使用靶向结缔组织生长因子的RNA复合物治疗特发性肺纤维化的制作方法

本申请要求2016年4月11日提交的美国临时申请号62/320,944的优先权权益，所述临时申请以引用的方式整体并入本文。

背景技术

特发性肺纤维化(ipf)的特征在于肺组织的严重和进行性瘢痕形成(纤维化)。许多人在诊断后仅存活约3至5年，并且死亡主要是由于呼吸衰竭所致。美国和欧盟的大约70,000名患者患有ipf。除肺移植外，不存在有效的治愈，其中不到1％的患者符合条件。因此，对于可有效地抑制或减轻患者的肺纤维化的新的临床有效的ipf治疗仍然存在显著需求。

若干生长因子牵涉于ipf的发病机制中。在这些生长因子中，结缔组织生长因子(ctgf)似乎牵涉于多种细胞类型转化成成纤维细胞，并损害重要的抗纤维化和促再生修复因子。ctgf水平在ipf患者的血浆、经支气管活组织检查标本和支气管肺泡灌洗液中升高。

因此，需要靶向ctgf的新的和改进的治疗剂以用于治疗特发性肺纤维化。

技术实现要素：

在某些方面，本文提供了靶向ctgf并且可用于治疗和/或预防特发性肺纤维化(ipf)的rna复合物。在某些方面，本文提供了包含此类rna复合物的药物组合物和使用此类rna复合物和药物组合物的方法。

在某些方面，本文提供了一种rna复合物，所述rna复合物包含与ctgfmrna序列具有序列互补性的反义链和与所述反义链具有序列互补性的有义链。在一些实施方案中，所述rna复合物能够抑制细胞(例如，肺泡细胞、上皮细胞、hs68、hacat或a549细胞)的ctgf表达。在一些实施方案中，所述rna复合物是不对称的短干扰rna(asirna)。在一些实施方案中，所述rna复合物是细胞穿透不对称的短干扰rna(cp-asirna)。在一些实施方案中，所述rna复合物是表1、表2、表3或表6中列出的rna复合物。

在一些实施方案中，本文提供的rna复合物包含化学修饰，其中所述修饰在不存在递送媒介物的情况下促进细胞膜的穿透。在一些实施方案中，所述修饰是2'-o-甲基化核苷、硫代磷酸酯键或疏水性部分。在一些实施方案中，本文提供的rna复合物包含疏水性部分。在一些实施方案中，所述疏水性部分可以是具有疏水特性的任何化学结构。例如，在一些实施方案中，所述疏水性部分是脂质、亲脂性肽和/或亲脂性蛋白质。在一些实施方案中，所述疏水性部分是脂质，如胆固醇、生育酚，或具有10个或更多个碳原子的长链脂肪酸(例如，硬脂酸或棕榈酸)。在一些实施方案中，所述疏水性部分是胆固醇。在一些实施方案中，所述rna复合物是表2、表3或表6中列出的修饰的rna复合物。在某些实施方案中，所述rna复合物不具有细胞毒性。

在某些方面，本文提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含如所描述的rna复合物和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制用于肠胃外、静脉内或口服递送。在其他实施方案中，所述药物组合物被配制用于吸入。

在某些方面，本文提供了一种抑制细胞(例如，肺泡细胞、上皮细胞、hs68、hacat或a549细胞)的ctgf表达的方法，所述方法包括使所述细胞与如本文所述的rna复合物接触。

在某些方面，如本文所述是一种抑制人受试者中的基因表达ctgf的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文提供的rna复合物或药物组合物。在某些方面，本文提供了一种治疗人受试者的ipf的方法，所述方法包括向所述受试者施用如本文所述的rna复合物或药物组合物。

附图说明

图1示出靶向ctgf的100种示例性asirna的基因沉默效率。

图2示出靶向ctgf的18种示例性asirna的基因沉默效率。

图3示出靶向ctgf的13种示例性asirna的基因沉默效率。

图4示出靶向ctgf的18种示例性asirna的血清核酸酶稳定性。

图5示出靶向ctgf的18种示例性裸的和修饰的asirna的基因沉默效率。

图6示出示例性靶向ctgf的细胞穿透asirna(cp-asirna或cp-asictgf)的基因沉默效率。

图7示出示例性cp-asirna对ctgf蛋白质表达的抑制。

图8示出大鼠皮肤中示例性cp-asirna对ctgf蛋白质表达的抑制。

图9示出在博来霉素处理的小鼠(blm处理的小鼠)中靶向ctgf的cp-asictgf93的基因沉默效率。

图10示出在blm处理的小鼠中cp-asictgf93对纤维化相关基因表达的抑制。

图11示出在blm处理的小鼠中cp-asictgf93对纤维化相关蛋白产生的抑制。

图12a示出a549细胞中靶向ctgf的cp-asirna的基因沉默活性。

图12b示出hacat细胞中靶向ctgf的cp-asirna的另外基因沉默活性。

图12c示出hs68细胞中靶向ctgf的cp-asirna的基因沉默活性。

图13示出靶向ctgf的cp-asirna的靶基因沉默活性。

发明详述

综述

在某些方面，本文提供了抑制ctgf并且因此可用于治疗ipf的不对称的rna复合物(例如，asirna或cp-asirna)。在一些实施方案中，所述rna复合物经化学修饰以能够穿透细胞而无需转染媒介物。在一些实施方案中，所述rna复合物是表1、表2、表3或表6中列出的rna复合物。在某些方面，本文提供了包含此类rna复合物的药物组合物和使用此类rna复合物和药物组合物的方法。

在一些实施方案中，本文描述的rna复合物是asirna或cp-sirna。如本文所用，术语asirna是指具有19-21nt反义链和13-17nt有义链的双链不对称的短干扰rna分子。关于asirna的另外信息可在美国专利公布号2012/0238017和chang等人,mol.ther.17:725-732(2009)中找到，其各自特此以引用的方式整体并入。

在一些实施方案中，使用递送媒介物，如脂质体、阳离子型聚合物、细胞穿透肽(cpp)、蛋白质转导结构域(ptd)、抗体和/或适体将本文所述的rna复合物递送至细胞。在一些实施方案中，对本文所述的rna复合物进行化学修饰，以便不需要使用此类递送媒介物来介导细胞中的ctgf抑制。此类rna复合物在本文中称为细胞穿透asirna(cp-asirna)。

定义

为了方便起见，在此集中了在说明书、实施例和所附权利要求书中采用的某些术语。

冠词“一个/种(a/an)”在本文中用来指代冠词的语法对象中的一个或多于一个(即，“至少一个”)。作为举例，“一个/种要素”是指一个/种要素或多于一个/种要素。

如本文所用，术语“施用”是指向受试者提供药剂或组合物，并且包括但不限于由医学专家施用和自我施用。

如本文所用，术语“干扰核酸”和“抑制核酸”可互换使用。干扰核酸通常包括一系列环状亚基，每个环状亚基携带通过亚基间键联连接的碱基配对部分，所述键联允许所述碱基配对部分通过沃森-克里克碱基配对与核酸(通常rna)中的靶序列杂交，以在所述靶序列内形成核酸：寡聚体异源双链体。干扰rna分子包括但不限于反义分子、sirna分子、asirna分子、cp-asirna分子、单链sirna分子、mirna分子以及shrna分子。可设计此类干扰核酸以阻断或抑制mrna的翻译或抑制天然前mrna剪接加工或诱导靶向mrna的降解，并且可被说成“针对”或“靶向”它所杂交的靶序列。干扰核酸可包括例如肽核酸(pna)、锁核酸(lna)、2'-o-甲基寡核苷酸和rna干扰剂(sirna剂)。rnai分子通常通过与靶分子形成异源双链体来起作用，所述靶分子被选择性地降解或“敲低”，从而使靶rna失活。在某些条件下，干扰rna分子还可通过抑制转录物翻译和/或抑制转录物的转录来使靶转录物失活。当干扰核酸以上述方式靶向靶标的核酸时，所述干扰核酸更一般地被称为“靶向”生物相关靶标，如蛋白质。

术语“多核苷酸”和“核酸”可互换使用。它们是指任何组合和任何长度的聚合形式的核苷酸，无论是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸还是其类似物。多核苷酸可具有任何三维结构，并且可执行任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析确定的基因座(loci)(基因座(locus))、外显子、内含子、信使rna(mrna)、转运rna、核糖体rna、核酶、cdna、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、具有任何序列的分离的dna、具有任何序列的分离的rna、核酸探针以及引物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，则可在聚合物组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。可如通过与标记组分缀合来进一步修饰多核苷酸。在本文提供的所有核酸序列中，u核碱基可与t核碱基互换。

如本文所用的短语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂或溶剂包封材料。

如果寡聚体在生理条件下(其中tm基本上高于45℃或至少50℃或至少60℃-80℃或更高)与靶标杂交，则寡核苷酸与靶多核苷酸“特异性地杂交”。这种杂交对应于严格杂交条件。在给定离子强度和ph下，tm是50％的靶序列与互补多核苷酸杂交时的温度。再次，这种杂交可在反义寡聚体与靶序列的“接近”或“基本”互补性以及精确互补性的情况下。

如本文所用，术语“受试者”是指被选择用于治疗或疗法的人或非人动物。

如本文所用的短语“治疗有效量”和“有效量”是指剂的以适用于任何医学治疗的合理益处/风险比在受试者的至少一个细胞亚群中有效产生所需治疗作用的量。

“治疗”受试者的疾病或“治疗”患有疾病的受试者是指使所述受试者接受药物治疗，例如施用药物，以使得所述疾病的至少一种症状被减轻或防止恶化。

如本文所用，“预防”病症或病状的治疗剂是指当在所述病症或病状发作前施用至统计学样品时，相对于未治疗的对照样品降低所治疗样品中的病症或病状的发生率，或者相对于未治疗的对照样品延迟病症或病状的一种或多种症状的发作或降低其严重程度的化合物。

rna复合物

在某些方面，本文提供了分别靶向ctgfmrna并抑制细胞的ctgf表达的rna复合物。下文提供了人ctgfcdna的核酸序列。

人ctgfmrna序列。(nm_001901.2)

智人结缔组织生长因子(ctgf)，mrna

在某些方面，本文提供了一种rna复合物，所述rna复合物包含与ctgfmrna序列(例如，人ctgfmrna序列)具有序列互补性的反义链和与所述反义链具有序列互补性的有义链。在一些实施方案中，所述rna复合物能够抑制细胞(例如，肺泡细胞、上皮细胞、hs68、hacat或a549细胞)的ctgf表达。在一些实施方案中，所述rna复合物是不对称的短干扰rna(asirna)。在一些实施方案中，所述rna复合物是表1、表2、表3或表6中列出的rna复合物。本文所述的rna复合物可含有rna碱基、非rna碱基或rna碱基和非rna碱基的混合物。例如，本文提供的某些rna复合物可主要由rna碱基组成，但也含有dna碱基或非天然存在的核苷酸。

在一些实施方案中，所述反义链的长度是至少19个核苷酸(nt)。在一些实施方案中，所述反义链的长度是19至21nt(即，长度为19、20或21nt)。在一些实施方案中，所述反义链的长度是至少21个核苷酸(nt)。在一些实施方案中，所述反义链的长度是21至31nt(即，长度为21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31nt)。在一些实施方案中，所述反义链的至少13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31nt与ctgfmrna序列互补。完美互补性不是必需的。在一些实施方案中，所述反义链与ctgfmrna序列完全互补。

在一些实施方案中，所述反义链的长度是至少24nt(例如，长度为至少25nt、长度为至少26nt、长度为至少27nt、长度为至少28nt、长度为至少29nt、长度为至少30nt或长度至少31nt)。在一些实施方案中，所述反义链的长度不大于124nt(例如，长度不大于100nt、长度不大于90nt、长度不大于80nt、长度不大于70nt、长度不大于60nt、长度不大于50nt或长度不大于40nt。在一些实施方案中，所述反义链的长度是21nt。在一些实施方案中，所述反义链的长度是23nt。在一些实施方案中，所述反义链的长度是25nt。在一些实施方案中，所述反义链的长度是27nt。在一些实施方案中，所述反义链的长度是29nt。在一些实施方案中，所述反义链的长度是31nt。在一些实施方案中，所述反义链的至少16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、29、29、30或31nt与ctgfmrna序列互补。完美互补性不是必需的。在一些实施方案中，所述反义链与ctgfmrna序列完全互补。

在一些实施方案中，所述有义链的长度是15至17nt(即，长度为15nt、长度为16nt或长度为17nt)。在一些实施方案中，所述有义链的至少15nt、至少16nt或至少17nt与所述反义链的序列互补。在一些实施方案中，所述有义链与所述反义链的序列完全互补。在一些实施方案中，所述有义链的长度是16nt。

在一些实施方案中，所述反义链和所述有义链形成复合物，其中所述反义链的5'端和所述有义链的3'端形成平末端。在一些实施方案中，所述反义链和所述有义链形成复合物，其中所述反义链的5'端突出所述有义链的3'端(例如，1、2、3、4或5nt)。在一些实施方案中，所述反义链和所述有义链形成复合物，其中所述有义链的5'端突出所述反义链的3'端(例如，1、2、3、4或5nt)。

在一些实施方案中，所述rna复合物的反义链和/或有义链具有选自表1、表2、表3或表6中列出的序列的有义链序列和/或反义链序列。

在一些实施方案中，本文提供的rna复合物包含化学修饰，其中所述修饰在不存在递送媒介物的情况下促进细胞膜的穿透。在一些实施方案中，所述修饰是2'-o-甲基化核苷、硫代磷酸酯键或疏水性部分。在一些实施方案中，所述化学修饰是疏水性部分。在一些实施方案中，所述疏水性部分是胆固醇部分。在一些实施方案中，所述rna复合物是表2、表3或表6中列出的修饰的rna复合物。在某些实施方案中，所述rna复合物不具有细胞毒性。

本文描述的rna复合物可使用多种寡核苷酸化学。寡核苷酸化学的实例包括但不限于肽核酸(pna)、连接的核酸(lna)、硫代磷酸酯、2'o-me-修饰的寡核苷酸和吗啉代化学，包括任何前述的组合。通常，pna化学可利用更短的靶向序列，因为它们相对于2'o-me寡核苷酸的相对高的靶标结合强度。通常将硫代磷酸酯和2'o-me-修饰的化学组合以产生具有硫代磷酸酯主链的2'o-me-修饰的寡核苷酸。参见例如pct公布号wo/2013/112053和wo/2009/008725，其各自以引用的方式整体并入本文。

肽核酸(pna)是dna的类似物，其中主链与脱氧核糖主链在结构上是同形的，由与嘧啶或嘌呤碱基连接的n-(2-氨基乙基)甘氨酸单元组成。含有天然嘧啶和嘌呤碱基的pna与遵循沃森-克里克碱基配对规则的互补寡核苷酸杂交，并且在碱基对识别方面模拟dna。pna的主链由肽键而不是磷酸二酯键形成，从而使得它们非常适合反义应用(参见下文的结构)。所述主链不带电，从而产生表现出大于正常热稳定性的pna/dna或pna/rna双链体。pna不被核酸酶或蛋白酶识别。

尽管对天然结构的根本结构变化，但pna能够以螺旋形式与dna或rna序列特异性结合。pna的特征包括对互补dna或rna的高结合亲和力，由单碱基错配引起的不稳定效应，对核酸酶和蛋白酶的抗性，独立于盐浓度与dna或rna的杂交，以及与同型嘌呤dna的三链体形成。panagene.tm.开发了其专有的btspna单体(bts；苯并噻唑-2-磺酰基)和专有的低聚方法。使用btspna单体的pna低聚由脱保护、偶联和加帽的重复周期组成。pna可使用本领域已知的任何技术合成产生。参见例如，美国专利号6,969,766、7,211,668、7,022,851、7,125,994、7,145,006和7,179,896。还参见美国专利号5,539,082；5,714,331；以及5,719,262用于制备pna。pna化合物的其他教义可在nielsen等人,science,254:1497-1500,1991中找到。前述各自以引用的方式整体并入。

干扰核酸还可含有“锁核酸”亚基(lna)。“lna”是称为桥联核酸(bna)的一类修饰的成员。bna的特征在于共价键联，所述共价键联将核糖环的构象锁定在c3-内切(northern)糖折叠物中。对于lna，桥由2'-o与4'-c位置之间的亚甲基组成。lna增强主链预组装和碱基堆积以增加杂交和热稳定性。

lna的结构可例如在wengel等人,chemicalcommunications(1998)455；tetrahedron(1998)54:3607，和accountsofchem.research(1999)32:301)；obika等人,tetrahedronletters(1997)38:8735；(1998)39:5401，和bioorganicmedicinalchemistry(2008)16:9230中找到。本文提供的化合物可并入一种或多种lna；在一些情况下，所述化合物可完全由lna组成。用于合成单个lna核苷亚基及其并入寡核苷酸中的方法描述于例如美国专利号7,572,582、7,569,575、7,084,125、7,060,809、7,053,207、7,034,133、6,794,499以及6,670,461中，所述专利各自以引用的方式整体并入。典型的亚基间接头包括磷酸二酯和硫代磷酸酯部分；或者，可采用不含磷的接头。一个实施方案是含lna的化合物，其中每个lna亚基通过dna亚基分开。某些化合物由交替的lna和dna亚基组成，其中亚基间接头是硫代磷酸酯。

在某些实施方案中，所述rna复合物与胆固醇部分连接。在一些实施方案中，所述胆固醇部分连接至有义链的3'末端。在一些实施方案中，所述胆固醇部分连接至反义链的3'末端。在一些实施方案中，所述胆固醇部分连接至有义链的5'末端。在一些实施方案中，所述胆固醇部分连接至反义链的5'末端。

在一些实施方案中，所述rna复合物包含2'-o-甲基化核苷。2'-o-甲基化核苷在核糖分子的2'-oh残基处携带甲基。2'-o-me-rna显示与rna相同(或相似)的行为，但被保护免受核酸酶降解。2'-o-me-rna也可与硫代磷酸酯寡核苷酸(pto)组合以进一步稳定化。可根据本领域的常规技术来合成2'-o-me-rna(磷酸二酯或硫代磷酸酯)(参见例如，yoo等人,nucleicacidsres.32:2008-16,2004，其特此以引用的方式并入)。

在一些实施方案中，2'-o-甲基核苷位于有义链上。在一些实施方案中，2'-o-甲基核苷位于有义链的3'末端。在一些实施方案中，所述有义链包含多个2'-o-甲基化核苷(例如，2、3、4、5或6个2'-o-甲基化核苷)。在一些实施方案中，2'-o-甲基核苷位于反义链的3'末端。在一些实施方案中，所述反义链的3'末端区域包含多个2'-o-甲基化核苷(例如，3'末端的6个核苷内的2、3、4、5或6个2'-o-甲基化核苷)。在一些实施方案中，所述有义链和反义链的3'末端区域两者均包含多个2'-o-甲基化核苷。在一些实施方案中，所述有义链包含与未修饰的核苷交替的2'-o-甲基化核苷。在一些实施方案中，所述有义链包含与未修饰的核苷交替的2、3、4、5、6、7或8个2'-o-甲基化核苷的连续序列。在一些实施方案中，所述反义链包含与未修饰的核苷交替的2'-o-甲基化核苷。在一些实施方案中，所述反义链包含与未修饰的核苷交替的2、3、4、5、6、7或8个2'-o-甲基化核苷的连续序列。

在一些实施方案中，所述rna复合物包含硫代磷酸酯键。“硫代磷酸酯”(或s-寡聚物)是正常dna的变体，其中非桥氧中的一个被硫取代。核苷酸间键的硫化降低了内切核酸酶和外切核酸酶的作用，包括5'至3'和3'至5'dnapol1外切核酸酶、核酸酶s1和p1、rna酶、血清核酸酶和蛇毒磷酸二酯酶。硫代磷酸酯通过两种主要途径制备：通过二硫化碳中元素硫溶液对氢膦酸酯的作用，或通过用二硫化四乙基秋兰姆(tetd)或3h-1,2-苯并二硫醇-3-酮1,1-二氧化物(bdtd)硫化亚磷酸三酯的方法(参见例如，iyer等人,j.org.chem.55,4693-4699,1990)。后者方法避免了元素硫在大多数有机溶剂中的不溶性和二硫化碳的毒性问题。tetd和bdtd方法也产生更高纯度的硫代磷酸酯。

在一些实施方案中，所述rna复合物的有义链中的核糖核苷酸之间的至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的键是硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，所述rna复合物的有义链中的核糖核苷酸之间的所有键是硫代磷酸酯键。

在一些实施方案中，所述rna复合物的反义链中的核糖核苷酸之间的至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的键是硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，所述rna复合物的反义链中的核糖核苷酸之间的所有键是硫代磷酸酯键。

本文所述的rna复合物可与细胞接触或施用至生物体(例如人)。或者，编码rna复合物的构建体和/或载体可与细胞或生物体接触或引入细胞或生物体中。在某些实施方案中，使用病毒、逆转录病毒或慢病毒载体。

本文所述的rna复合物可通过本领域已知的任何合适的方法来制备。例如，在一些实施方案中，本文所述的rna复合物通过化学合成或体外转录制备。

在某些方面，本文提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含如本文公开的rna复合物和药学上可接受的载体。在某些实施方案中，所述药物组合物被配制用于递送至肺(例如，作为吸入剂)。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制用于口服或肠胃外递送。在一些实施方案中，所述药物组合物还包含用于治疗ipf的第二剂。在一些实施方案中，所述第二剂是生长因子抑制剂。生长因子抑制剂的实例包括尼达尼布、吡非尼酮、吉非替尼、埃罗替尼、拉帕替尼、西妥昔单抗、帕尼单抗、奥希替尼、雷莫芦单抗和凡德他尼。在一些实施方案中，所述第二剂是类固醇。类固醇的实例包括氢化可的松、氟替卡松、mudesonide、莫米松、倍氯米松、环索奈德、氟尼缩松可的松以及泼尼松。可将两种或更多种生长因子抑制剂和/或类固醇与药物组合物一起服用。

在某些实施方案中，所述药物组合物不包含转染媒介物。在一些实施方案中，所述药物组合物包含递送媒介物(例如，脂质体、阳离子型聚合物、细胞穿透肽(cpp)、蛋白质转导结构域(ptd)、抗体和/或适体)。在一些实施方案中，所述组合物包含多种(例如，两种或更多种)本文所述的rna复合物的组合。

制备这些制剂或组合物的方法包括使本文所述的rna复合物与载体和任选的一种或多种辅助成分缔合的步骤。通常，通过使本文所述的剂与液体载体均匀且紧密地缔合来制备制剂。

治疗方法

在某些方面，本文提供了一种抑制细胞的ctgf表达的方法，所述方法包括使所述细胞与如本文所述的rna复合物接触。在一些实施方案中，所述rna复合物是修饰的rna复合物，并且使所述细胞与所述rna复合物在不存在转染媒介物的情况下接触。在一些实施方案中，使所述细胞与所述rna复合物在递送媒介物(例如，脂质体、阳离子型聚合物、细胞穿透肽(cpp)、蛋白质转导结构域(ptd)、抗体和/或适体)存在下接触。在一些实施方案中，所述细胞存在于人受试者的呼吸道中。在一些实施方案中，所述受试者患有ipf。在一些实施方案中，所述受试者是女性。在一些实施方案中，所述受试者是男性。

在某些方面，本文提供了一种治疗人受试者的ipf的方法，所述包括向所述受试者施用如本文所述的rna复合物或药物组合物。在某些实施方案中，将所述rna复合物或药物组合物施用至受试者的呼吸道。在一些实施方案中，所述rna复合物或药物组合物由受试者自我施用。

在本发明方法中，本文所述的rna复合物可例如，作为与递送试剂组合的不含递送媒介物的核酸(例如，对于cp-asirna)和/或作为包含表达本文所述的rna复合物的序列核酸施用至受试者。在一些实施方案中，本领域中已知的任何核酸递送方法可用于本文所述的方法中。合适的递送试剂包括但不限于例如mirustransittko亲脂试剂；lipofectin；lipofectamine；cellfectin；聚阳离子(例如，聚赖氨酸)、去端肽胶原、纳米复合物和脂质体。去端肽胶原作为核酸分子的递送媒介物的用途在minakuchi等人nucleicacidsres.,32(13):el09(2004)；hanai等人annnyacadsci.,1082:9-17(2006)；以及kawata等人molcancerther.,7(9):2904-12(2008)中进行了描述；其各自整体并入本文。示例性干扰核酸递送系统提供于美国专利号8,283,461、8,313,772、8,501,930、8,426,554、8,268,798和8,324,366中，其各自特此以引用的方式整体并入。

在本文所述方法的一些实施方案中，脂质体用于将本文所述的rna复合物递送至受试者。适用于本文所述的方法中的脂质体可由标准的形成囊泡的脂质形成，所述脂质通常包括中性或带负电荷的磷脂和固醇，如胆固醇。通常通过考虑诸如所需脂质体大小和血流中脂质体的半衰期的因素来指导脂质的选择。已知用于制备脂质体的多种方法，例如，如szoka等人(1980),ann.rev.biophys.bioeng.9:467；和美国专利号4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369中所描述，其全部公开内容以引用的方式并入本文。

还可修饰用于本发明方法的脂质体，以便避免单核巨噬细胞系统(“mms”)和网状内皮系统(“res”)的清除。此类修饰的脂质体在表面上具有调理作用抑制部分或并入脂质体结构中。

用于制备本文所述的脂质体的调理作用抑制部分通常是与脂质体膜结合的大的亲水性聚合物。如本文所用，调理作用抑制部分在其化学或物理连接至膜时“结合”至脂质体膜，例如通过将脂溶性锚嵌入膜本身，或通过直接结合至膜脂质的活性基团。这些抑制调理作用的亲水性聚合物形成保护性表面层，所述层显著降低mms和res对脂质体的摄取；例如，如美国专利号4,920,016中所描述，所述美国专利的全部公开内容以引用的方式并入本文。

在一些实施方案中，适于修饰脂质体的调理作用抑制部分是数均分子量为约500至约40,000道尔顿或约2,000至约20,000道尔顿的水溶性聚合物。此类聚合物包括聚乙二醇(peg)或聚丙二醇(ppg)衍生物；例如，甲氧基peg或ppg和peg或ppg硬脂酸酯；合成聚合物，如聚丙烯酰胺或聚n-乙烯基吡咯烷酮；直链、支链或树枝状聚酰胺基胺；聚丙烯酸；多元醇，例如羧基或氨基所化学连接的聚乙烯醇和聚木糖醇，以及神经节苷脂，如神经节苷脂gm1。peg、甲氧基peg或甲氧基ppg或其衍生物的共聚物也是合适的。此外，抑制调理作用的聚合物可以是peg与聚氨基酸、多糖、聚酰胺基胺、聚乙烯胺或多核苷酸的嵌段共聚物。抑制调理作用的聚合物也可以是含有氨基酸或羧酸的天然多糖，例如半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、透明质酸、果胶酸、神经氨酸、海藻酸、角叉菜胶；胺化多糖或低聚糖(直链或支链)；或者羧化多糖或低聚糖，例如，与碳酸的衍生物反应，得到羧基的连接。在一些实施方案中，调理作用抑制部分是peg、ppg或其衍生物。用peg或peg衍生物修饰的脂质体有时被称为“peg化脂质体”。

本文公开的药物组合物可通过任何合适的施用途径，通过吸入、口服和肠胃外递送。在某些实施方案中，所述药物组合物全身递送(例如，通过口服或肠胃外施用)。在某些其他实施方案中，所述药物组合物通过吸入局部递送至肺中。

可改变药物组合物中rna复合物的实际剂量水平以便获得对于特定患者、组合物和施用模式可有效实现所需治疗反应而对患者无毒的rna复合物的量。

选择的剂量水平将取决于各种因素，包括所采用的特定剂的活性、所采用的特定化合物的施用途径、施用时间、排泄率或代谢率、治疗持续时间，与所采用的特定化合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料，所治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康和先前病史、以及在医学领域中熟知的类似因素。

具有本领域普通技术的医师能够容易地判定和开具有效量的所需医药组合物。例如，医师或兽医可以低于达到所需治疗作用所需的水平开具和/或施用在药物组合物中采用的剂的剂量，并逐渐增加剂量直到达到所需作用。

一般而言，本文所述的rna复合物的适合每日剂量将是所述rna复合物的有效产生治疗作用的最低剂量的量。这种有效剂量通常将取决于上述因素。

实施例

实施例1：筛选ctgf特异性不对称的小干扰rna

为了鉴定抑制结缔组织生长因子(ctgf)的不对称的小干扰rna(asirna)，合成并筛选了100种asirna。表1中提供了示例性asirna的核酸序列。

表1：用于示例性靶向ctgf的asirna的核酸序列。

将表1中列出的asirna在1xsirna双链体缓冲液(bioneerinc.,korea)中在95℃下孵育2分钟并在37℃下孵育1小时。通过凝胶电泳确认适当的链退火。对于筛选，将已经在含有10％胎牛血清(gibco)和100μg/ml青霉素/链霉素的杜氏改良的伊格尔氏培养基(gibco)中培养的2.5x10⁴个a549细胞(atcc)接种到24孔板中。根据制造商的说明书，使用lipofectamine2000(invitrogen)，用0.3nm的asirna转染a549细胞。

在转染后24小时，使用实时rt-pcr测量ctgfmrna水平。使用isol-rna裂解试剂(5prime)提取总rna，且然后根据制造商的说明书使用高容量cdna逆转录试剂盒(appliedbiosystems)将500ng提取的rna用于cdna合成。稀释合成的cdna，且然后根据制造商的说明书使用steponert-pcr系统(appliedbiosystems)进行定量rt-pcr。100种asirna中的每一种的ctgf抑制水平描绘在图1中。

实施例2：使用靶向ctgf的asirna抑制ctgfmrna表达

测试了18种asirna序列，asictgf4、9、16、25、30、32、33、34、39、40、48、49、81、92、93、96、97和99的抑制ctgf表达的能力。

将选定asirna在1xsirna双链体缓冲液(bioneerinc.,korea)中在95℃下孵育2分钟并在37℃下孵育1小时。通过凝胶电泳确认适当的链退火。对于筛选，将2.5x10⁴个a549细胞(atcc)接种到24孔板中。根据制造商的说明书，使用lipofectamine2000(invitrogen)，用0.3或0.1nm的asirna转染a549细胞。

使用rt-pcr在转染后24小时测量了转染的细胞中的ctgfmrna水平。具体地说，使用isol-rna裂解试剂(5prime)提取总rna，且然后使用高容量cdna逆转录试剂盒(appliedbiosystems)将500ng提取的rna用于cdna合成。稀释合成的cdna，且然后使用steponert-pcr系统(appliedbiosystems)进行定量rt-pcr。使用powersybrgreenpcr主混合物(appliedbiosystems)检测ctgf基因的扩增。gapdh被扩增为内部对照。使用以下引物序列：

人gapdh-正向：5’-gagtcaacggatttggtcgt-3’

人gapdh-正向：5’-gacaagcttcccgttctcag-3’

人ctgf-正向：5’-caagggcctcttctgtgact-3’

人ctgf-反向：5’-acgtgcactggtacttgcag-3’

图2中提供了18种示例性asirna的ctgf抑制的水平。如图2中所示，asirna4、9、16、30、33、34、48、49、81、92、93、96和97抑制ctgf表达。

实施例3：使用靶向ctgf的asirna抑制ctgfmrna表达

通过转染测试了13种asirna序列，asictgf4、9、16、30、33、34、48、49、81、92、93、96和97的抑制ctgf表达的能力。

将asirna在1xsirna双链体缓冲液(bioneer)中在95℃下孵育5分钟并在37℃下孵育1小时。通过凝胶电泳确认适当的链退火。对于筛选，a549细胞(atcc)已经在100mm细胞培养皿中含有10％胎牛血清(gibco)和100μg/ml青霉素/链霉素的最低基础培养基(gibco)中进行了培养。在转染前一天，将2.5x10⁴个a549细胞接种到24孔板中。将a549细胞用0.1、0.03和0.001nmasirna浓度的asirna转染。使用rnaisoplus(takara)提取总rna，且然后根据制造商的说明书使用高容量cdna逆转录试剂盒(appliedbiosystems)将500ng提取的rna用于cdna合成。使用powersybrpremixextaq(takara)检测ctgf基因的扩增。gapdh用作对照。13种asirna的ctgf抑制的水平描绘在图3中。

实施例4：使用靶向ctgf的asirna的血清核酸酶稳定性

将来自实施例1的选定asirna(0.1纳摩尔)在50μl的10％胎牛血清溶液中孵育。在指定时间点取得7微升的每种样品，并立即在-70℃下冷冻。然后将每种样品的3μl等分部分在10％(wt/vol)非变性聚丙烯酰胺凝胶中分离，用溴化乙锭染色，并通过uv透照可视化。asictgf针对血清核酸酶的稳定性描绘在图4中。

实施例5：用于筛选的asirna的初始化学修饰

将2'-o-甲基rna的化学修饰应用于实施例1中选择的asirna，并且在具有裸asirna的a549细胞中测试了修饰的asirna的基因沉默功效。将修饰的asirna(表2)针对ctgfmrna抑制a549细胞进行了筛选，并通过实时pcr测量了ctgfmrna水平。

表2：针对功效测试的18种修饰的asirna序列。m＝2'-o-甲基rna。

将表2中列出的2'-o-甲基rna修饰的asirna在1xsirna双链体缓冲液(bioneerinc.,korea)中在95℃下孵育2分钟并在37℃下孵育1小时。通过凝胶电泳确认适当的链退火。对于筛选，将已经在100mm细胞培养皿中含有10％胎牛血清(gibco)和100μg/ml青霉素/链霉素的杜氏改良的伊格尔氏培养基(gibco)中培养的2.5x10⁴个a549细胞(atcc)接种到24孔板中。根据制造商的说明书，使用lipofectamine2000(invitrogen)，用0.1nm的修饰的和裸asirna转染a549细胞。

使用rt-pcr在转染后24小时测量了转染的细胞中的ctgfmrna水平。使用isol-rna裂解试剂(5prime)提取总rna，且然后根据制造商的说明书使用高容量cdna逆转录试剂盒(appliedbiosystems)将500ng提取的rna用于cdna合成。稀释合成的cdna，且然后根据制造商的说明书使用stepone实时pcr系统(appliedbiosystems)进行定量rt-pcr。裸asirna或2'-o-甲基rna修饰的asirna的ctgf抑制的水平在图5中示出。

实施例6：用于自我递送的asirna的化学修饰

将化学修饰施加至选定asirna，并在不存在其他递送试剂的情况下测试了修饰的asirna的细胞递送。如下文所述，某些修饰改进了asirna的内吞作用和稳定性。此类细胞穿透asirna(cp-asirna)能够在不存在递送试剂的情况下递送到细胞中。

针对a549细胞中的ctgfmrna抑制筛选了四种潜在cp-asirna(表3)。将a549细胞与不含递送试剂的3μm的cp-asirna一起孵育。通过实时pcr测量ctgfmrna水平。

表3：针对自我递送和ctgf抑制测试的修饰的asirna序列。m＝2'-o-甲基rna。*＝硫代磷酸酯键。chol＝胆固醇。

将a549细胞在100mm细胞培养皿中在含有10％胎牛血清(gibco)和100μg/ml青霉素/链霉素的杜氏改良的伊格尔氏培养基(gibco)中进行培养。将表3中列出的潜在cp-asirna在opti-mem缓冲液(gibco)中在95℃下孵育5分钟并在37℃下孵育1小时。通过凝胶电泳确认适当的链退火。在cp-asirna处理前一天，将2.5x10⁴个细胞接种到24孔板中。在处理之前，将a549细胞用杜氏改良的伊格尔氏培养基(gibco)洗涤，然后在opti-mem缓冲液中在潜在cp-asirna存在下培养24小时，在每个点用含血清的培养基替代含asirna的opti-mem培养基。在asirna处理后48小时使用实时pcr测定ctgfmrna表达的水平。

实施例7：使用靶向ctgf的cp-asirna抑制ctgfmrna表达

测试了cp-asirna对ctgfmrna的抑制。将每种潜在cp-asirna与不含递送试剂的3μm的a549细胞一起孵育，并使用实时pcr测量ctgfmrna水平。

将ctgf细胞(atcc)在100mm细胞培养皿中在含有10％胎牛血清(gibco)和100μg/ml青霉素/链霉素的杜氏改良的伊格尔氏培养基(gibco)中进行培养。将cp-asirna在opti-mem缓冲液(gibco)中在95℃下孵育5分钟并在37℃下孵育1小时。通过凝胶电泳确认适当的链退火。在转染前一天，将2.5x10⁴个a549细胞接种到24孔板中。就在处理之前，将a549细胞用杜氏改良的伊格尔氏培养基(gibco)洗涤，然后在opti-mem缓冲液中在潜在cp-asirna存在下培养24小时，在此时用含血清的培养基替代含asirna的opti-mem培养基。在asirna处理后48小时通过实时pcr测定ctgfmrna表达的水平。使用rnaisoplus(takara)提取总rna，且然后根据制造商的说明书使用高容量cdna逆转录试剂盒(appliedbiosystems)将500ng提取的rna用于cdna合成。使用powersybrpremixextaq(takara)检测ctgf基因的扩增。gapdh被扩增为内部对照。

4种潜在cp-asirna中的每一种的ctgfmrna抑制的水平描绘在图6中。在所有cp-asictgf孵育的细胞系中，观察到45％ctgf蛋白质抑制，其中cp-asictgf93在mrna水平下具有最高抑制功效。

实施例8：使用靶向ctgf的cp-asirna抑制ctgf蛋白质表达

为了测试cp-asirna对ctgf蛋白的抑制，将每种潜在cp-asirna与无递送试剂的3μm的a549细胞一起孵育。将a549细胞(atcc)在100mm细胞培养皿中在含有10％胎牛血清(gibco)和100μg/ml青霉素/链霉素的杜氏改良的伊格尔氏培养基(gibco)中进行培养。

将cp-asirna在opti-mem缓冲液(gibco)中在95℃下孵育5分钟并在37℃下孵育1小时。通过凝胶电泳确认适当的链退火。

在转染前一天，将9x10⁴个a549细胞接种到6孔板中。就在处理之前，将a549细胞用杜氏改良的伊格尔氏培养基(gibco)洗涤，然后在opti-mem缓冲液中在cp-asirna存在下培养24小时，在此时用含血清的培养基替代含asirna的opti-mem培养基。

在asirna处理后48小时通过蛋白质印迹测定ctgf蛋白表达的水平。简言之，用sds裂解缓冲液(1％sds，100mmtris(ph8.8))溶解处理的ctgfh细胞。将20μg总蛋白质提取物负载到10％sds-page凝胶上，并在120v下电泳。在电泳后，将蛋白质转移至已经在300ma下通过甲醇(merck)活化1小时的pvdf膜(bio-rad)。将膜在室温下用3％bsa(bioworld)封闭1小时，且然后在4℃下在含有抗-ctgf抗体(santacruz)和抗-γ-微管蛋白抗体(bethyl)的3％bsa中孵育过夜。然后将膜用1xtbst洗涤10分钟达三次，并在室温下在1xtbst中与hrp缀合的第二抗体一起孵育1小时。将膜用1xtbst洗涤10分钟并用1xecl处理1分钟。然后使用chemidoc仪器(bio-rad)对ctgf和γ-微管蛋白条带成像。

蛋白质印迹测定的结果描绘在图7中。

实施例9：在动物模型中cp-asictgf对ctgf的抑制

在动物模型中评估了cp-asictgf93对ctgf表达的抑制的功效。sd大鼠(雄性，6-8周龄)购自orientbio(korea)。将浓度为0.4、0.7或1mg的cp-asirna注射到大鼠皮肤中，并且在72小时后，从注射部位收集皮肤活检样品并进行qrt-pcr分析以评估ctgf的蛋白质水平。

在cp-asirna处理后72小时，使用哺乳动物蛋白质提取缓冲液(gehealthcare)和蛋白酶抑制剂混合物(roche)提取总蛋白质。使用bradford测定试剂盒测量蛋白质浓度。通过sds-page凝胶电泳解析等量的蛋白质。在电泳后，将蛋白质转移至已经通过甲醇(merck)活化1小时的pvdf膜(bio-rad)。将膜在室温下用5％脱脂乳封闭1小时，且然后在4℃下在含有特异性抗体(抗-ctgf抗体：novus和santacruz，抗-β-肌动蛋白抗体：santacruz，抗-gapdh抗体：santacruz)的5％脱脂乳中孵育过夜。用含有1％tween-20的tris缓冲盐水洗涤膜，并在室温下在含有hrp缀合的第二抗体(santacruz)的5％脱脂乳中孵育1小时。在孵育后，用ecl底物(thermoscientific)处理膜。然后使用chemidoc仪器(bio-rad)对靶蛋白质条带成像。

如图8中所示，0.4mg/注射cp-asictgf93产生ctgf蛋白水平降低超过80％。

实施例10：cp-asictgf93对博莱霉素诱导的肺纤维化动物模型中ctgf的表达的影响

在博来霉素诱导的(blm)肺纤维化动物模型中评估了cp-asictgf93对ctgf表达的抑制的功效。

七周龄雄性c57bl/6小鼠购自orientbio(seongnam,korea)。通过腹膜内施用zoletil50麻醉小鼠。将硫酸博来霉素(enzo,farmingdale,ny)溶解在1x盐水中，并以2mg/kg体重的单剂量气管内施用。对照动物仅施用盐水。

在七天后，将cp-asictgf93在0.6x盐水中在95℃下孵育5分钟并在37℃下孵育30分钟。随后，将cp-asictgf93气管内施用至博来霉素处理的小鼠(blm处理的小鼠)中。将30只小鼠随机分成6组：阴性对照小鼠施用0.6x盐水(n＝4)，blm小鼠施用博来霉素(n＝5)，6.2mpk小鼠施用博来霉素和6.2mg/kgcp-asictgf93(n＝5)，3.1mpk小鼠施用博来霉素和3.1mg/kgcp-asictgf93(n＝6)，1.5mpk小鼠施用博来霉素和1.5mg/kgcp-asictgf93(n＝5)，并且0.75mpk小鼠施用博来霉素和0.75mg/kg的cp-asictgf93(n＝5)。

在博来霉素施用后14天，处死小鼠并使用定量rt-pcr测量ctgfmrna的水平。右肺用于实时pcr(rt-pcr)以测定mrna水平。

使用rnaisoplus(takara,japan)从肺组织提取总rna，且然后根据制造商的说明书使用高容量cdna逆转录试剂盒(appliedbiosystems)将500ng提取的rna用于cdna合成。所使用的引物和探针序列提供在表4中。根据制造商的说明书，用powersybrpremixextaq(takara,japan)针对18s的ctgf或探针qpcr混合物(toyobo,japan)进行实时rt-pcr。管家基因18s用作内部对照，并且基因特异性mrna表达针对18s表达标准化。

表4-用于实时逆转录酶聚合酶链式反应的引物序列和探针信息。

如图9中所示，通过单次气管内施用cp-asictgf93显著抑制blm诱导的ctgf表达的上调的表达。与blm处理组相比，单次气管内施用cp-asictgf93使blm处理的小鼠中的ctgfmrna降低>60％。

实施例11：cp-asictgf93对博莱霉素诱导的肺纤维化动物模型中纤维化相关基因的表达的影响

在博来霉素诱导的肺纤维化动物模型中评估了cp-asictgf93处理对纤维化相关基因的表达的影响。

在施用博来霉素(2mg/kg体重)后7天，一次气管内施用cp-asictgf93。在博来霉素施用后14天，使用实时pcr测定纤维化相关基因的表达水平。

根据制造商的方案，使用rnaisoplus(takara,japan)从肺组织中提取总rna。所使用的引物序列提供在表5中。用powersybrpremixextaq(takara,japan)或探针qpcr混合物(toyobo,japan)进行实时rt-pcr，并且在appliedbiosystemsstepone实时pcr机器(appliedbiosystems,usa)上进行反应。管家基因18s用作内部对照，并且基因特异性mrna表达针对18s表达标准化。

表5-用于实时逆转录酶聚合酶链式反应的引物序列。

如图10中所示，通过施用cp-asictgf93显著抑制blm诱导的纤连蛋白、i型胶原和iii型胶原的表达的上调。

实施例12：cp-asictgf93对博莱霉素诱导的肺纤维化动物模型中纤连蛋白的产生的影响

在博来霉素诱导的肺纤维化动物模型中评估了cp-asictgf93处理对纤连蛋白蛋白质水平的影响。

在施用博来霉素(2mg/kg体重)后7天，一次气管内施用cp-asictgf93(6.2至0.75mg/kg体重)。在博来霉素施用后14天处死小鼠并评估。使用蛋白质印迹分析测定纤维化肺组织中纤连蛋白的表达。

为了检测纤连蛋白和γ微管蛋白，将样品在500μl哺乳动物蛋白质提取缓冲液(gehealthcare)中均质化。使用bradford测定来测定了蛋白质浓度。通过在10％凝胶上的sds-page对20μg总蛋白质提取物进行电泳，转移至已经通过甲醇(merck)在300ma下活化1小时的聚偏二氟乙烯(pvdf)过滤器(bio-rad,usa)。将膜在室温下用5％脱脂乳封闭1小时，且然后在4℃下与含有小鼠抗纤连蛋白(abeaminc,cambridge,ma)或抗γ微管蛋白(santacruzbiotechnology,santacruz,ca)抗体的5％bsa(bioword)一起孵育过夜。用针对小鼠或兔igg和chemidoc仪器(bio-rad)的辣根过氧化物酶缀合的第二抗体检测第一抗体。

如图11中所示，通过施用cp-asictgf93显著抑制blm诱导的纤连蛋白表达的上调。

实施例13：具有不同反义链的cp-asirna对靶基因敲低的影响。

测试了靶向结缔组织生长因子(ctgf)的具有不同反义链长度的cp-asirna的效率。靶向ctgf的cp-asirna的序列和化学修饰可在以下表6中找到。

ss：有义链，as：反义链，加下划线的字母2’-o-甲基修饰的rna，*硫代磷酸酯键，chol：胆固醇三甘醇(teg)

靶向ctgf的具有不同反义链长度的cp-asirna的靶基因沉默活性可在图12a中找到。将a549细胞转染并与靶向ctgf的cp-asirna一起孵育。从细胞溶解产物中提取总rna，并通过定量实时聚合酶链式反应(qrt-pcr)进行分析。观察到cp-asirna的有效靶基因沉默。nt表示无处理对照。

靶向ctgf的具有不同反义链长度的cp-asirna在hacat细胞中的靶基因沉默活性可在图12b中找到。用靶向ctgf的cp-asirna转染hacat细胞。将hacat细胞与靶向ctgf的cp-asirna一起孵育。从细胞溶解产物中提取总rna，并通过定量实时聚合酶链式反应(qrt-pcr)进行分析。观察到cp-asirna的有效靶基因沉默。nt表示无处理对照。靶向ctgf的cp-asirna在hs68细胞中的靶基因沉默活性可在图12c中找到。用靶向ctgf的cp-asirna转染/孵育hs68细胞。从细胞溶解产物中提取总rna，并通过定量实时聚合酶链式反应(qrt-pcr)进行加工。观察到cp-asirna的有效靶基因沉默。

实施例14：皮内注射对体内靶基因敲低的影响

测试了靶向结缔组织生长因子(ctgf)的具有不同反义链长度的cp-asirna的功效。表6中靶向ctgf的cp-asirna的序列和化学修饰。

在大鼠皮肤中测试了靶向ctgf的具有不同反义链长度的cp-asirna的靶基因沉默活性(表6)。将0.6x盐水中0.5mg靶向ctgf的cp-asirna注射到大鼠皮肤中(皮内注射)。图13示出在cp-asirna施用后的靶mrna和蛋白质水平。观察到cp-asirna的有效靶基因沉默。此外，具有较长反义链的cp-asirna显示出最大的靶基因敲低。nt表示无处理对照。0.6x盐水表示仅试剂对照。这些结果表明体内cp-asirna处理的靶基因敲低。

以引用的方式并入

本文提及的所有公布、专利和专利申请都特此以引用的方式整体并入，如同每个单独的公布、专利或专利申请明确且单独地被指明以引用的方式并入。在冲突的情况下，将以本申请(包括本文的任何定义)为准。

等效方案

本领域技术人员仅仅使用常规实验将认识到或者能够确定本文所述的发明的具体实施方案的许多等效方案。此类等效方案意图由以下权利要求涵盖。