘤抗原的第一载体基因组，和编码一种或多种肿瘤抗原或肿瘤抗原表位的盒的第二载体基因组。在另一实施方式中，杂合病毒载体颗粒包含编码抗原的第一载体基因组和编码检验点抑制剂分子的第二载体基因组。在另一个实施方式中，杂合病毒载体颗粒包含编码抗原的第一载体基因组和编码tlr激动剂的第二载体基因组。
本领域已知的多种方法中的任一种均可用于产生慢病毒颗粒，其基因组包含病毒载体基因组的rna拷贝，如本文所述。在一个方法中，将他处所述的两种或更多种病毒载体基因组引入包装细胞系，该包装细胞系包含包装病毒基因组rna所需的全部组分，由病毒载体基因组转录成为病毒颗粒。或者，除了一个或多个感兴趣序列之外，病毒载体基因组可以包含编码病毒组分的一个或多个基因。然而，为了防止该基因组在靶细胞中复制，通常将复制所需的内源性病毒基因去除并且其在包装细胞系中以反式分开提供。
通常，逆转录载体颗粒由采用一种或多种质粒载体转染的细胞系产生，所述一种或多种质粒载体包含产生颗粒所需的组分。将各自编码感兴趣的蛋白质(例如，全长抗原或免疫调节剂或肿瘤抗原表位盒)的两种或更多种不同的载体基因组质粒(以预定比率)混合，随后与编码形成载体颗粒的蛋白质的其它恒常质粒一起转染生产细胞。
这些载体颗粒通常不具有复制能力，即，它们仅能够进行单一轮的感染。通常来说，利用多种质粒载体将生成慢病毒载体颗粒的各种遗传组分分开，主要是为了减少重组事件的机会，否则这些重组事件可能生成具有复制能力的病毒。然而，如果需要，可以使用具有所有逆转录病毒组分的单个质粒载体。作为使用多质粒载体的系统的一个示例，细胞系用含有病毒载体基因组(即载体基因组质粒)的至少两种质粒转染，包括ltr、顺式作用包装序列和一种或多种感兴趣的序列(其通常操作性地连接至异源启动子)、编码病毒酶促和结构组分的至少一种质粒(即，编码诸如gag和pol等组分的包装质粒)，以及编码包膜糖蛋白的至少一种包膜质粒。如本文所述和本领域已知的，可以使用其它质粒来增强逆转录病毒颗粒产生，例如rev-表达质粒和/或vpx表达质粒。病毒颗粒出芽(bud)穿过细胞膜，并且包括这样的核心，该核心包含含有感兴趣的序列的基因组，和靶向树突细胞的包膜糖蛋白。当包膜糖蛋白是辛德毕斯病毒e2糖蛋白时，与参比株hr相比，糖蛋白被工程改造以减少与硫酸乙酰肝素的结合。
用本公开的质粒载体转染包装细胞可以通过众所周知的方法实现，并且待使用的方法不受任何限制。本领域已知许多非病毒递送系统，包括例如，电穿孔、包括脂质体的基于脂质的递送系统、“裸”dna的递送和使用聚环糊精化合物的递送，如schatzleinag所述的那些(2001.《癌症基因疗法中的非病毒载体：原则和进展》(non-viralvectorsincancergenetherapy:principlesandprogresses).anticancerdrugs)。通常使用阳离子脂质或盐处理方法，参见例如graham等(1973.virol.52:456；wigler等(1979.proc.natl.acad.sci.usa76:1373-76)。最常使用的是磷酸钙沉淀方法。然而，也可以使用将载体导入细胞的其它方法，包括核显微注射和细菌原生质融合。
如本文中于表1、2、3和实施例进一步所述，对于多基因组逆转录病毒载体制剂中所需的各基因组而言，输入逆转录病毒基因组质粒的比率可根据所需输出而不同。
包装细胞系提供一些组分，包括病毒调节和结构蛋白，这些组分是将病毒基因组rna包装到逆转录病毒载体颗粒时以反式形式(intrans)需要的。包装细胞系可以是能够表达逆转录病毒蛋白并产生功能性逆转录病毒载体颗粒的任何细胞系。一些合适的包装细胞系包括293(atcccclx)、293t、hela(atccccl2)、d17(atccccl183)、mdck(atccccl34)、bhk(atccccl-10)和cf2th(atcccrl1430)细胞。包装细胞系可以稳定地表达必需病毒蛋白。此类包装细胞系描述于，例如，美国专利号6,218,181。或者，可用编码一种或多种必需病毒蛋白的核酸分子以及病毒载体基因组瞬时转染包装细胞系。收集获得的病毒颗粒，并用于感染靶细胞。通常将编码包膜糖蛋白的基因克隆到诸如pcdna3(英杰公司(invitrogen)，美国加利福尼亚州)的表达载体中。真核细胞表达载体为本领域所熟知，并且可从许多商业来源获得。然后，将诸如293t细胞的包装细胞用编码感兴趣的序列的病毒载体基因组、编码病毒包装组分的至少一种质粒和用于靶分子表达的载体共同转染。包膜在包装细胞的膜上表达，并且被纳入病毒载体。
在一种情况下，如本文所述，使用一种或多种载体将多核苷酸序列引入包装细胞系中以制备用vsvg包膜或辛德毕斯病毒包膜糖蛋白例如e2假型化的逆转录病毒载体颗粒。所述载体可包含编码病毒的不同组分(包括vsvg或辛德毕斯病毒包膜)的多核苷酸序列，载体基因组质粒，其各包含一种或多种感兴趣的序列(例如，抗原或其它感兴趣的序列)，和生产不由包装细胞提供的病毒所需的任何组分。
而在其它情况中，包装细胞采用编码感兴趣的蛋白质的至少两种病毒载体基因组和一种或多种其它载体共同转染。例如，除了包含一种或多种感兴趣的序列(且任选地，一种或多种其它感兴趣序列)的病毒载体基因组以外，第二载体携载编码包膜蛋白(例如vsvg包膜或经修饰的(也称作变体)辛德毕斯病毒包膜)的基因。在一些情况下，包含病毒载体基因组的质粒包括编码其它所选免疫调节分子的多核苷酸序列，所述免疫调节分子包括但不限于：趋化因子、细胞因子、dc成熟因子或调节免疫检验点机制的因子。
在某些实施方式中，包装系统是所谓第四代包装系统，从而gag-pol基因进一步分开处于两种分开的质粒上。所述系统是本领域已知的，并且描述于例如美国专利6365150，6955919，7311907和8034620。所述包装系统还可商购自，例如，clontech/takara公司(加利福尼亚州圣迭戈)。在某些实施方式中，pol基因可融合至vpr，以确保逆转录酶/整合酶蛋白向重组病毒颗粒中的运输。
在某些实施方式中，包装系统如wo2013/149167或wo2011/011584中所描述。
在一些或任何实施方式中，本文所述的逆转录病毒载体颗粒包含samhd1抑制剂。在某些实施方式中，samhd1抑制剂是vpx蛋白或vpr蛋白。在某些实施方式中，本文所述的逆转录病毒载体颗粒包含vpx蛋白或其变体(参见例如wo2013/149167)。在一些或任何实施方式中，变体保留抑制samhd1的能力。
在一些实施方式中，逆转录病毒载体采用虫媒病毒包膜糖蛋白(例如辛德毕斯包膜蛋白)假型化。辛德毕斯病毒包膜蛋白含有四种n-连接的聚糖，两种在e2蛋白上，两种在e1蛋白上。在没有甘露糖苷酶i抑制剂的哺乳动物细胞中产生的病毒的两种n-聚糖具有高甘露糖结构(一个e2n连接的聚糖和一个e1n连接的聚糖)，而剩下的两种具有复杂的结构。两种复杂结构n-聚糖暴露于包膜蛋白的表面，而两种高甘露糖结构n-聚糖掩埋在包膜蛋白三聚体的中心。具有复合n-连接聚糖的辛德毕斯病毒颗粒不像具有不太复杂、高度甘露糖化的糖蛋白的颗粒那样有效地结合dc-sign。
在某些实施方式中，病毒颗粒在甘露糖苷酶i抑制剂如几夫碱(kifunensine)(参见例如wo2013/149167)存在下在哺乳动物细胞中产生。因此，在一些或任何实施方式中，病毒包装细胞在甘露糖苷酶i抑制剂存在下培养。在一些或任何实施方式中，甘露糖苷酶i抑制剂是几夫碱。在一些实施方式中，几夫碱以约0.01μg/ml至约1mg/ml、约0.1μg/ml至约10μg/ml、约0.1μg/ml至约9μg/ml、约0.1μg/ml至约8μg/ml、约0.1μg/ml至约7μg/ml、约0.1μg/ml至约6μg/ml、约0.1μg/ml至约5μg/ml、约0.1μg/ml至约4μg/ml、约0.1μg/ml至约3μg/ml、约0.1μg/ml至约2μg/ml、约0.1μg/ml至约1μg/ml、约0.25μg/ml至约10μg/ml、约0.25μg/ml至约9μg/ml、约0.25μg/ml至约8μg/ml、约0.25μg/ml至约7μg/ml、约0.25μg/ml至约6μg/ml、约0.25μg/ml至约5μg/ml、约0.25μg/ml至约4μg/ml、约0.25μg/ml至约3μg/ml、约0.25μg/ml至约2μg/ml或约0.25μg/ml至约1μg/ml的浓度存在于培养基中。
在其中假型化的逆转录病毒载体颗粒包含辛德毕斯病毒e2糖蛋白和vpx蛋白的一些或任何实施方式中，逆转录病毒颗粒在甘露糖苷酶i抑制剂存在下产生。在一些实施方式中，甘露糖苷酶抑制剂是脱氧芒硝吉米霉素(dmnj)。在优选的实施方式中，甘露糖苷酶抑制剂是几夫碱。在一些实施方式中，dmnj以约1.0μg/ml至约1.0mg/ml、约1.0μg/ml至约900μg/ml、约1.0μg/ml至约800μg/ml、约1.0μg/ml至约700μg/ml、约1.0μg/ml至约600μg/ml、约1.0μg/ml至约500μg/ml、约1.0μg/ml至约400μg/ml、约1.0μg/ml至约300μg/ml、约1.0μg/ml至约200μg/ml、约1.0μg/ml至约100μg/ml、约50μg/ml至约500μg/ml、约50μg/ml至约400μg/ml、约50μg/ml至约300μg/ml、约50μg/ml至约200μg/ml、约50μg/ml至约100μg/ml、约100μg/ml至约500μg/ml、约100μg/ml至约400μg/ml、约100μg/ml至约300μg/ml、约100μg/ml至约200μg/ml、约200μg/ml至约500μg/ml或约200μg/ml至约400μg/ml的浓度存在于培养基中。
在一些或任何实施方式中，在甘露糖苷酶i抑制剂(例如几夫碱)存在下产生的假型化的逆转录病毒载体颗粒包含包膜糖蛋白(例如辛德毕斯病毒e2)，其中至少60％的n-连接聚糖包含甘露糖(man5)、man6、man7、man8和/或man9结构。在一些实施方式中，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的n-连接聚糖包含man5、man6、man7、man8和/或man9+结构。
在一种情况下，如本文所述，使用一种或多种载体将多核苷酸序列引入包装细胞系中以制备用辛德毕斯病毒包膜糖蛋白例如e2假型化的逆转录病毒载体颗粒。在一些实施方式中，逆转录病毒载体颗粒是高度甘露糖基化的。在一些实施方式中，逆转录病毒载体颗粒还包含vpx蛋白或其变体。而在其它实施方式中，逆转录病毒载体颗粒高度甘露糖化并且包含vpx蛋白或其变体。载体可含有编码病毒各种组分的多核苷酸序列，所述组分包括辛德毕斯病毒包膜、感兴趣序列(通常编码抗原)，以及包装细胞未提供的产生病毒所必需的任何组分。
病毒包膜蛋白的糖基化谱可以通过本领域已知的任何方法确定。例如，可以比较用糖苷酶(例如endoh或pngasef)处理或未处理的病毒糖蛋白上的凝胶移位测定。其它方法包括从病毒糖蛋白中切割聚糖，并通过hplc和质谱法分离和鉴定组分。
如本文所述测量病毒的生产并以iu/体积表示。iu是感染单位，或者是转导单位(tu)；iu和tu可互换使用，作为病毒载体颗粒制备的滴度的定量测量。如本文所述，产生其中基因组可以表达容易度量的产物的病毒。优选荧光蛋白(绿色荧光蛋白)。逆转录病毒载体通常是非整合的。然后将该病毒给予靶细胞，并且例如通过流式细胞术确定表达gfp的靶细胞的数量。然后计算滴度。滴度优选尽可能高，但为至少1×105iu/ml细胞上清液，至少3×105iu/ml细胞上清液，至少1×106iu/ml细胞上清液，至少3×106iu/ml细胞上清液或至少1×107iu/ml细胞上清液(在任何浓集之前)。或者，滴度为具有vsv-g包膜的相同细胞中假型化的相同逆转录病毒载体的滴度的至少80％，至少90％，至少95％，至少100％。
在某些实施方式中，病毒的生产度量为基因组/ml。基因组可采用本领域已知的多种方法度量，例如rt-pcr，pcr，qpcr，qdd(数字微滴)pcr和rnascope或dnascope。
可采用多种方法来确定本文所述的包含重配体的具体逆转录病毒载体颗粒制剂的组成。例如，可采用基因特异性qrt-pcr，其基于对病毒载体制剂中存在的各感兴趣的序列具有特异性的引物组。在某些实施方式中，可采用基因特异性qrt-pcr与流式细胞术的组合。也可采用其它单细胞方法，例如数字微滴pcr(参见例如，bio-radqx-100rt-ddpcr系统，bio-rad公司，加利福尼亚州赫拉克勒斯)；还参见hindsonbj等(2011).用于对dna拷贝数进行绝对定量的高通量微滴数字pcr系统(high-throughputdropletdigitalpcrsystemforabsolutequantitationofdnacopynumber).analchem83(22):8604–8610；pinheirolb等(2012).用于dna拷贝数定量的微滴数字聚合酶链式反应形式的评价(evaluationofadropletdigitalpolymerasechainreactionformatfordnacopynumberquantification).analchem84,1003–1011)。其它方法包括rnascope和dnascope(先进细胞诊断学公司(advancedcelldiagnostics,inc.)，加利福尼亚州纽瓦克市)(参见例如，deleage等,pathogensandimmunity2016spring；1(1):68-106；wang等,jmoldiagn.2012；14(1):22-9；player等,jhistochemcytochem.2001；49(5):603-12)。用于确定具体病毒载体制剂或病毒颗粒或转导的细胞的纯合与杂合组成的这些和其它方法是本领域已知的。
d.病毒的递送
包含多基因组病毒载体制剂的组合物可以任何方式被递送至靶细胞，所述方式允许病毒与靶细胞接触，该靶细胞中感兴趣的多核苷酸的递送是期望的。视应用而定，可靶向不同的细胞。在某些实施方式中，靶向肿瘤细胞。在其它实施方式中，靶向树突细胞(dc)。在其它实施方式中，靶向t细胞或b细胞。本发明的逆转录病毒载体可体外(例如，用于细胞的离体修饰)或直接体内使用。
有时，将合适量的包含多基因组病毒载体制剂的组合物直接引入人或其它动物(体内)，例如，通过注射到体内。合适的动物包括但不限于任何哺乳动物，例如马、狗、猫、牛、猪、绵羊、兔、鸡或其它鸟类。病毒颗粒可以通过多种途径注射，如静脉内、肌内、真皮内、皮下、结节内、瘤内、腹腔内或粘膜。可以使用皮下注射装置递送病毒，如美国专利号7,241,275、7,115,108、7,108,679、7,083,599、7,083,592、7,047,070、6,971,999、6,808,506、6,780,171、6,776,776、6,689,118、6,670,349、6,569,143、6,494,865、5,997,501、5,848,991、5,328,483、5,279,552、4,886,499中所公开的装置。其它注射位置也是合适的，如直接注入包括靶细胞的器官。例如，可以使用淋巴结内注射、脾内注射或骨髓内注射分别将病毒递送至淋巴结、脾脏和骨髓。根据靶细胞的具体情况和性质，导入可以通过其它方式进行，包括例如吸入或直接接触上皮组织，例如眼，口或皮肤中的那些。
或者，提供靶细胞并与病毒颗粒体外接触，如在培养板中。靶细胞通常是包括树突细胞或t细胞的细胞群，所述树突细胞或t细胞获自健康对象或者需要治疗或期望刺激针对抗原的免疫应答的对象。由对象获得细胞的方法为本领域所熟知，包括静脉切开术、手术切除和活检。还可以通过获得cd34α+人造血祖细胞并使用其它地方所述的体外培养方法(例如，banchereau等.cell106,271-274(2001)，其全部内容通过引用纳入)生成人dc。合适的t细胞群可采用类似方法体外产生。
可将多基因组制剂悬浮于培养基，并且添加到培养板、管或其它容器的孔中。包含病毒的培养基可以在细胞铺板前或细胞铺板后添加。通常将细胞在适当量的培养基中孵育以提供存活力并允许培养基中合适浓度的病毒，从而进行宿主细胞的转导。优选地，用病毒孵育细胞足够量的时间以允许病毒感染细胞。优选地，用病毒孵育细胞至少1小时、至少5小时或至少10小时。
在体内和体外递送中，使用包含感染所需靶细胞足够量的等分的病毒颗粒。当待培养靶细胞时，病毒颗粒的浓度常是至少1iu/μl，更优选至少10iu/μl，甚至更优选至少300iu/μl，甚至更优选至少1x104iu/μl，甚至更优选至少1x105iu/μl，甚至更优选至少1x106iu/μl，或甚至更优选至少1x107iu/μl。
用病毒颗粒体外感染后，可将靶细胞引入(或重新引入)人或其它动物。可以将细胞引入真皮、真皮下或外周血流中。引入动物的细胞优选是来自该动物的细胞，以避免不利的免疫应答。也可以使用源自具有相似免疫背景供者的细胞。还可以使用的其它细胞包括被设计成避免不利免疫应答的那些。
例如，可以针对靶细胞进行这些分析：一种或多种感兴趣的基因或序列的表达、整合、和/或转录、整合的基因的拷贝数和整合的位置。这样的分析可以在任何时间进行，并且可以通过本领域已知的任何方法进行。
可以通过任何本领域已知的方法分析给予了病毒或病毒感染的细胞的对象的感染细胞的位置、病毒递送的多核苷酸或感兴趣基因的表达、免疫应答的刺激和与疾病或病症相关症状的监控。
以上公开的感染细胞的方法并不依赖于细胞的个体特异性特征。因此，很容易将它们扩展至各种动物物种。在一些情况中，将病毒颗粒递送至人或人细胞，例如t细胞、b细胞或树突细胞，且在其它情况中，它们被递送至动物，例如小鼠、马、狗、猫或小鼠或鸟类。如本文所讨论，病毒载体被假型化以使其具有广泛的宿主范围以及靶细胞特异性。本领域技术人员还将意识到适当的内部启动子和其它元件以实现在特定动物物种中感兴趣序列的所需表达。因此，本领域技术人员将能够修改感染来自任何物种的细胞的方法。
靶细胞可用本文所述的混合的逆转录病毒载体颗粒制剂感染，用于预防或治疗疾病或病症。在某些实施方式中，靶细胞可以用本文所述的混合的逆转录病毒载体颗粒制剂感染，用于预防或治疗疾病或病症，针对所述疾病或病症的免疫应答的活化对于患者是有益的。许多这样的疾病是众所周知的。例如，适用于通过本发明的方法进行治疗或预防的疾病或病症包括但不限于癌症，自身免疫疾病和感染(包括病毒，细菌，真菌和寄生虫感染)。在一种方法中，通过本文所述的病毒颗粒治疗疾病，以将感兴趣的序列递送至树突细胞，其中，感兴趣的序列的表达产生疾病特异性抗原，从而刺激抗原特异性细胞免疫应答和体液免疫应答。一般而言，感兴趣的序列编码通常不表达于树突细胞中的一种或多种抗原(针对该一种或多种抗原的免疫应答是期望的)。由树突细胞表达并呈递抗原。在其它实施方式中，病毒载体基因组可编码本文所述的免疫调节分子。在某些实施方式中，病毒载体颗粒是杂合的，并且包含编码抗原的病毒载体基因组和编码免疫调节分子的病毒载体基因组，它们均在靶细胞中表达。
在一个典型应用中，病毒颗粒向树突细胞递送编码抗原(针对该抗原的免疫应答是期望的)的序列和编码免疫调节分子的序列。递送可以通过使细胞与病毒体外接触，随后将感染的细胞提供给患者来进行。其它时候，可通过将病毒递送给对象用于体内感染细胞来实现递送。在某些实施方式中，包含多基因组制剂的组合物递送至对象，以体内感染树突细胞。然后，树突细胞刺激患者的抗原特异性t细胞或b细胞，以诱导针对表达的抗原的细胞和体液免疫应答。因此，本发明提供诱导对象中免疫应答的方法，包括给予对象包含本文所述的多基因组逆转录病毒载体制剂的药物组合物。在其它实施方式中，本发明提供治疗对象癌症的方法，所述方法包括给予对象包含本文所述的多基因组病毒载体制剂的药物组合物，其中，soi编码一种或多种肿瘤相关抗原，和任选地，一种或多种检验点抑制剂或一种或多种细胞因子，或其组合。在另一实施方式中，本发明提供治疗对象中的感染性疾病的方法，包括给予对象包含本文所述的多基因组逆转录病毒载体制剂的药物组合物，其中，soi编码与所述感染性疾病相关的抗原。
在其它实施方式中，靶细胞用本文所述的表达免疫调节分子的病毒体内或体外感染。然后，感染的细胞在患者中表达免疫调节分子以调节免疫应答。通过该方式，患有疾病或病症的患者通过产生具有所需特异性的免疫细胞或用免疫调节分子调节免疫应答来治疗。
与疾病或病症相关的任何抗原均可以使用本文所述的多基因组病毒载体递送至树突细胞。鉴定用于靶向树突细胞的病毒颗粒的制剂的与疾病或病症相关的抗原。
如果离体接触，则将靶树突细胞例如通过注射转移回患者，其中它们与能够产生针对所需抗原的免疫应答的免疫细胞相互作用。在其它实施方式中，将重组病毒注射入患者，其中它原位转导经靶向的树突细胞。然后，树突细胞表达与待治疗的疾病或病症相关的特定抗原，并且患者能够产生针对疾病或病症的有效免疫应答。
在某些实施方式中，病毒载体颗粒是杂合的且包含各含有编码不同的抗原的多核苷酸序列的载体基因组，且在靶树突细胞的转导后，产生针对递送至该细胞的多种抗原的免疫应答。在一些实施方式中，抗原与单一疾病或病症有关。在其它实施方式中，抗原与多种疾病或病症有关。
在一些本文所述的多基因组载体中，所述颗粒包含编码免疫调节分子的至少一种载体基因组，所述免疫调节分子活化和/或刺激免疫应答，且在某些实施方式中，活化和/或刺激dc的成熟。在替代方案中，通过在病毒递送之前、同时或之后递送dc成熟因子来激活dc。dc成熟因子可以与病毒的给予分开提供。
本文所述的方法可用于患者的过继免疫治疗。如上所述，鉴定抗原(针对该抗原的免疫应答是期望的)。编码所需抗原的多核苷酸经获得并包装进入本文所述的重组多基因组病毒载体制剂。从患者获得靶树突细胞并用含有多核苷酸的重组病毒转导，所述多核苷酸编码所需抗原。然后将树突细胞转移回患者体内。
多基因组病毒载体可体内注射，其中它们感染靶细胞，例如dc，并递送感兴趣的序列，所述感兴趣的序列通常编码抗原和/或免疫调节分子。病毒颗粒的量至少为3×106iu，并且可为至少1×107iu、至少3×107iu、至少1×108iu、至少3×108iu、至少1×109iu或至少3×109iu。在选定的时间间隔中，来自受体淋巴器官的dc可用于度量表达，例如通过观察标志物(如感兴趣的抗原gfp或萤光素酶)表达。核酸监测技术和逆转录酶(rt)活性的测量也可用于分析病毒颗粒的生物分布。可以从对抗原刺激的响应的量级和耐久性测量来自慢病毒载体颗粒处理的受试者的恶性或靶病原体感染组织、外周血单核细胞、淋巴结或脾脏的t细胞。可以分析dc以外的组织细胞如上皮细胞和淋巴样细胞的体内基因递送的特异性。
疫苗通常包含佐剂。本文所述的多基因组逆转录病毒载体也可以与佐剂一起给予。佐剂可以与重组病毒颗粒一起给予、在重组病毒颗粒之前给予或在重组病毒颗粒之后给予。如果与病毒颗粒一起给予，理想的佐剂不会显著破坏病毒颗粒的完整性，例如破坏含有包膜糖蛋白的病毒膜。
尽管本文的多基因组病毒载体的典型应用是体内靶向dc，用于诱导针对抗原或多种抗原的免疫应答，本文中也设想其它靶细胞和应用，例如用于过继免疫治疗，生产经修饰的t细胞(表达修饰的tcr或嵌合抗原受体)，基因治疗等。
多种佐剂可与所述病毒联用以引发针对病毒载体基因组中编码的抗原的免疫应答。优选的佐剂能增大针对抗原的固有应答，同时不造成抗原中的构象变化(该构象变化则会影响应答的定性形式)。优选的佐剂包括明矾、3脱-o-酰化单磷酰脂质a(mpl)(参见gb2220211)。qs21是从南美洲发现的皂皮树(quillajasaponariamolina)的树皮中分离的三萜糖苷或皂苷(参见kensil等，《疫苗设计：亚基和佐剂方法》(vaccinedesign:thesubunitandadjuvantapproach)(powell和newman编，纽约州普莱南出版社(plenumpress)，1995)；美国专利美国专利号5,057,540)。其它佐剂是水包油乳剂(例如角鲨烯或花生油)，任选地与免疫刺激剂例如单磷酰脂质a组合(参见stoute等，n.engl.j.med.336，86-91(1997))。另一种佐剂是cpg(bioworldtoday,1998年11月15日)。或者，可将aβ偶联至佐剂。例如，脂蛋白形式的aβ可通过将棕榈酸或其它脂质直接偶联至aβ的n末端来制备，如对乙型肝炎b抗原疫苗接种所描述的(livingston，j.immunol.159，1383-1392(1997))。然而，这样的偶联不应该实质上改变aβ的构象，从而影响对其的免疫响应的性质。佐剂可以作为治疗组合物的组分与活性剂一起给予，或者可以在给予治疗剂之前、同时或之后分开给予。
一类佐剂是铝盐(明矾)，如氢氧化铝，磷酸铝，硫酸铝。这样的佐剂可以与或不与其它特定的免疫刺激剂例如mpl或3-dmp，qs21，聚合物或单体氨基酸例如聚谷氨酸或聚赖氨酸一起使用。另一类佐剂是水包油乳液制剂。此类佐剂可与或不与其它特异性免疫刺激剂联用，所述免疫刺激剂例如胞壁酰肽(例如，n-乙酰胞壁酰基-l-苏氨酰基-d-异谷氨酰胺(thr-mdp)、n-乙酰基-正胞壁酰-l-丙氨酰-d-异谷氨酰胺(nor-mdp)，n-乙酰胞壁酰基-l-丙氨酰-d-异谷氨酰胺酰基-l-丙氨酸-2-(1'-2'二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(mtp-pe)、n-乙酰葡萄糖胺酰基-n-乙酰胞壁酰基-l-al-d-异谷氨酸-l-ala-二棕榈酰丙酰胺(dtp-dpp)theramidetm)，或其它细菌细胞壁组分。水包油乳液包括：(a)mf59(wo90/14837)，其包含5％鲨烯、0.5％吐温80和0.5％司盘85(任选地包含不同量的mtp-pe)，采用微流化器例如model110y微流化器(微流体公司(microfluidics)，马萨诸塞州牛顿市)配制成亚微米颗粒；(b)saf，其包含10％角鲨烷、0.4％吐温80、5％普朗尼克-嵌段聚合物l121，和thr-mdp，其被微流体化成为亚微米乳液或涡旋振荡产生较大粒径的乳液，和(c)ribi佐剂系统(ras)(ribi免疫化学公司，蒙大拿州哈密尔顿)，其包含2％鲨烯、0.2％吐温80，和选自下组的一种或多种细菌细胞壁组分：单磷酰脂质a(mpl)、海藻糖二霉菌酸酯(tdm)，和细胞壁骨架(cws)，优选是mpl+cws(detoxtm)。另一类优选的佐剂是皂苷佐剂，例如stimulontm(qs21，亚桂拉公司(aquila)，马萨诸塞州伍斯特)或由其生成的颗粒，例如iscom(免疫刺激复合物)和iscomatrix。其它佐剂包括完全弗氏佐剂(cfa)和不完全弗氏佐剂(ifa)。其它佐剂包括细胞因子，例如白介素(il-1、il-2和il-12)、巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)，肿瘤坏死因子(tnf)。
可以与本文组合物一起使用的另一种佐剂由化学式(i)表示：
其中，部分a1和a2独立地选自氢、磷酸酯和磷酸盐。对于磷酸盐而言，钠和钾是示例性抗衡离子。部分r1、r2、r3、r4、r5和r6独立地选自具有3-23个碳的烃基(表示为c3-c23)。为更清楚起见，应理解，当一个部分“独立地选自”含有多个成员的特定基团时，第一部分所选成员在任何情况下都不会影响或限制第二部分成员的选择。r1、r3、r5和r6接合的碳原子是不对称的，且因此可以r或s立体化学结构存在。在一个实施方式中，所有那些碳原子都是r立体化学结构，而在另一个实施方式中，所有那些碳原子都是s立体化学结构。
“烃基”指完全由氢和碳形成的化学部分，其中碳原子的排列可以是直链或支链、非环状或环状，且相邻碳原子之间的连接可以完全是单键，即提供饱和烃基，或者两个相邻碳原子之间可存在双键或三键，即提供不饱和烃基，且烃基中碳原子的数目是3-24个碳原子。该烃基可以是烷基，代表性直链烷基包括甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基等，包括十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基等；而支链烷基包括异丙基、仲丁基、异丁基、叔丁基、异戊基等。代表性饱和环烃基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基等；而不饱和环烃基包括环戊烯基和环己烯基等。不饱和烃基在相邻的碳原子之间含有至少一个双键或三键(如果该烃基是非环状的，分别称作“烯基”或“炔基”，如果该烃基是至少部分环状的，分别称作环烯基和环炔基)。代表性直链和支链烯基包括乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2,3-二甲基-2-丁烯基等；而代表性直链和支链炔基包括乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-甲基-1-丁炔基等。
式(i)的佐剂可通过本领域已知的合成方法获得，例如pct国际公开号wo2009/035528(其通过引用纳入本文)以及wo2009/035528中提及的出版物(其也各自通过引用纳入本文)中公开的合成方法。还可通过商购获得所述佐剂中的某些。优选的佐剂是gla，且具有如下e1联合e10所示的结构式。
在某些实施方式中，佐剂具有如下所示的结构式：
在本发明的多个实施方式中，该佐剂具有式(i)的化学结构但部分a1、a2、r1、r2、r3、r4、r5和r6选自前文针对这些部分提供的选项的子集，这些子集在下文中鉴定为e1、e2等。
e1：a1是磷酸酯或磷酸盐，且a2是氢。
e2：r1、r3、r5和r6是c3-c21烷基；且r2和r4是c5-c23烃基。
e3：r1、r3、r5和r6是c5-c17烷基；且r2和r4是c7-c19烃基。
e4：r1、r3、r5和r6是c7-c15烷基；且r2和r4是c9-c17烃基。
e5：r1、r3、r5和r6是c9-c13烷基；且r2和r4是c11-c15烃基。
e6：r1、r3、r5和r6是c9-c15烷基；且r2和r4是c11-c17烃基。
e7：r1、r3、r5和r6是c7-c13烷基；且r2和r4是c9-c15烃基。
e8：r1、r3、r5和r6是c11-c20烷基；且r2和r4是c12-c20烃基。
e9：r1、r3、r5和r6是c11烷基；且r2和r4是c13烃基。
e10：r1、r3、r5和r6是十一烷基；且r2和r4是十三烷基。
在某些选项中，e2至e10各自与实施方式e1联用，和/或e2至e9的烃基是烷基，优选直链烷基。
式(i)佐剂可以配制成药物组合物，任选地与辅助剂一起，各自如下所述。就此而言，参考美国专利公开号2008/0131466，其提供了用于gla佐剂的制剂，例如水性制剂(af)和稳定的乳剂制剂(se)，其中这些制剂可用于式(i)的任何佐剂。
佐剂可以作为单一组合物与本发明的多基因组病毒载体一起给予，或者可以在给予本发明的重组病毒之前、同时或之后给予。免疫原和佐剂可以包装并供应在相同小瓶中，或者可以包装在单独的小瓶中并在使用前混合。免疫原和佐剂通常与表明预期的治疗应用的标签一起包装。如果免疫原和佐剂分开包装，包装通常包括使用前的混合说明。佐剂和/或运载体的选择取决于含有佐剂的疫苗的稳定性、给药途径、给药方案、佐剂对被疫苗接种的物种的效力，并且在人体内，药学上可接受的佐剂是有关监管机构已经批准或可批准进行人类使用的佐剂。例如，完全弗氏佐剂不适用于人体给予。明矾，mpl和qs21是优选。任选地，可以同时使用两种或更多种不同的佐剂，例如明矾与mpl，明矾与qs21，mpl与qs21，以及明矾、qs21和mpl一起。此外，可以使用不完全弗氏佐剂(chang等，advanceddrugdeliveryreviews32,173-186(1998))，任选地与明矾、qs21和mpl的任一种组合及其所有组合。
包含本文所述的多基因组病毒载体的组合物还可在给予一种或多种其它治疗剂的同时、之前或之后进行给予。
这类组合治疗可包括：给予单一药物剂型，其包含杂合病毒载体和一种或多种其它活性物质，和，给予组合物，所述组合物包含本发明的杂合病毒载体，以及各活性物质(以其自身的单独药物剂型)。例如，包含杂合病毒载体和其它活性物质的组合物可合并在单个肠内(如口服)剂量组合物(如片剂或胶囊)中给予患者，或以各单独的肠内(如口服)剂量制剂给予各试剂。类似地，包含杂合病毒载体和其它活性物质的组合物可合并在单个胃肠道外(例如已知且在本文中描述的任何胃肠道外途径，例如皮下、皮内、结内、瘤内或肌内)剂量组合物中给予患者(例如在盐水溶液或其它生理上可接受的溶液中)，或以单独的胃肠道外剂量制剂给予各试剂。如本文所述的组合治疗可以通过相同的途径给予，或者可以使用不同的途径给予。使用单独的剂量制剂时，包含杂合病毒载体和一种或多种其它活性剂的组合物可在基本相同时间(即同时)给予，或在单独的交错时间(即依次)并以任意顺序给予；应理解组合疗法包括所有这些方案。
因此，在某些实施方式中，还考虑给予包含本公开的多基因组病毒载体制剂的组合物，联合一种或多种其它治疗剂(例如其它抗癌剂，或其它缓和性或辅助性疗法)。在某些实施方式中，本领域可接受此类治疗剂作为本文所述的特定癌症的标准治疗。考虑的示例性治疗剂包括细胞因子、生长因子、类固醇、nsaid、dmard、抗炎药、免疫检查点抑制剂、化疗剂、放疗剂或其它活性和辅助性试剂。
在一个实施方式中，包含多基因组病毒载体制剂的组合物与一种或多种癌症治疗剂(包括一种或多种化疗剂)联合给予。癌症治疗剂的示例包括：烷化剂，例如噻替派和环磷酰胺(cytoxantm)；烷基磺酸盐/酯例如白消安，英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类例如苄替哌(benzodopa)，卡波醌(carboquone)，美妥替哌(meturedopa)，和尿烷亚胺(uredopa)；乙烯亚胺类和甲基蜜胺类，包括六甲蜜胺，三亚乙基蜜胺，三乙烯基磷酰胺，三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基胺(trimethylolomelamine)；氮芥类，例如苯丁酸氮芥，氯苯哒嗪，氯磷酰胺，雌莫司汀，异环磷酰胺，二氯甲基二乙胺，盐酸甲氧氮芥，美法仑，新恩比兴(novembichin)，苯芥胆留醇(phenesterine)，泼尼莫司汀(prednimustine)，曲洛磷胺，乌拉莫司汀(uracilmustard)；亚硝基脲类，例如卡莫司汀，氯脲霉素，福莫司汀，洛莫司汀，尼莫司汀，雷莫司汀；抗生素类，例如阿克拉霉素(aclacinomysins)，放线菌素，蒽霉素(authramycin)，重氮乙酰丝氨酸，博来霉素(bleomycin)，放线菌素(cactinomycin)，卡奇霉素(calicheamicin)，卡拉比辛(carabicin)，洋红霉素(caminomycin)，嗜癌菌素(carzinophilin)，色霉素(chromomycin)，更生霉素，柔红霉素，地托比星(detorubicin)，6-重氮基-5-氧代-l-正亮氨酸，阿霉素，表柔比星，依索比星(esorubicin)，伊达比星(idarubicin)，麻西罗霉素(marcellomycin)，丝裂霉素，霉酚酸，诺加霉素(nogalamycin)，橄榄霉素(olivomycin)，培洛霉素(peplomycin)，紫菜霉素(potfiromycin)，嘌呤霉素(puromycin)，三铁阿霉素(quelamycin)，罗多比星(rodorubicin)，链黑菌素，链脲菌素，杀结核菌素(tubercidin)，乌苯美司(ubenimex)，净司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代谢剂，例如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧旋(5-fu)；叶酸类似物，例如二甲叶酸(denopterin)，氨甲蝶呤，蝶罗呤(pteropterin)，三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如氟达拉滨(fludarabine)，6-巯基嘌呤，硫咪嘌呤(thiamiprine)，硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，例如安西他滨(ancitabine)，氮杂胞苷，6-氮杂尿苷，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷，二脱氧尿苷(dideoxyuridine)，去氧氟尿苷，依诺他滨(enocitabine)，氟尿苷，5-fu；雄激素，例如卡鲁睾酮(calusterone)，丙酸屈他雄酮(dromostanolonepropionate)，环硫雄醇(epitiostanol)，美雄烷(mepitiostane)，睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，例如氨鲁米特(aminoglutethimide)，米托坦(mitotane)，曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，例如亚叶酸(frolinicacid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺(aldophosphamide)葡糖苷；氨基乙酰丙酸；安丫啶(amsacrine)；贝曲布索(bestrabucil)；比山群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；迪氟法迈(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾氟米辛(elformithine)；依利醋铵(elliptiniumacetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidamine)；丙酮双脒腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)，吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸；2-乙基肼；甲基苄肼；
在另一个实施方式中，包含本发明的多基因组病毒载体制剂的组合物与其它免疫刺激剂联合给予。这类免疫刺激剂包括但不限于：n-乙酰胞壁酰-l-丙氨酰-d-异谷酰胺(mdp)，葡聚糖，il-12，gm-csf，干扰素γ和抗cd40抗体或结合并激活共刺激通路的其它抗体(例如cd28，icos，ox40，cd27等)。
在一个实施方式中，本发明所述的多基因组病毒载体组合物与一种或多种免疫检验点抑制剂联合给予。免疫检验点指免疫系统的多个抑制性通路，其对于维持自身耐受性和调控免疫应答的持续时间和幅度十分重要。肿瘤将某些免疫检验点通路作为免疫耐受的主要机制，特别是针对对肿瘤抗原有特异性的t细胞。(参见，例如，pardoll，2012nature12:252；chen和mellman2013immunity39:1)。本发明提供了可与不含抗原的gla组合物联用的免疫检验点抑制剂。这类组合疗法协同作用以增强抗癌免疫应答。有些病毒还发展出集结(co-opt)免疫检验点通路的机制。因此，在某些实施方式中，这类组合疗法可用于增强抗病毒免疫应答。
免疫检验点抑制剂包括以统计学显著的方式阻断或抑制免疫系统的抑制性通路的任何试剂。这类抑制剂可包括小分子抑制剂或可包括抗体或其抗原结合片段(其结合并阻断或抑制免疫检验点受体)或结合并阻断或抑制免疫检验点受体配体的抗体。可被靶向用于阻断或抑制的示例性免疫检验点分子包括但不限于，ctla-4、4-1bb(cd137)、4-1bbl(cd137l)、pdl1、pdl2、pd1、b7-h3、b7-h4、btla、hvem、tim3、gal9、lag3、tim3、b7h3、b7h4、vista、kir、2b4(属于cd2分子家族并表达在所有nk、γδ和记忆cd8+(αβ)t细胞上)、cd160(也称作by55)和cgen-15049。免疫检验点抑制剂包括这样的抗体或其抗原结合片段或其它结合蛋白，其结合并阻断或抑制以下一种或多种的活性：ctla-4、pdl1、pdl2、pd1、b7-h3、b7-h4、btla、hvem、tim3、gal9、lag3、tim3、b7h3、b7h4、vista、kir、2b4、cd160和cgen-15049。说明性的免疫检验点抑制剂包括特姆单抗(tremelimumab)(ctla-4阻断抗体)，抗ox40，pd-l1单克隆抗体(抗b7-h1；medi4736)，mk-3475(pd-1阻断剂)，尼弗单抗(nivolumab)(抗pd1抗体)，ct-011(抗pd1抗体)，by55单克隆抗体，amp224(抗pdl1抗体)，bms-936559(抗pdl1抗体)，mpldl3280a(抗pdl1抗体)，msb0010718c(抗pdl1抗体)和易普利姆玛/伊匹单抗(抗ctla-4检验点抑制剂)。
在其它实施方式中，本发明的多基因组病毒载体组合物与其它tlr4激动剂或tlr8激动剂或tlr9激动剂联合给予。这类激动剂可选自肽聚糖、聚i:c、cpg、3m003、鞭毛蛋白和真核细胞核糖体延长和起始因子4a的利什曼原虫同源物(leif)。
在另一个实施方式中，本发明的多基因组病毒载体组合物与细胞因子联合给予。“细胞因子”是由一个细胞群体释放的蛋白质的统称，其作用于另一细胞作为细胞间介导物。这类细胞因子的示例是淋巴因子、单核因子和传统多肽激素。细胞因子包括：生长激素，如人生长激素、n-甲硫氨酰基人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，如促卵泡激素(fsh)、促甲状腺激素(tsh)和黄体生成素(lh)；肝脏生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子-α和-β；苗勒管抑制剂；小鼠促性腺素-相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(tpo)；神经生长因子，如ngf-β；血小板-生长因子；转化生长因子(tgf)，如tgf-α和tgf-β；胰岛素样生长因子-i和-ii；红细胞生成素(epo)；骨诱导因子；干扰素，如干扰素α、β和γ；集落刺激因子(csf)，如巨噬细胞-csf(m-csf)；粒细胞-巨噬细胞-cgp(gm-csp)；粒细胞-巨噬细胞-csf(gm-csf)；和粒细胞-csf(g-csf)；白介素(il)，如il-1至il-36，包括但不限于il-1、il-1α、il-2、1l-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-11、il-12、il-15、il-18、il-21、il-23、il-27、tnf；以及其它多肽因子，包括lif和kit配体(kl)。本文所用的术语“细胞因子”包括天然来源或重组细胞培养物来源的蛋白质，以及天然序列细胞因子的生物活性等同物。
在某些实施方式中，本文所述的包含多基因组病毒载体制剂的组合物可与氯喹联合给予，氯喹是一种趋溶酶体剂，其阻止内体酸化并抑制肿瘤细胞诱导的自体吞噬以在加速的细胞生长和营养物消耗中存活下来。更通常地，本文所述的包含杂合病毒载体的组合物可与用作自噬抑制剂、放射致敏剂或化疗致敏剂的治疗剂联合给予，例如氯喹、米索硝唑、甲硝唑和缺氧性细胞毒素，如替拉扎明。就此而言，杂合病毒载体与氯喹或其它放射或化疗致敏剂或自噬抑制剂的这类组合还可与其它癌症治疗剂或放疗联用。
在另一个实施方式中，本文所述的包含多基因组病毒载体制剂的组合物可与小分子药物联合给予，这些小分子药物已知导致杀死肿瘤细胞并随后激活称作“免疫原性细胞死亡”的免疫应答，例如环磷酰胺、多柔比星、奥沙利铂和米托蒽醌。此外，还可与已知增强肿瘤细胞免疫原性的药物联用，例如帕土匹龙(大环内酯b)，靶向表皮生长因子受体(egfr)的单克隆抗体7a7.27，组蛋白去乙酰化酶抑制剂(例如，伏立诺他，罗咪酯肽，帕比司他，贝林诺特(belinostat)和恩替诺特)，n3-多不饱和脂肪酸二十二碳六烯酸，其它蛋白酶体抑制剂(如硼替佐米)，紫草素(紫草根的主要成分)和溶瘤细胞病毒(如tvec(塔利兰帕(talimogenelaherparepvec)))。在其它实施方式中，本文所述的包含杂合病毒载体的组合物可与表观遗传疗法联合给予，例如dna甲基转移酶抑制剂(如地西他滨，5-氮杂-2'-脱氧胞苷)，其可局部或全身给予。
在另一个实施方式中，本文所述的包含多基因组病毒载体制剂的组合物可与提高dc对肿瘤的adcc摄取的一种或多种抗体联合给予。因此，本发明考虑将包含多基因组病毒载体制剂的组合物与诱导或增强肿瘤细胞消化的任何分子或其片段联用，所述消化通过抗原呈递细胞并随后将肿瘤抗原呈递至免疫系统进行。这些分子包括诱导受体结合(如fc或甘露糖受体)并运输至抗原呈递细胞的试剂，例如抗体、抗体样分子、多特异性多价分子和聚合物。这类分子可与包含杂合病毒载体的组合物联用进行瘤内给予，或通过不同途径给予。例如，本文所述包含杂合病毒载体的组合物可与瘤内注射利妥昔单抗，西妥昔单抗，曲妥珠单抗，坎帕斯，帕尼单抗，奥法木单抗，布图昔单抗(brentuximab)，帕妥珠单抗，ado曲妥珠单抗埃姆他辛(ado-trastuzumabemtansine)，奥比珠单抗(obinutuzumab)，抗her1，her2或her3抗体(如mehd7945a；mm-111；mm-151；mm-121；amg888)，抗egfr抗体(如尼妥珠单抗，abt-806)或其它抗体联合进行瘤内给予。能够配合(engage)fc受体和其它诱导内化的受体的任何多价支架均可与本发明所述组合疗法联用，例如能够结合与fc片段连接的感兴趣的肽和/或蛋白质或能够配合受体的聚合物。
在某些实施方式中，多基因组病毒载体制剂与这类抗体的组合还可与促进共刺激信号的抗体(如抗ctla-4)联用(例如通过阻断抑制性通路)或与激活共刺激通路的抗体(如抗cd40、抗-cd28、抗-icos、抗-ox40、抗cd27抗体等)联用。
包含多基因组病毒载体制剂的组合物可单独给予或与其它已知的癌症治疗联用，所述癌症治疗是例如放疗、免疫检查点抑制剂、化疗或其它癌症治疗剂、移植、免疫治疗、激素治疗、光动力治疗等。这些组合物还可与抗生素联用。
e.药物组合物与试剂盒(或药盒)
本文还考虑包含本文提供的多基因组病毒载体制剂和一种或多种组分的药物组合物和试剂盒(或药盒)。药物组合物可包含本文所述的多基因组病毒载体和药物运载体。试剂盒可以包括本文提供的药物组合物和/或组合，以及一种或多种组分，例如使用说明书，用于将化合物给予于对象的装置和用于将化合物给予于对象的装置。
本文提供含有本文提供的病毒颗粒和合适的药物运载体的药物组合物。本发明提供的药物组合物可以是多种形式，例如，固体、液体、粉末、水性或冻干形式。合适的药物运载体的示例在本领域是众所周知的。可以通过常规方法配置这样的运载体和/或佐剂，并可以合适的剂量给予对象。稳定剂例如脂质、核酸酶抑制剂、聚合物和螯合剂可以保护组合物免于在体内降解。
本文提供的多基因组病毒载体可以包装成试剂盒。试剂盒可以任选地包括一种或多种组分，如使用说明书、装置和其它试剂及组分，如用于实践该方法的管、容器或注射器。示例性试剂盒可以包括本文提供的病毒，并且可以任选地包括使用说明书，用于检测对象中的病毒的装置，用于将病毒给予于对象的装置以及用于将化合物给予于对象的装置。
本文还设想包含编码一种或多种感兴趣的序列的多核苷酸的试剂盒。所述试剂盒可包含编码病毒包装组分的至少一种质粒和编码病毒包膜的载体，例如vsvg或辛德毕斯病毒e2糖蛋白变体。一些试剂盒将包含编码病毒包装组分的至少一种质粒，编码辛德毕斯病毒e2糖蛋白变体的载体，和两种病毒载体基因组质粒，一种编码抗原的载体基因组和一种编码免疫调节分子的载体基因组。
本文还设想包含编码一种或多种感兴趣的序列和任选地编码免疫调节分子的多核苷酸序列的病毒载体的试剂盒。在一些试剂盒中，所述试剂盒包含编码病毒包装组分的至少一种质粒和编码病毒包膜糖蛋白的载体。
试剂盒还可含有说明书。说明书通常包括这样的有形表达，其描述了病毒，和任选地包括在该试剂盒中的其它组分，和给予方法，包括用于确定对象的适当状态、适当剂量和适当给予方法的方法，用于给予病毒。说明书还可包括用于在治疗期间监测对象的指南。
本发明提供的试剂盒还可包括用于向对象给予病毒的装置。用于给予药物或疫苗的本领域已知的多种装置中的任一种都可包含在本发明提供的试剂盒中。示例性装置包括但不限于：皮下针头、静脉内针头、导管、无针注射装置、吸入器和液体分散器，如点眼药器。通常，用于给予试剂盒病毒的装置将与试剂盒病毒相容；例如，可以将诸如高压注射装置的无针注射装置包括在具有未被高压注射损伤的病毒的试剂盒中，但通常不包括在具有被高压注射损伤的病毒的试剂盒中。
本文中提供的试剂盒还可包括用于向对象给予化合物(例如免疫调节分子或其它治疗剂)的装置。本领域已知的用于向对象给予药物的各种装置中的任何装置都可以包括在本文提供的试剂盒中。示例性装置包括皮下针头、静脉内针头、导管、无针注射器具，但不限于，皮下针头、静脉内针头、导管、无针注射装置、吸入器和液体分散器，如点眼药器。通常，用于给予试剂盒的化合物的装置将与给予化合物的所需方法相容。
本文和所附权利要求书所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提到“一种抗原”，包括多种这类抗原，且提到“一种细胞”或“所述细胞”包括本领域技术人员已知的一种或多种细胞及其等同物(例如，多种细胞)等。类似地，提及“一种化合物”或“一种组合物”，包括多种此类化合物或组合物，并且除非本文中另有明确说明，分别指的是一种或多种化合物或组合物。当方法中的步骤被描述或需要保护，并且所述步骤以一定顺序描述时，描述第一步在“先于”或在第二步“之前”发生(或进行)等同于描述第二步“后续于”或在第一步“之后”发生(或进行)。指代数字或数字范围时，术语“约”表示所指数字或数字范围是实验变异性内的约数(或在统计学实验误差内)，且因此该数字或数字范围可在所示数字或数字范围的1％至15％之间变化。术语“包含”(和相关术语例如“包括”或“含有”或“具有”或“涵盖”)不意在排除在其它某些实施方式中，例如，本文所述的物质的任何组合物、组合物、方法或步骤等，可“由”所述特征“组成”或“基本由”所述特征“组成”。
通过说明的方式，而非限制性方式提供以下实施例。
实施例
实施例1
多基因组慢病毒载体诱导针对两种抗原的强健cd8t细胞应答
ny-eso-1/mage-a3重配体(多基因组)慢病毒载体颗粒采用标准转染方案制备，不同之处在于，采用ny-eso-1和mage-a3载体基因组质粒两者转染包装细胞。可采用本领域已知的多种转染方案。所用的典型方案涉及磷酸钙(capo4)介导的293t细胞(293ltv细胞系；细胞生物实验室公司(cellbiolabsinc)，ltv-100)瞬时转染。293t细胞用六种质粒转染，这六种质粒用capo4一起沉淀。利用所得的六种质粒来产生多基因组慢病毒载体制剂，其对应如下：i)慢病毒载体基因组，其表达ny-eso-1；ii)慢病毒载体基因组，其表达mage-a3；iii)hivrev编码质粒；iv)hivgag/pol编码质粒；和，v)编码vpx的质粒；vi)包膜编码质粒(在该实验中，包膜是经修饰的辛德毕斯包膜糖蛋白，如先前在wo2011/011584中所述)。对于典型转染方案，采用1mg的慢病毒载体基因组质粒。在该情况中，载体基因组质粒(1mg)的总量保持相同，但在所用两种慢病毒载体基因组质粒之间拆分。因此，转染采用0.5mg的各载体基因组(mage-a3和ny-eso-1)。慢病毒载体基因组均包含相同的回文二聚体起始位点(dis)序列。具体而言，dis序列是gcgcgc(seqidno:1)。因此，在该多基因组制剂中，纯合与杂合颗粒的预计比率如表1所示，例如25/25/50比率。
载体纯化之后，病毒效价采用基因特异性qrt-pcr确定，该基因特异性qrt-pcr确定基于对ny-eso-1和mage-a3具有特异性的引物组。整个多基因组病毒制剂的总基因组效价采用扩增全部基因组(不论感兴趣的序列)的pcr引物来测量。然后，所得制剂中存在的特定基因组的百分比计算为总基因组效价中的特定效价(例如，nyeso1基因组＝5.1e10/1.2e11＝42.5％)。效价示于下表4。如其所示，多基因组慢病毒载体制剂包含ny-eso-1和mage-a3载体rna，且鉴于50/50输入质粒比而具有预期的比率。一般而言，所用的基因组试验具有约2倍变异性。基于此，效价处于预期比率内：多基因组慢病毒制剂中，42.5％nyeso1和42％magea3。
balc/c小鼠如下物质免疫：编码ny-eso-1(ny)或mage-a3(m3)的纯合lv(各制剂1e10基因组)，或同时包含ny-eso-1和mage-a3基因组的lv物质的多基因组病毒载体制剂(2e10总基因组，从而获得1e10的各ny-eso-1或mage-a3基因组；根据表1，对于各载体基因组，基于50/50起始载体基因组质粒dna，25％的颗粒将是nyeso1或magea3纯合的，而50％的颗粒将是杂合的)，或混合在一起的纯合ny-eso-1和mage-a3lv物质(各1e10基因组)，或者，采用分开注射的纯合ny-eso-1和mage-a3lv物质(各1e10基因组)共同免疫。在免疫后14天，t细胞免疫应答采用肽再刺激之后进行胞内细胞因子染色和流式细胞术来评估。附图说明了平均抗nyeso1cd8t细胞应答(图2)，抗mage-a3cd8t细胞应答(图3)，和抗nyeso-1cd4t细胞应答(图4)。
实施例2
多基因组慢病毒载体免疫在小鼠中的体内免疫原性作用
该实施例显示，采用表达三种肿瘤相关抗原的多基因组慢病毒载体进行免疫能够在小鼠中产生针对全部三种靶向的肿瘤抗原的抗原特异性t细胞应答。
多基因组慢病毒载体颗粒制剂采用标准转染方案制备，不同之处在于该实验中采用三种载体基因组质粒。具体而言，在该实验中，采用ny-eso-1，mage-a3和mage-a10慢病毒载体基因组质粒来转染生产细胞。如实施例1中所述，慢病毒载体质粒dna的总量保持在1mg，但在三种质粒间等同地拆分。因此，在该情况中，采用0.33mg的各载体基因组质粒来生产多基因组lv:ny/m3/m10病毒载体制剂。
载体纯化之后，效价采用基因特异性qrt-pcr确定，该基因特异性qrt-pcr确定基于对ny-eso-1和mage-a3具有特异性的引物组。结果显示，多基因组lv制剂包含来自这两种载体基因组的载体rna，处于预期比率范围内。尽管未具体测量，但基于测量的两种载体基因组的量而假定mage-a10载体基因组的量如同预期。
在该研究中，在第0天，balb/c雌性小鼠(n＝5只/组)用慢病毒载体的5e9基因组免疫，该慢病毒载体经制造以体内递送ny-eso-1，mage-a3和mage-a10基因(多基因组lv:ny/m3/m10)至抗原呈递细胞。在第14天，从经免疫的小鼠收获脾，以测定针对肿瘤抗原，ny-eso1，mage-a3和mage-a10的抗原特异性cd8t细胞应答的发展。
如图5a-5c中所示，采用多基因组lv:ny/m3/m10免疫的小鼠发展出针对全部三种靶向的肿瘤抗原的抗原特异性cd8t细胞。
对于多重载体制剂的qrt-pcr的滴定法显示，表达多达四种不同taa(例如nyeso1，mage-a3)和两种免疫调节剂(例如il-12，检验点抑制剂等)的多基因组病毒载体制剂的产量高度可再现，对于个体抗原-编码型载体物质和产生的总载体基因组皆如此。与采用表达来自单一载体基因组的多种基因的载体(其作为融合蛋白，或由2a内切蛋白酶切割位点分开，或由不同的ires基序控制)免疫的小鼠相比，多基因组病毒载体制剂免疫的小鼠一致地发展出针对全部靶向的taa的抗原特异性t细胞。
该实施例描述了下一代慢病毒载体系统，该系统实现了对于多种肿瘤抗原的有效靶向。在载体生产的转染阶段以可控比率混合多种慢病毒载体基因组质粒的能力提供了在其它情况下无法获得的灵活性，以制造高度适于体内诱导肿瘤特异性t细胞应答和抗肿瘤治疗的多基因组载体制剂的组合。具体而言，该慢病毒载体生产系统可用于产生表达多种肿瘤抗原(包括肿瘤抗原)的患者特异性慢病毒载体。
实施例3
采用多基因组慢病毒载体在小鼠中免疫的体内免疫原性作用
研究了在给予表达多种肿瘤抗原和免疫调节因子的多基因组慢病毒载体之后产生的免疫应答。
在该研究中，于第0天，balb/c雌性小鼠(n＝5只/组)采用多基因组慢病毒载体免疫，该多基因组慢病毒载体经制造以体内递送ny-eso-1，mage-a3和mage-a10基因和如下免疫调节因子之一至抗原呈递细胞：mil-12，mirf3(5d)，抗mpdl1或抗mctla4。在第14天，从经免疫的小鼠收获脾，以测定针对肿瘤抗原，ny-eso1，mage-a3和mage-a10的抗原特异性cd8t细胞应答的发展。
实施例4
采用多基因组慢病毒载体在小鼠中免疫的体内治疗功效
先前数据显示，当以相同基因组给药时，相较于仅编码nyeso1蛋白的慢病毒载体，在多顺反子基因组上包含编码由t2a切割位点分开的nyeso1和magea3的序列(ny-t2a-m3)的慢病毒载体颗粒在小鼠中诱导显著较少的nyeso1特异性cd8t细胞，尽管有证据显示两种蛋白质均被表达。用ny-t2a-m3载体免疫的小鼠能够诱导针对magea3的免疫应答。此外，显示ny-t2a-m3多顺反子慢病毒载体在表达nyeso1的小鼠肿瘤模型系统中是治疗无效的。该实施例中的实验经设计以评价包含ny-eso-1和magea3编码序列的多基因组病毒载体制剂的治疗功效，与多顺反子ny-t2a-m3慢病毒载体颗粒相比较。
balb/c雌性小鼠用cin.23细胞(表达nyeso1的ct26肿瘤细胞系)静脉接种。接种后第3天，小鼠用对照载体，lv/nyeso1，混合的lv/nyeso1和lv/magea3，lv/ny-t2a-m3(单一基因组上两种抗原)，或多基因组lv:ny/m3载体(还参见实施例1)免疫。接种后第17天，收获肺用于结节枚举；脾细胞用nyeso1肽mhc多聚体染色用于流式细胞术分析。
用多基因组载体免疫的小鼠一致地发展出针对所有靶向的taa的t细胞(参见例如，图2和3)。然而，证实了先前的实验，ny-t2a-m3多顺反子载体未诱导nyeso1特异性t细胞(参见例如，图6b)(注意，magea3t细胞诱导未在该实验中测量，但已显示于其它实验中(未显示)。在该实验中，用多基因组载体免疫的小鼠显示出肿瘤生长控制(图6a)和存活率，与靶向感兴趣的肿瘤抗原(该情况中为nyeso1)的单一载体免疫的小鼠相当。重要的是，多基因组慢病毒载体诱导了显著更强的nyeso1特异性cd8t细胞免疫应答，并导致肿瘤生长的显著减少，相较于同时表达来自相同基因组(多顺反子基因组)的两种肿瘤抗原的慢病毒载体(参见图6中短线标记的lv/ny-t2a-m3，对比短线标记的lv-多重/[ny，m3])。
实施例5
采用多基因组(multimage)慢病毒载体在小鼠中免疫的体内免疫原性
在该实施例中，研究了给予表达多重mage肿瘤抗原的多基因组慢病毒载体之后产生的免疫应答。
包含表达四种不同mage肿瘤抗原的载体颗粒的混合群体的多基因组载体制剂基本如实施例1中所述制备。在该实验中，如在实施例1中那样，采用1mg的慢病毒载体基因组质粒来转染包装细胞。因此，载体基因组质粒(1mg)的总量保持相同且在所用四种慢病毒载体基因组质粒之间拆分，从而采用0.25mg的各慢病毒载体基因组质粒(magea1/magea3/magea4/magea10(所有密码子最优化)来进行该实验，以产生多基因组慢病毒载体制剂。如实施例1中所述，采用特定基因组引物来测定多基因组慢病毒制剂中各特定基因组的％。结果示于下表5，并基于该试验的2倍变异性，百分比一般如同预期。
balb/c小鼠(n＝5)如图7a–7d中所示采用所列载体制剂以2.5e9载体基因组(vg)(vg/特定ag)的剂量免疫。免疫应答通过体外再刺激和ics(采用肽池)来评估，如图7中所示。
结果显示lv/magea1(m1)在该小鼠品系中不具免疫原性(归因于小鼠h2k背景)，并且，对于该小鼠品系mhc单体型没有合适的m1表位。black6小鼠品系中的进一步实验显示，multimage多基因组载体具有免疫原性且在该品系中产生抗m1免疫应答。
多基因组lv诱导了magea3(m3)ag特异性cd8t细胞，与m1，m4或m10无交叉反应性。
多基因组lv诱导了magea4(m4)ag特异性cd8t细胞，与m1和m10具有交叉反应性。
magea10(m10)在该小鼠品系中的免疫原性最小。
因此，该实施例证实，该下一代慢病毒载体系统通过多基因组慢病毒载体制剂实现了有效表达和针对多种肿瘤抗原的免疫应答的诱导。
实施例6
采用表达多种抗原和免疫调节分子的多基因组慢病毒载体在小鼠中免疫的体内免疫原性
该实施例显示，相较于包括对照蛋白质(gfp)的情况，在多基因组慢病毒载体制剂中包括il-12导致了针对由多基因组慢病毒载体表达的抗原(例如，nyeso1和mage-a3)的显著增强的ctl应答，以及增加的疫苗摄取。
多基因组慢病毒载体制剂基本如实施例1所述制备。包含编码nyeso1(ny)，magea3(m3)，magea10(m10)和mil12或gfp作为对照的慢病毒基因组的质粒采用包装系统中1:1:1:3的质粒输入比率制备。因此，0.5mg的质粒在ny，m3和m10质粒间等分，而剩余的0.5mg质粒为mil12质粒。特定病毒基因组和总病毒基因组采用特定pcr基本如实施例1中所述测定。在该试验中，抗原特异性引物仅针对nyeso1和magea3提供。结果示于下表6，并且显示，该试验中，特定基因组的百分比接近预期(鉴于约2倍的变异性)。
balb/c小鼠(n＝7)用包含ny，m3和m10±gfp或il-12的多基因组制剂免疫。选择两个靶剂量水平(1e9或2e9ag的载体基因组)：“极低”和“低”。选择两倍差异以评估每载体基因组剂量(编码抗原的基因组)的il-12的作用并反应该基因组试验中的大致变异性。
如图8中所示，相较于gfp的添加，在多基因组慢病毒制剂中包括包括il-12导致了针对nyeso1和mage-a3的显著增强的ctl响应，以及增加的疫苗摄取(参见就％疫苗摄取标注的短线)。该免疫增强效应大于2倍剂量增加的作用。
实施例7
具有经修饰的二聚体起始信号(dis)序列的多基因组慢病毒载体制剂的生产
该实施例提供证据显示，对于多基因组慢病毒载体的包装过程中采用的输入基因组的二聚体起始信号(dis)序列进行操纵，能够影响所得病毒制剂中杂合和纯合颗粒的占比。
在第一实验中，慢病毒载体制剂采用单一输入基因组(编码nyeso1)(带有野生型dis序列(gcgcgc，seqidno:1；病毒制剂标为gcn/gcn)或采用基因组(其中dis序列用非回文(且非互补)dis(gggggg，seqidno:4；病毒制剂标为ggn/ggn)替代)制得。用非互补dis序列替代替代回文dis序列导致慢病毒载体基因组效价的显著减少(p＝0.0022，曼-惠特尼检验，图9a)。这些结果说明，回文dis序列介导有效二聚化和高效价慢病毒载体生产。这些结果进一步显示，缺乏成对回文dis序列的基因组仍被包装，纵使效率低得多，由此导致较低病毒载体效价。
在下一实验中，(以等同输入量)采用两种输入基因组，以制造多基因组慢病毒载体制剂，采用各基因组上相同的回文dis序列或各基因组上突变但互补的dis序列。在第一多基因组制剂中，各基因组包含野生型hiv-1回文dis序列(seqidno:1)。第一基因组编码nyeso(图9b中标为gcn)且第二基因组编码magea3(图9中标为gcm)。所得的多基因组制剂标为gcn/gcm。在第二多基因组病毒载体制剂中，将编码nyeso1蛋白的第一载体基因组质粒的dis序列突变为gggggg(seqidno:4；标为ggn)且，编码magea3的第二基因组包含突变为cccccc(seqidno:5；标为ccm)的dis序列。所得的多基因组病毒制剂标为ggn/ccm。
慢病毒载体通过实施例1中所述进行转染而产生。然后，采用实施例1中所述的方式，测量所得多基因组慢病毒载体制剂中存在的特定基因组(参见例如，表4)。
图9b显示了相较于gcn/gcm多基因组慢病毒载体制剂，采用野生型回文dis(gcn/gcn)的标准单一基因组病毒制剂的基因特异性载体基因组效价。证实先前实验，在采用半nyeso1和半magea3输入基因组质粒制得的gcn/gcm多基因组制剂中，所得的多基因组病毒制剂中检测到的nyeso1基因组约为在nyeso1单一基因组病毒制剂中检测到的那些的一半。对于nyeso1基因组，在gcn/gcm制剂中检测到的magea3基因组占比与由包装过程中所用的1:1输入比率的nyeso1/magea3基因组质粒所预期的相同。基于病毒遗传学，就表1而言，所得制剂对于各基因组应为25％纯合且对于nyeso1/magea3应为50％杂合。
先前实验(图9a)，显示采用非回文、非互补突变的dis序列制得的病毒制剂中的基因组(ggn/ggn)不成对且未高效包装。如图9b(ggn/ccm)中所示，相较于采用回文dis序列制得的多基因组病毒制剂，在采用突变的dis序列制得的多基因组病毒制剂中，观察到nyeso1和magea3特异性基因组效价的减少。推测该基因特异性基因组效价的减少归因于纯合基因组(ggn/ggn和ccm/ccm)的成对和包装的减少。因此，可以推断出ggn/ccm多基因组病毒制剂中所得的杂合颗粒的百分比增加。
该实施例显示，可利用对dis序列的操纵来调节多基因组病毒载体制剂中杂合与纯合颗粒的百分比。
也可以组合所述各种实施方式以提供其它实施方式。本说明书中提及的和/或列于申请数据表单中的所有美国专利、美国专利申请公开文本、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利公开文本均通过引用其全文纳入本文。所述实施方式的各方面可被修改，必要时可应用各种专利、申请和出版物的概念，以提供更多的实施方式。
根据上述详细说明可对实施方式进行这些和其它改变。总体而言，权利要求中所用的术语应不被认为是将权利要求限制到本说明书和权利要求中公开的具体的实施方式，而应认为是包括遵循与所列权利要求等同的完全范围的所有可能的实施方式。因此，权利要求并不受本公开内容限制。
序列表
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