治疗亨廷顿氏舞蹈病的组合物和方法与流程

本申请要求2016年5月18日提交的us临时专利申请no.62/338,113的优先权，其名称为治疗亨廷顿氏舞蹈病的组合物和方法，还要求2017年4月13日提交的us临时专利申请no.62/485,049的优先权，其名称为治疗亨廷顿氏舞蹈病的组合物和方法，其各自内容通过引用整体并入此处。

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本发明涉及用于设计、制备、制造、使用和/或配制调节性多核苷酸的组合物、方法和过程，例如编码靶向亨廷顿(htt)基因(例如，野生型或突变体cag扩增的htt基因)的小干扰rna(sirna)分子的多核苷酸。靶向突变的htt基因可干扰htt基因的表达以及所得htt蛋白生产。编码sirna分子的调节性多核苷酸可以插入重组腺相关病毒(aav)载体中。还公开了使用sirna分子抑制神经退行性疾病(例如，亨廷顿氏舞蹈病(hd))受试者中htt基因表达的方法。

背景技术：

亨廷顿氏舞蹈病(hd)是一种单基因致命性神经退行性疾病，其特征是进行性舞蹈样运动、神经精神性和认知功能障碍。已知亨廷顿氏舞蹈病是由亨廷顿蛋白(htt)基因外显子1中常染色体显性三联体(cag)重复扩增引起的，所述基因编码在其n末端带有聚谷氨酰胺扩增道(expandedtract)的亨廷顿蛋白(htt)。这种重复扩增导致htt功能的毒性增加(gain)并最终导致纹状体神经退化，其进展为广泛的脑萎缩。症状通常出现在35-44岁之间，疾病发作后的平均预期寿命为10-25年。有趣的是，cag扩增的长度与发作年龄和疾病进展速度相关，较长的扩增与较严重的疾病和较短的生存相关。在小比例的hd群体中(约6％)，疾病发作发生在2-20岁并且出现强直综合征(akinetic-rigidsyndrome)。这些病例的发展速度往往比晚发作的病例更快，并且已被分类为幼年型或westphal变异型hd。据估计，在美国和欧洲目前约有35,000-70,000名患者患有hd。目前，只有症状缓解和支持疗法可用于治疗hd，能否治愈有待确定。最终，患有hd的个体会死于其它疾病(例如，肺炎、心力衰竭)、窒息、呼吸困难或其它并发症，例如跌倒造成的身体伤害。

cag重复扩增的htt导致神经毒性的机制尚未被很好理解。亨廷顿蛋白在所有细胞中都表达，尽管其浓度在脑中最高。htt的正常功能尚不清楚，但在hd患者脑中htt聚集成异常的核内含物。现在认为正是这种错误折叠和聚集的过程以及相关的蛋白中间体(即可溶性物质和毒性n末端片段)导致神经毒性。

对hd动物模型的研究表明，例如，在调节表达模型中在基因关闭后，表型逆转是可行的。此外，在动物模型中测试了htt沉默，显示出有希望的结果，治疗既耐受良好又显示出潜在的治疗益处。这些发现表明htt沉默可以作为hd治疗的潜在治疗靶标。

本发明开发了基于rna干扰的方法、新型双链rna(dsrna)构建体和sirna构建体及其设计方法，以抑制或阻止hd患者中聚谷氨酰胺扩增的htt的表达，从而治疗疾病。另外，这些新型sirna构建体可以是合成分子或在表达载体(一条或两条链)中编码以递送到细胞中。这种载体包括但不限于腺相关病毒载体，例如任何aav血清型的载体基因组或其它病毒递送载体，例如慢病毒等。

技术实现要素：

本发明涉及rna分子介导的基因对基因表达和蛋白生产的特异性干扰。治疗神经退行性疾病如亨廷顿氏舞蹈病的方法也包括在本发明中。本文所述组合物中包含的sirna包含具有反义链(30个核苷酸或更少，通常为19-24个核苷酸长)的dsrna，其与突变htt基因的mrna转录物中至少一部分基本上互补。

本发明提供了短双链rna分子，如小干扰rna(sirna)双链体，其靶向httmrna以干扰htt基因表达和/或htt蛋白生产。本发明的sirna双链体可以干扰htt基因，并且可以尤其与带有引起亨廷顿氏舞蹈病的突变的htt基因相互作用。

在一些实施方案中，将这样的sirna分子或sirna分子的单链插入(aav)腺相关病毒载体中以引入细胞，特别是纹状体或皮质神经元和/或中枢神经系统中的其它周围细胞。aav载体可包含编码1、2、3、4或多于4个sirna双链体的序列。

本发明的sirna双链体包含杂交在一起形成双链体结构的反义链和正义链，其中反义链与htt基因的核酸序列互补，并且其中正义链与htt基因的核酸序列同源。在一些方面，反义链的5′末端具有5′磷酸基团，正义链的3′末端含有3′羟基。在其它方面，在每条链的3′末端没有、有1或2个核苷酸突出端。

根据本发明，靶向htt基因的sirna双链体的每条链约19-25个核苷酸长，优选地约19个核苷酸、20个核苷酸、21个核苷酸、22个核苷酸、23个核苷酸、24个核苷酸或25个核苷酸长。在一些方面，sirna可以是未修饰的rna分子。

在其它方面，sirna可含有至少一种经修饰的核苷酸，例如碱基、糖或主链修饰。

在一个实施方案中，sirna或dsrna包含至少两个彼此互补的序列。dsrna包含具有第一序列的正义链和具有第二序列的反义链。反义链包含与编码htt蛋白的mrna中至少一部分基本上互补的核苷酸序列，互补区为30个核苷酸或更少，并且至少15个核苷酸长。通常，dsrna是19至24，例如，19至21个核苷酸长。在一些实施方案中，dsrna为约15至约25个核苷酸长，并且在其它实施方案中，dsrna为约25至约30个核苷酸长。

当dsrna接触表达htt蛋白的细胞时或在表达htt蛋白的细胞内转录时，其抑制或压制htt基因表达的至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％或至少40％或更多，例如当通过本文所述的方法确定时。

根据本发明，产生这样的aav载体，其包含编码靶向htt基因的sirna双链体、sirna双链体的一条链或dsrna的核酸，aav载体血清型可以是aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav9.47、aav9(hu14)、aav10、aav11、aav12、aavrh8、aavrh10、aav-dj8、aav-dj、aav-php.a(php.a)和/或aav-php.b(php.b)及其变体。作为非限制性实例，aav载体血清型是aav1。作为另一个非限制性实例，aav血清型是aav-dj8。作为另一个非限制性实例，aav血清型是aav-php.a(php.a)。作为另一个非限制性实例，aav血清型是aav-php.b(php.b)。

在一个实施方案中，产生这样的aav载体，其包含编码靶向htt基因的sirna双链体、sirna双链体的一条链或dsrna的核酸，这可以基于对中型多棘纹状体神经元、皮质神经元和/或星形胶质细胞的趋向性来进行选择。作为非限制性实例，基于所需细胞类型中的表达水平选择aav载体，例如但不限于中型多棘纹状体神经元、皮质神经元和/或星形胶质细胞。

根据本发明，靶向hd中htt基因的sirna双链体或dsrna选自表3、4或5所列sirna双链体。优选地，靶向hd中htt基因的sirna双链体或dsrna选自sirna双链体：d-3500至d-3570。

本发明还提供了药物组合物，其包含至少一种靶向htt基因的sirna双链体和药学上可接受的载体。在一些方面，将编码sirna双链体的核酸序列插入aav载体中。

在一些实施方案中，本发明提供了抑制/沉默细胞中htt基因表达的方法。因此，sirna双链体或dsrna可用于基本上抑制细胞中htt基因的表达。细胞可以是神经元(例如，壳、尾状核或纹状体的中型多棘神经元和大脑皮质中的皮质神经元)、星形胶质细胞(例如，纹状体中的星形胶质细胞、大脑皮质中的皮质星形胶质细胞)和/或少突胶质细胞。作为非限制性实例，壳、尾状核和皮质中抑制(或降低)htt基因的表达降低了亨廷顿氏舞蹈病在受试者中的作用。作为另一个非限制性实例，在纹状体中型多棘神经元中抑制(或降低)htt基因的表达降低了亨廷顿氏舞蹈病在受试者中的作用。作为另一个非限制性实例，在纹状体星形胶质细胞中抑制(或降低)htt基因的表达降低了亨廷顿氏舞蹈病在受试者中的作用。在一些方面，抑制htt基因表达是指抑制或降低至少约20％，优选地至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％。因此，靶标基因的蛋白产物可被抑制至少约20％，优选地至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％。

在一个实施方案中，本发明提供了使用sirna双链体或dsrna在细胞中抑制/沉默至少约40％htt基因表达的方法。细胞可以是神经元(例如，壳或尾状核的中型多棘神经元和大脑皮质中的皮质神经元)、星形胶质细胞(例如，纹状体中的星形胶质细胞、大脑皮质中的皮质星形胶质细胞)和/或少突胶质细胞。作为非限制性实例，在壳和皮质中抑制(或降低)至少40％的htt基因表达降低了亨廷顿氏舞蹈病在受试者中的作用。作为另一个非限制性实例，在纹状体中型多棘神经元中抑制(或降低)至少40％的htt基因表达降低了亨廷顿氏舞蹈病在受试者中的作用。作为另一个非限制性实例，在壳中抑制(或降低)至少40％的htt基因表达以及在皮质中抑制(或降低)至少20％的htt基因表达降低了亨廷顿氏舞蹈病在受试者中的作用。作为另一个非限制性实例，在纹状体星形胶质细胞中抑制(或降低)至少40％的htt基因表达降低了亨廷顿氏舞蹈病在受试者中的作用。

在一些实施方案中，本发明提供了在有治疗需求的受试者中治疗或缓解亨廷顿氏舞蹈病的方法，所述亨廷顿氏舞蹈病与htt基因(例如，cag扩增的htt基因)以及所得htt蛋白(例如，poly-q蛋白)有关，方法包括向受试者施用药学有效量的至少一种靶向htt基因(例如，cag扩增的htt基因)的sirna双链体，将所述sirna双链体递送到靶标细胞中，抑制htt基因(例如，cag扩增的htt基因)表达以及所得的蛋白生产，以及在受试者中缓解hd的症状。

在一些实施方案中，向需要治疗和/或缓解hd的受试者施用aav载体，所述aav载体包含编码至少一种靶向htt基因的sirna双链体的核酸序列。aav载体血清型可选自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav9.47、aav9(hu14)、aav10、aav11、aav12、aavrh8、aavrh10、aav-dj8、aav-dj、aav-php.a(php.a)和/或aav-php.b(php.b)及其变体。

在一些实施方案中，可以将靶向htt基因的sirna双链体或dsrna或包含这类sirna编码分子的aav载体直接引入受试者的中枢神经系统，例如通过颅内注射。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物用作单独治疗。在其它实施方案中，本发明的药物组合物用于联合治疗。联合治疗可以与一种或多种神经保护剂(如小分子化合物、生长因子和激素)联合使用，这些神经保护剂已被测试对神经元退化具有神经保护作用。

在一些实施方案中，本发明提供了通过向有需求的受试者施用治疗有效量的本文所述的质粒或aav载体治疗或缓解亨廷顿氏舞蹈病的方法。

在一些实施方案中，本发明提供了一种通过向受试者施用组合物而在受试者中枢神经系统区域中抑制htt基因表达的方法，所述组合物包含至少一种腺相关病毒(aav)载体，所述载体包含位于两个反向末端重复序列(itr)之间的核酸序列。位于两个反向末端重复序列(itr)之间的核酸序列可包含形成sirna双链体的反义链和正义链，当表达时其抑制或压制受试者中htt的表达。可在受试者区域中降低表达，例如但不限于受试者的前脑或者前脑区域，例如但不限于壳中。前脑或前脑区域(例如，壳)中htt的表达可降低40-70％、40-60％、50-70％、50-60％或可降低50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％或60％。

在一些实施方案中，本发明提供了一种在有需求的受试者中治疗亨廷顿氏舞蹈病(hd)的方法。该方法可以在受试者中枢神经系统区域中抑制htt基因的表达，方法包括向受试者施用组合物，所述组合物包含至少一种腺相关病毒(aav)载体，所述载体包含位于两个反向末端重复序列(itr)之间的核酸序列。核酸序列可包含形成sirna双链体的反义链和正义链，当表达时其抑制或压制所述受试者中htt的表达。可在受试者区域中降低表达，例如但不限于受试者的前脑或者前脑区域，例如但不限于壳中。前脑或前脑区域(例如，壳)中htt的表达可降低40-70％、40-60％、50-70％、50-60％或可降低50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％或60％。

具体实施方式

本发明涉及作为治疗剂的调节性多核苷酸，例如rna或dna分子。rna干扰介导的基因沉默可以特异性地抑制靶标基因的表达。如本文所用，“调节性多核苷酸”是能够调节(增加或降低)靶标基因水平或量(例如，mrna或蛋白水平)的任何核酸序列。然后，本发明提供了靶向htt基因的小双链rna(dsrna)分子(小干扰rna，sirna)、包含这类sirna的药物组合物、以及它们的设计方法。本发明还提供了将其用于抑制htt基因表达和蛋白生产、用于治疗神经退行性疾病特别是亨廷顿氏舞蹈病(hd)的方法。

本发明提供了小干扰rna(sirna)双链体(和编码它们的调节性多核苷酸)，其靶向httmrna以干扰htt基因的表达和/或htt蛋白的生产。

在一些实施方案中，将编码这类sirna分子或sirna分子一条链的核酸序列插入腺相关病毒载体中并导入细胞，特别是神经元和/或中枢神经系统中的其它周围细胞。

本发明的编码的sirna双链体含有反义链和正义链，其杂交在一起形成双链体结构，其中反义链与靶标htt基因的核酸序列互补，并且其中正义链与靶标htt基因的核酸序列同源。在一些方面，反义链的5′末端具有5′磷酸基团，且正义链的3′末端含有3′羟基。在其它方面，在每条链的3′末端没有、有1或2个核苷酸突出端。

根据本发明，靶向htt基因的sirna双链体的每条链约为19至25、19至24或19至21个核苷酸长，优选地约19个核苷酸、20个核苷酸、21个核苷酸、22个核苷酸、23个核苷酸、24个核苷酸或25个核苷酸长。在一些方面，sirna可以是未修饰的rna分子。

在其它方面，sirna可含有至少一个经修饰的核苷酸，例如碱基、糖或主链修饰。

在一个实施方案中，sirna或dsrna包括至少两个彼此互补的序列。dsrna包括具有第一序列的正义链和具有第二序列的反义链。反义链包括与编码htt的mrna中至少一部分基本上互补的核苷酸序列，互补区为30个核苷酸或更少，并且至少15个核苷酸长。通常，dsrna是19至25、19至24或19至21个核苷酸长。在一些实施方案中，dsrna为约15至约25个核苷酸长，并且在其它实施方案中，dsrna为约25至约30个核苷酸长。

直接施用或编码于表达载体中的dsrna在与表达htt蛋白的细胞接触后，抑制htt蛋白表达的至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％或至少40％或者更多，例如当通过本文所述的方法测定时。

本文所述组合物中包含的sirna分子包含具有反义链(反义链)的dsrna，所述反义链具有30个核苷酸或更少的区域，通常为19至25、19至24或19至21个核苷酸长，其与htt基因mrna转录物的至少部分基本上互补。

根据本发明，产生aav载体，其包含靶向htt基因的sirna双链体、sirna双链体或dsrna的一条链的核酸，其中aav载体血清型可以是aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav9.47、aav9(hu14)、aav10、aav11、aav12、aavrh8、aavrh10、aav-dj8、aav-dj、aav-php.a(php.a)和/或aav-php.b(php.b)及其变体。

根据本发明，hd中靶向htt基因的sirna双链体或编码的dsrna选自表7或表8所列sirna双链体。在一些实施方案中，hd中靶向htt的sirna双链体或dsrna为d-3500至d-3570。

本发明还提供了药物组合物，其包含至少一种靶向htt基因的sirna双链体和药学上可接受的载体。在一些方面，sirna双链体由aav载体编码。

在一些实施方案中，本发明提供了抑制/沉默细胞中htt基因表达的方法。因此，sirna双链体或编码的dsrna可用于基本上抑制细胞中特别是神经元中htt基因的表达。在一些方面，抑制htt基因表达是指抑制至少约15％，例如至少约16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％和100％，或至少15-20％、15-30％、15-40％、15-50％、15-60％、15-70％、15-80％、15-90％、15-95％、20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、55-60％、55-70％、55-80％、55-90％、55-95％、55-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。因此，靶标基因的蛋白产物可被抑制至少约15％，优选地至少约16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％和100％，或至少15-20％、15-30％、15-40％、15-50％、15-60％、15-70％、15-80％、15-90％、15-95％、20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。

在一些实施方案中，本发明提供了抑制/沉默细胞中htt基因表达的方法，特别是在中型多棘神经元中。在一些方面，抑制htt基因表达是指抑制至少约15％，例如至少约16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％和100％，或至少15-20％、15-30％、15-40％、15-50％、15-60％、15-70％、15-80％、15-90％、15-95％、20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、55-60％、55-70％、55-80％、55-90％、55-95％、55-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。因此，靶标基因的蛋白产物可被抑制至少约15％，优选地至少约16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％和100％，或至少15-20％、15-30％、15-40％、15-50％、15-60％、15-70％、15-80％、15-90％、15-95％、20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、55-60％、55-70％、55-80％、55-90％、55-95％、55-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。

在一些实施方案中，本发明提供了抑制/沉默细胞中基因表达的方法，特别是在运动神经元中。在一些方面，抑制基因表达是指抑制至少约15％，例如至少约16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％和100％，或至少15-20％、15-30％、15-40％、15-50％、15-60％、15-70％、15-80％、15-90％、15-95％、20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、55-60％、55-70％、55-80％、55-90％、55-95％、55-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。因此，靶标基因的蛋白产物可被抑制至少约15％，优选地至少约16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％和100％，或至少15-20％、15-30％、15-40％、15-50％、15-60％、15-70％、15-80％、15-90％、15-95％、20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、55-60％、55-70％、55-80％、55-90％、55-95％、55-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。

在一些实施方案中，本发明提供了抑制/沉默细胞中htt基因表达的方法，特别是在星形胶质细胞中。在一些方面，抑制htt基因表达是指抑制至少约15％，例如至少约16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％和100％，或至少15-20％、15-30％、15-40％、15-50％、15-60％、15-70％、15-80％、15-90％、15-95％、20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、55-60％、55-70％、55-80％、55-90％、55-95％、55-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。因此，靶标基因的蛋白产物可被抑制至少约15％，优选地至少约16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％和100％，或至少15-20％、15-30％、15-40％、15-50％、15-60％、15-70％、15-80％、15-90％、15-95％、20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、55-60％、55-70％、55-80％、55-90％、55-95％、55-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。

在一个实施方案中，sirna双链体或编码的dsrna可用于降低htt蛋白表达的至少约15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％和100％，或至少15-20％、15-30％、15-40％、15-50％、15-60％、15-70％、15-80％、15-90％、15-95％、20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、55-60％、55-70％、55-80％、55-90％、55-95％、55-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。作为非限制性实例，htt蛋白的表达可降低50-90％。作为非限制性实例，htt蛋白的表达可降低30-70％。作为非限制性实例，蛋白的表达可降低20-70％。作为非限制性实例，蛋白的表达可降低15-30％。

在一个实施方案中，sirna双链体或编码的dsrna可用于降低httmrna表达的至少约15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％和100％，或至少15-20％、15-30％、15-40％、15-50％、15-60％、15-70％、15-80％、15-90％、15-95％、20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、55-60％、55-70％、55-80％、55-90％、55-95％、55-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。作为非限制性实例，httmrna的表达可降低50-90％。作为非限制性实例，httmrna的表达可降低30-70％。作为非限制性实例，httmrna的表达可降低20-70％。作为非限制性实例，httmrna的表达可降低15-30％。

在一个实施方案中，sirna双链体或编码的dsrna可用于降低htt蛋白和/或mrna在至少一个cns区域(例如但不限于中脑)中的表达。在至少一个cns区域中htt蛋白和/或mrna的表达降低至少约15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％和100％，或至少15-20％、15-30％、15-40％、15-50％、15-60％、15-70％、15-80％、15-90％、15-95％、20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、55-60％、55-70％、55-80％、55-90％、55-95％、55-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在纹状体和/或皮质中的表达降低了50-90％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在纹状体中的表达降低了40-50％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在纹状体中的表达降低了20-50％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在纹状体中的表达降低了15-50％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在皮质中的表达降低了40-50％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在皮质中的表达降低了30-70％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在皮质中的表达降低了20-70％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在皮质中的表达降低了15-70％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在皮质中的表达降低了20-70％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在纹状体和/或皮质中的表达降低了15-70％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在纹状体和/或皮质中的表达降低了40-70％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在纹状体和/或皮质中的表达降低了40-50％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在纹状体和/或皮质中的表达降低了50-70％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在纹状体和/或皮质中的表达降低了50-60％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在纹状体和/或皮质中的表达降低了50％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在纹状体和/或皮质中的表达降低了51％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在纹状体和/或皮质中的表达降低了52％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在纹状体和/或皮质中的表达降低了53％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在纹状体和/或皮质中的表达降低了54％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在纹状体和/或皮质中的表达降低了55％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在纹状体和/或皮质中的表达降低了56％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在纹状体和/或皮质中的表达降低了57％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在纹状体和/或皮质中的表达降低了58％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在纹状体和/或皮质中的表达降低了59％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在纹状体和/或皮质中的表达降低了60％。

在一个实施方案中，sirna双链体或编码的dsrna可用于降低htt蛋白和/或mrna在至少一个cns区域(例如但不限于前脑)中的表达。在至少一个cns区域中htt蛋白和/或mrna的表达降低至少约15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％和100％，或至少15-20％、15-30％、15-40％、15-50％、15-60％、15-70％、15-80％、15-90％、15-95％、20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、55-60％、55-70％、55-80％、55-90％、55-95％、55-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在壳中的表达降低了50-90％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在纹状体中的表达降低了40-50％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在皮质中的表达降低了40-50％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在皮质中的表达降低了30-70％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在皮质中的表达降低了20-70％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在皮质中的表达降低了15-70％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在纹状体和/或皮质中的表达降低了15-70％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在纹状体和/或皮质中的表达降低了20-70％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在纹状体和/或皮质中的表达降低了40-70％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在纹状体和/或皮质中的表达降低了40-50％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在纹状体和/或皮质中的表达降低了50-70％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在纹状体和/或皮质中的表达降低了50-60％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在纹状体和/或皮质中的表达降低了50％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在纹状体和/或皮质中的表达降低了51％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在纹状体和/或皮质中的表达降低了52％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在纹状体和/或皮质中的表达降低了53％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在纹状体和/或皮质中的表达降低了54％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在纹状体和/或皮质中的表达降低了55％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在纹状体和/或皮质中的表达降低了56％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在纹状体和/或皮质中的表达降低了57％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在纹状体和/或皮质中的表达降低了58％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在纹状体和/或皮质中的表达降低了59％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在纹状体和/或皮质中的表达降低了60％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在纹状体和/或皮质中的表达降低了61％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在纹状体和/或皮质中的表达降低了62％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在纹状体和/或皮质中的表达降低了63％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在纹状体和/或皮质中的表达降低了64％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在纹状体和/或皮质中的表达降低了65％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在纹状体和/或皮质中的表达降低了66％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在纹状体和/或皮质中的表达降低了67％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在纹状体和/或皮质中的表达降低了68％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在纹状体和/或皮质中的表达降低了69％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在纹状体和/或皮质中的表达降低了70％。

在一个实施方案中，sirna双链体或编码的dsrna可用于降低htt蛋白和/或mrna在壳中的表达。在至少一个cns区域中htt蛋白和/或mrna的表达降低至少约15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％和100％，或至少15-20％、15-30％、15-40％、15-50％、15-60％、15-70％、15-80％、15-90％、15-95％、20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、55-60％、55-70％、55-80％、55-90％、55-95％、55-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在壳中的表达降低了40-50％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在壳中的表达降低了50-70％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在壳中的表达降低了50-60％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在壳中的表达降低了50％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在壳中的表达降低了51％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在壳中的表达降低了52％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在壳中的表达降低了53％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在壳中的表达降低了54％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在壳中的表达降低了55％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在壳中的表达降低了56％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在壳中的表达降低了57％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在壳中的表达降低了58％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在壳中的表达降低了59％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在壳中的表达降低了60％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在壳中的表达降低了61％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在壳中的表达降低了62％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在壳中的表达降低了63％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在壳中的表达降低了64％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在壳中的表达降低了65％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在壳中的表达降低了66％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在壳中的表达降低了67％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在壳中的表达降低了68％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在壳中的表达降低了69％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在壳中的表达降低了70％。

在一个实施方案中，sirna双链体或编码的dsrna可用于降低htt蛋白和/或mrna在皮质中的表达。htt蛋白和/或mrna的表达降低至少约15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％和100％，或至少15-20％、15-30％、15-40％、15-50％、15-60％、15-70％、15-80％、15-90％、15-95％、20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在皮质中的表达降低了40-50％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在皮质中的表达降低了30-70％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在皮质中的表达降低了20-70％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在皮质中的表达降低了15-70％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在皮质中的表达降低了至少30％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在皮质中的表达降低了40-70％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在皮质中的表达降低了40-50％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在皮质中的表达降低了50-70％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在皮质中的表达降低了50-60％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在皮质中的表达降低了50％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在皮质中的表达降低了51％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在皮质中的表达降低了52％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在皮质中的表达降低了53％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在皮质中的表达降低了54％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在皮质中的表达降低了55％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在皮质中的表达降低了56％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在皮质中的表达降低了57％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在皮质中的表达降低了58％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在皮质中的表达降低了59％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在皮质中的表达降低了60％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在皮质中的表达降低了61％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在皮质中的表达降低了62％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在皮质中的表达降低了63％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在皮质中的表达降低了64％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在皮质中的表达降低了65％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在皮质中的表达降低了66％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在皮质中的表达降低了67％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在皮质中的表达降低了68％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在皮质中的表达降低了69％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在皮质中的表达降低了70％。

在一个实施方案中，sirna双链体或编码的dsrna可用于降低htt蛋白和/或mrna在运动皮质中的表达。htt蛋白和/或mrna的表达降低至少约15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％和100％，或至少15-20％、15-30％、15-40％、15-50％、15-60％、15-70％、15-80％、15-90％、15-95％、20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在运动皮质中的表达降低了40-50％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在运动皮质中的表达降低了30-70％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在运动皮质中的表达降低了20-70％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在运动皮质中的表达降低了15-70％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在运动皮质中的表达降低了至少30％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在运动皮质中的表达降低了40-70％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在运动皮质中的表达降低了50-70％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在运动皮质中的表达降低了50-60％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在运动皮质中的表达降低了50％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在运动皮质中的表达降低了51％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在运动皮质中的表达降低了52％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在运动皮质中的表达降低了53％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在运动皮质中的表达降低了54％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在运动皮质中的表达降低了55％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在运动皮质中的表达降低了56％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在运动皮质中的表达降低了57％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在运动皮质中的表达降低了58％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在运动皮质中的表达降低了59％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在运动皮质中的表达降低了60％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在运动皮质中的表达降低了61％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在运动皮质中的表达降低了62％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在运动皮质中的表达降低了63％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在运动皮质中的表达降低了64％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在运动皮质中的表达降低了65％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在运动皮质中的表达降低了66％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在运动皮质中的表达降低了67％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在运动皮质中的表达降低了68％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在运动皮质中的表达降低了69％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在运动皮质中的表达降低了70％。

在一个实施方案中，sirna双链体或编码的dsrna可用于降低htt蛋白和/或mrna在躯体感觉皮质中的表达。htt蛋白和/或mrna的表达降低至少约15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％和100％，或至少15-20％、15-30％、15-40％、15-50％、15-60％、15-70％、15-80％、15-90％、15-95％、20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在躯体感觉皮质中的表达降低了40-50％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在躯体感觉皮质中的表达降低了30-70％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在躯体感觉皮质中的表达降低了20-70％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在躯体感觉皮质中的表达降低了15-70％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在躯体感觉皮质中的表达降低了至少30％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在躯体感觉皮质中的表达降低了40-70％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在躯体感觉皮质中的表达降低了40-50％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在躯体感觉皮质中的表达降低了50-70％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在躯体感觉皮质中的表达降低了50-60％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在躯体感觉皮质中的表达降低了50％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在躯体感觉皮质中的表达降低了51％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在躯体感觉皮质中的表达降低了52％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在躯体感觉皮质中的表达降低了53％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在躯体感觉皮质中的表达降低了54％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在躯体感觉皮质中的表达降低了55％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在躯体感觉皮质中的表达降低了56％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在躯体感觉皮质中的表达降低了57％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在躯体感觉皮质中的表达降低了58％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在躯体感觉皮质中的表达降低了59％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在躯体感觉皮质中的表达降低了60％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在躯体感觉皮质中的表达降低了61％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在躯体感觉皮质中的表达降低了62％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在躯体感觉皮质中的表达降低了63％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在躯体感觉皮质中的表达降低了64％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在躯体感觉皮质中的表达降低了65％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在躯体感觉皮质中的表达降低了66％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在躯体感觉皮质中的表达降低了67％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在躯体感觉皮质中的表达降低了68％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在躯体感觉皮质中的表达降低了69％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在躯体感觉皮质中的表达降低了70％。

在一个实施方案中，sirna双链体或编码的dsrna可用于降低htt蛋白和/或mrna在颞叶皮质中的表达。htt蛋白和/或mrna的表达降低至少约15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％和100％，或至少15-20％、15-30％、15-40％、15-50％、15-60％、15-70％、15-80％、15-90％、15-95％、20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在颞叶皮质中的表达降低了40-50％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在颞叶皮质中的表达降低了30-70％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在颞叶皮质中的表达降低了20-70％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在颞叶皮质中的表达降低了15-70％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在颞叶皮质中的表达降低了至少30％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在颞叶皮质中的表达降低了40-70％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在颞叶皮质中的表达降低了50-70％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在颞叶皮质中的表达降低了50-60％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在颞叶皮质中的表达降低了50％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在颞叶皮质中的表达降低了51％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在颞叶皮质中的表达降低了52％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在颞叶皮质中的表达降低了53％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在颞叶皮质中的表达降低了54％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在颞叶皮质中的表达降低了55％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在颞叶皮质中的表达降低了56％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在颞叶皮质中的表达降低了57％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在颞叶皮质中的表达降低了58％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在颞叶皮质中的表达降低了59％。作为非限制性实例，htt蛋白和mrna在颞叶皮质中的表达降低了60％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在颞叶皮质中的表达降低了61％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在颞叶皮质中的表达降低了62％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在颞叶皮质中的表达降低了63％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在颞叶皮质中的表达降低了64％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在颞叶皮质中的表达降低了65％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在颞叶皮质中的表达降低了66％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在颞叶皮质中的表达降低了67％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在颞叶皮质中的表达降低了68％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在颞叶皮质中的表达降低了69％。作为非限制性实例，蛋白和mrna在颞叶皮质中的表达降低了70％。

在一些实施方案中，本发明提供了在有治疗需求的受试者中治疗或缓解与htt基因和/或htt蛋白相关的亨廷顿氏舞蹈病的方法，该方法包括向受试者施用药学有效量的至少一种靶向htt基因的sirna双链体或编码sirna双链体的核酸，将所述sirna双链体(或编码的双链体)递送到靶标细胞中，抑制htt基因表达和蛋白生产，并缓解受试者中hd的症状。

在一些实施方案中，向有治疗和/或缓解hd需求的受试者施用aav载体，所述载体包含至少一种靶向htt基因的sirna双链体的核酸序列。aav载体血清型可选自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav9.47、aav9(hu14)、aav10、aav11、aav12、aavrh8、aavrh10、aav-dj8、aav-dj、aav-php.a(php.a)和/或aav-php.b(php.b)及其变体。在一个实施方案中，aav载体血清型是aav1。在一个实施方案中，aav载体血清型是aav2。在另一个实施方案中，aav载体血清型是aav5(例如，如miniarikova等人molther(2016)5，e297和国际公开号wo2016102664所述；其各自的内容通过引用整体并入本文)。在另一个实施方案中，aav载体是aav-dj。在另一个实施方案中，aav载体血清型是aav-dj8。

在一个实施方案中，可用于本发明的血清型可以是aav-dj8。aav-dj8的氨基酸序列可以包含两个或更多个突变以去除肝素结合结构域(hbd)。作为非限制性实例，aav-dj8序列在美国专利号7,588,772中描述为seqidno：1，内容通过引用整体并入本文，其可包含两个突变：(1)r587q，其中氨基酸587处的精氨酸(r；arg)变为谷氨酰胺(q；gln)，和(2)r590t，其中氨基酸590处的精氨酸(r；arg)变为苏氨酸(t；thr)。作为另一个非限制性实例，可包含三个突变：(1)k406r，其中氨基酸406处的赖氨酸(k；lys)变为精氨酸(r；arg)，(2)r587q，其中氨基酸587处的精氨酸(r；arg)变为谷氨酰胺(q；gln)，和(3)r590t，其中氨基酸590处的精氨酸(r；arg)变为苏氨酸(t；thr)。

在一些实施方案中，sirna分子或包含这类sirna分子的aav载体可以直接引入受试者的中枢神经系统，例如输注到壳中。

在一些实施方案中，sirna分子或包含这类sirna分子的aav载体可以直接引入受试者的中枢神经系统，例如输注到受试者的丘脑中。虽然不希望受到理论的束缚，但丘脑是大脑中的一个区域，其在亨廷顿氏舞蹈病的受试者中相对幸免(spared)，这意味着可以允许通过aav载体的轴突运输进行更广泛的皮质转导。

在一些实施方案中，sirna分子或包含这类sirna分子的aav载体可以间接引入受试者的中枢神经系统，例如通过静脉内施用。

在一些实施方案中，sirna分子或包含这类sirna分子的aav载体可以间接引入受试者的中枢神经系统，例如输注到受试者的白质。虽然不希望受到理论的束缚，通过直接白质输注的分布可能与可能会在亨廷顿氏舞蹈病的受试者中受损的轴突运输机制无关，这意味着白质输注可能允许转运更多的aav载体。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物用作单独治疗。在其它实施方案中，本发明的药物组合物用于联合治疗。联合治疗可以与一种或多种神经保护剂(如小分子化合物、生长因子和激素)联合使用，这些神经保护剂已被测试对神经元退化具有神经保护作用。

在一些实施方案中，本发明提供了通过向有需求的受试者施用治疗有效量的本文所述的质粒或aav载体治疗或缓解亨廷顿氏舞蹈病(hd)的方法。

在下面的随附描述中阐述了本发明的一个或多个实施方案的细节。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何材料和方法可用于本发明的实践或测试，现在描述优选的材料和方法。根据描述，本发明的其它特征、目的和优点将显而易见。在说明书中，除非上下文另有明确规定，否则单数形式也包括复数形式。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。如有冲突，以本说明书为准。

i.本发明的组合物

亨廷顿氏舞蹈病(hd)

亨廷顿氏舞蹈病(hd)是一种单基因致命性神经退行性疾病，其特征是进行性舞蹈样运动、神经精神性和认知功能障碍。已知亨廷顿氏舞蹈病是由亨廷顿蛋白(hit)基因中常染色体显性三联体(cag)重复扩增引起的，所述基因编码在其n末端带有聚谷氨酰胺延伸片段的htt蛋白。这种重复扩增导致htt功能的毒性增加，并最终导致纹状体神经退化，其进展为广泛的脑萎缩。纹状体的中型多棘神经元在hd中显得尤为脆弱，损失高达95％，而中间神经元则很大程度上幸免。

亨廷顿氏舞蹈病对生活质量有显著影响。症状通常出现在35-44岁之间，疾病发作后的平均预期寿命为10-25年。在小比例的hd群体中(约6％)，疾病发作发生在21岁前并且出现强直综合征。这些病例的发展速度往往比晚发作的病例更快，并且已被分类为幼年型或westphal变异型hd。据估计，在美国和欧洲目前约有35,000-70,000名患者患有hd。目前，只有症状缓解和支持疗法可用于治疗hd，能否治愈有待确定。最终，患有hd的个体会死于肺炎、心力衰竭或其它并发症，例如跌倒造成的身体伤害。

虽然不希望受理论束缚，但野生型htt蛋白的功能可以作为协调其它蛋白复合物的支架。htt是非常大的蛋白(67个外显子，3144个氨基酸，约350kda)，其经历广泛的翻译后修饰，并且具有许多与其它蛋白相互作用的位点，特别是在其n末端(同时也是在hd中携带重复片段的区域)。htt主要定位于细胞质，但已被证明可以穿梭进入细胞核，在那里它可以调节基因转录。还有人提出htt在囊泡运输和调节rna运输中起作用。

作为非限制性实例，htt蛋白序列是seqidno：1(ncbinp_002102.4)，htt核酸序列是seqidno：2(ncbinm_002111.7)。

聚谷氨酰胺扩增的htt蛋白破坏正常htt功能并导致神经毒性的机制最初被认为是单倍体剂量不足的疾病，当人类htt基因的末端缺失未导致hd发展时，该理论被证实是不正确的，表明完全表达的htt蛋白对生存并不重要。然而，小鼠中htt的条件性敲除导致神经退化，表明一定量的htt是细胞生存所必需的。亨廷顿蛋白在所有细胞中表达，尽管其浓度在脑中最高，其中在神经元细胞核中发现巨大的异常htt聚集体。在hd患者的脑中，htt聚集成异常的核内含物。现在认为正是这种错误折叠和聚集的过程以及相关的蛋白中间体(即可溶性物质和毒性n末端片段)导致神经毒性。事实上，hd属于另外九种人类遗传疾病的家族，所有这些疾病的特征都在于cag扩增的基因和所得的聚谷氨酰胺(poly-q)蛋白产物，其随后形成神经元内聚集体。有趣的是，在所有这些疾病中，扩增的长度与发作年龄和疾病进展速度相关，较长的扩增与较严重的疾病相关。

关于聚谷氨酰胺扩增的htt蛋白及其所得聚集体神经毒性的分子机制的假设已经非常广泛，但包括半胱天冬酶活化、转录途径的失调、活性氧物质的产生增加、线粒体功能障碍、轴突运输受损和/或抑制细胞内的蛋白降解系统。聚谷氨酰胺扩增的htt不仅具有功能的毒性增加，而且还通过干扰其它细胞蛋白和过程的正常功能而发挥显性负面作用。htt还涉及非细胞自主神经毒性，其中携带htt的细胞将htt扩散到附近的其它神经元。

例如，对hd动物模型的研究表明，在调节表达模型中在基因关闭后，表型逆转是可行的。在允许关闭94-聚谷氨酰胺重复htt蛋白表达的小鼠模型中，不仅临床综合征被逆转，而且细胞内聚集体也被消解。此外，在动物模型中测试了htt沉默，其显示出有希望的结果，治疗既耐受良好又显示出潜在的治疗益处。

本发明提供了调节性多核苷酸，例如，靶向htt基因的sirna分子及其设计和制造方法。尽管不希望受单一可操作性理论的束缚，但本发明提供了干扰htt表达(包括htt突变体和/或野生型htt基因表达)的调节性多核苷酸，包括sirna。特别地，本发明使用病毒载体，例如腺相关病毒(aav)载体，其包含编码本发明sirna分子的核酸序列。包含编码本发明sirna分子的核酸序列的aav载体可以增加活性剂向感兴趣的神经元中的递送，例如纹状体的中型多棘神经元和皮质神经元。靶向htt基因的sirna双链体或编码dsrna可能能够显著抑制细胞内htt基因表达(例如，mrna水平)；因此，缓解了htt表达诱导的细胞内压力(stress)，如蛋白的聚集和包涵体的形成、增加的自由基、线粒体功能障碍和rna代谢。

hd的症状可包括归因于cns退化的特征(例如但不限于舞蹈病、肌张力障碍、运动迟缓、不协调、烦躁和抑郁、难以解决问题、在正常的一天中人日常生活的功能降低、言语减少和吞咽困难)，以及不归因于cns退化的特征(例如但不限于体重减轻、肌肉萎缩、代谢功能障碍和内分泌紊乱)。

这种sirna介导的htt表达抑制可用于治疗hd。根据本发明，治疗和/或缓解患者hd的方法包括向患者施用有效量的aav载体到细胞中，该载体包含编码本发明sirna分子的核酸序列。施用包含这类核酸序列的aav载体将编码引起htt基因表达的抑制/沉默的sirna分子。

在一个实施方案中，载体例如aav载体，在有需求的受试者中降低htt的量，从而提供如本文所述的治疗益处。

在一个实施方案中，受试者具有完全外显性(penetrant)hd，其中htt基因具有41个或更多cag重复(例如，41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90或大于90个cag重复)。

在一个实施方案中，受试者具有不完全外显性，其中htt基因具有36至40个cag重复(例如，36、37、38、39和40个cag重复)。

可与本文所述sirna和载体一起使用的、用于研究亨廷顿氏舞蹈病的模型系统包括但不限于细胞模型(例如，原代神经元和诱导多能干细胞)、无脊椎动物模型(例如，果蝇(drosophila)或秀丽新小杆线虫(caenorhabditiselegans))、小鼠模型(例如，yac128小鼠模型；r6/2小鼠模型；bac、yac和敲入小鼠模型)、大鼠模型(例如，bac)和大型哺乳动物模型(例如，猪、羊或猴)。

调节性多核苷酸

在一个实施方案中，调节性多核苷酸，例如，rna或dna分子，可用于治疗神经退行性疾病，特别是亨廷顿氏舞蹈病(hd)。如本文所用，“调节性多核苷酸”是任何能够调节(增加或降低)靶标基因的水平或量(例如，mrna或蛋白水平)的核酸序列。

在一个实施方案中，调节性多核苷酸可包含至少一个核酸序列，其编码至少一个sirna分子。如果存在多于一个核酸，则核酸可以独立地编码1、2、3、4、5、6、7、8、9或大于9个sirna分子。

sirna分子

本发明涉及rna干扰(rnai)诱导的基因表达抑制，用以治疗神经退行性疾病。本文提供了靶向htt基因的sirna双链体或编码的dsrna(本文统称为“sirna分子”)。这类sirna双链体或编码的dsrna可以降低或沉默细胞中的htt基因表达，例如中型多棘神经元、皮质神经元和/或星形胶质细胞，从而缓解亨廷顿氏舞蹈病(hd)的症状。

rnai(也称为转录后基因沉默(ptgs)、基因压制(quelling)或共抑制)是转录后基因沉默过程，其中rna分子通常通过引起特定mrna分子的破坏以序列特异性方式抑制基因表达。rnai的活性成分是短/小双链rna(dsrna)，称为小干扰rna(sirna)，其通常含有15-30个核苷酸(例如，19至25、19至24或19-21个核苷酸)和2个核苷酸3′突出端，并且匹配靶标基因的核酸序列。这些短rna种类可以通过dicer介导的较大dsrna的切割在体内天然产生，并且它们在哺乳动物细胞中是有功能的。

天然表达的小rna分子，称为微小rna(mirna)，通过调节mrna的表达引发基因沉默。含有mirna的rna诱导的沉默复合物(risc)靶向与mirna5′区域中核苷酸2-7(被称为种子区)呈现完美序列互补性的mrna，并且其它碱基与其3′区域配对。mirna介导的基因表达下调可能是由靶标mrna的切割、靶标mrna的翻译抑制或mrna衰变引起的。mirna靶向序列通常位于靶标mrna的3′-utr中。单个mirna可以靶向来自各种基因的超过100个转录物，并且一个mrna可以被不同的mirna靶向。

可以在体外设计并合成靶向特定mrna的sirna双链体或dsrna，并将其引入细胞中以激活rnai过程。elbashir等人证明21个核苷酸的sirna双链体(称为小干扰rna)能够在哺乳动物细胞中发挥强效且特异性的基因敲除而不诱导免疫应答(elbashirsm等人，nature，2001，411，494-498)。自首次报告以来，sirna的转录后基因沉默很快成为哺乳动物细胞遗传分析的有力工具，并有可能产生新型疗法。

设计用于靶向编码聚谷氨酰胺重复蛋白的核酸序列的rnai分子描述于美国专利号9,169,483和9,181,544以及国际专利公开号wo2015179525中，其各自的内容通过引用整体并入本文，其中所述聚谷氨酰胺重复蛋白引起聚谷氨酰胺扩增疾病，如亨廷顿氏舞蹈病。美国专利号9,169,483和9,181,544以及国际专利公开号wo2015179525各自提供分离的rna双链体，其包含第一rna链(例如，15个连续核苷酸)和第二rna链(例如，与第一链的至少12个连续核苷酸互补)，其中rna双链体的长度约为15至30个碱基对。第一rna链和第二rna链可以通过rna环(约4至50个核苷酸)有效地连接以形成可以插入表达盒中的发夹结构。环部分的非限制性实例包括美国专利号9,169,483的seqidno：9-14，其内容通过引用整体并入本文。无论是全序列还是部分序列，可用于形成rna双链体的rna链的非限制性实例包括美国专利号9,169,483的seqidno：1-8、和美国专利号9,181,544的seqidno：1-11、33-59、208-210、213-215和218-221，其各自的内容通过引用整体并入本文。rnai分子的非限制性实例包括美国专利号9,169,483的seqidno：1-8、美国专利号9,181,544的seqidno：1-11、33-59、208-210、213-215和218-221以及国际专利公开号wo2015179525的seqidno：1、6、7和35-38，其各自的内容通过引用整体并入本文。

可以将体外合成的sirna分子引入细胞中以激活rnai。外源sirna双链体，当它被引入细胞时，类似于内源性dsrna，可以组装形成rna诱导沉默复合物(risc)，这是一种与rna序列相互作用的多单元复合物，所述rna序列与sirna双链体的两条链之一互补(即反义链)。过程期间，sirna的正义链(或过客(passenger)链)从复合物中脱去，而sirna的反义链(或引导链)与其互补性rna匹配。特别地，含sirna的risc复合物的靶标是呈现完美序列互补性的mrna。然后，通过切割、释放和降解靶标而发生sirna介导的基因沉默。

sirna双链体包含与靶标mrna同源的正义链和与靶标mrna互补的反义链，相较于单链(ss)-sirna(例如反义链rna或反义寡核苷酸)而言，sirna双链体在破坏靶标rna的效率方面提供了更多优势。在许多情况下，需要更高浓度的ss-sirna以实现相应双链体的有效基因沉默效力。

可以由aav载体或载体基因组编码任何前述分子。

靶向htt基因的sirna双链体的设计和序列

本领域已经提出了一些设计sirna的指南。这些指南通常建议产生19个核苷酸的双链体区，对称的2-3个核苷酸的3′突出端、5′-磷酸和3′-羟基，其靶向待沉默的基因中的区。可以控制sirna序列偏好的其它规则包括但不限于(i)反义链5′末端的a/u；(ii)正义链5′末端的g/c；(iii)反义链5′末端的三分之一是至少5个a/u残基；以及(iv)没有任何超过9个核苷酸长的gc延伸片段。根据这种考虑，以及靶标基因的特定序列，可以容易地设计对于压制哺乳动物靶标基因表达所必需的有效sirna分子。

根据本发明，设计靶向htt基因的sirna分子(例如，sirna双链体或编码的dsrna)。这种sirna分子可以特异性地压制htt基因表达和蛋白生产。在一些方面，sirna分子被设计并用于选择性地“敲除”细胞中的htt基因变体，即在患有hd疾病的患者中鉴定的突变htt转录物。在一些方面，sirna分子被设计并用于选择性地“敲低”细胞中的htt基因变体。在其它方面，sirna分子能够抑制或压制野生型和突变的htt基因。

在一个实施方案中，本发明的sirna分子包含正义链和互补反义链，其中两条链杂交在一起形成双链体结构。反义链与httmrna序列具有足够的互补性以指导靶标特异性rnai，即sirna分子具有足以通过rnai机制或过程触发靶标mrna破坏的序列。

在一个实施方案中，本发明的sirna分子包含正义链和互补反义链，其中两条链杂交在一起形成双链体结构，并且其中与httmrna杂交的起始位点在httmrna序列的核苷酸100至7000之间。作为非限制性实例，起始位点在httmrna序列上可在核苷酸100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-70、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1050、1050-1100、1100-1150、1150-1200、1200-1250、1250-1300、1300-1350、1350-1400、1400-1450、1450-1500、1500-1550、1550-1600、1600-1650、1650-1700、1700-1750、1750-1800、1800-1850、1850-1900、1900-1950、1950-2000、2000-2050、2050-2100、2100-2150、2150-2200、2200-2250、2250-2300、2300-2350、2350-2400、2400-2450、2450-2500、2500-2550、2550-2600、2600-2650、2650-2700、2700-2750、2750-2800、2800-2850、2850-2900、2900-2950、2950-3000、3000-3050、3050-3100、3100-3150、3150-3200、3200-3250、3250-3300、3300-3350、3350-3400、3400-3450、3450-3500、3500-3550、3550-3600、3600-3650、3650-3700、3700-3750、3750-3800、3800-3850、3850-3900、3900-3950、3950-4000、4000-4050、4050-4100、4100-4150、4150-4200、4200-4250、4250-4300、4300-4350、4350-4400、4400-4450、4450-4500、4500-4550、4550-4600、4600-4650、4650-4700、4700-4750、4750-4800、4800-4850、4850-4900、4900-4950、4950-5000、5000-5050、5050-5100、5100-5150、5150-5200、5200-5250、5250-5300、5300-5350、5350-5400、5400-5450、5450-5500、5500-5550、5550-5600、5600-5650、5650-5700、5700-5750、5750-5800、5800-5850、5850-5900、5900-5950、5950-6000、6000-6050、6050-6100、6100-6150、6150-6200、6200-6250、6250-6300、6300-6350、6350-6400、6400-6450、6450-6500、6500-6550、6550-6600、6600-6650、6650-6700、6700-6750、6750-6800、6800-6850、6850-6900、6900-6950、6950-7000、7000-7050、7050-7100、7100-7150、7150-7200、7200-7250、7250-7300、7300-7350、7350-7400、7400-7450、7450-7500、7500-7550、7550-7600、7600-7650、7650-7700、7700-7750、7750-7800、7800-7850、7850-7900、7900-7950、7950-8000、8000-8050、8050-8100、8100-8150、8150-8200、8200-8250、8250-8300、8300-8350、8350-8400、8400-8450、8450-8500、8500-8550、8550-8600、8600-8650、8650-8700、8700-8750、8750-8800、8800-8850、8850-8900、8900-8950、8950-9000、9000-9050、9050-9100、9100-9150、9150-9200、9200-9250、9250-9300、9300-9350、9350-9400、9400-9450、9450-9500、9500-9550、9550-9600、9600-9650、9650-9700、9700-9750、9750-9800、9800-9850、9850-9900、9900-9950、9950-10000、10000-10050、10050-10100、10100-10150、10150-10200、10200-10250、10250-10300、10300-10350、10350-10400、10400-10450、10450-10500、10500-10550、10550-10600、10600-10650、10650-10700、10700-10750、10750-10800、10800-10850、10850-10900、10900-10950、10950-11000、11050-11100、11100-11150、11150-11200、11200-11250、11250-11300、11300-11350、11350-11400、11400-11450、11450-11500、11500-11550、11550-11600、11600-11650、11650-11700、11700-11750、11750-11800、11800-11850、11850-11900、11900-11950、11950-12000、12000-12050、12050-12100、12100-12150、12150-12200、12200-12250、12250-12300、12300-12350、12350-12400、12400-12450、12450-12500、12500-12550、12550-12600、12600-12650、12650-12700、12700-12750、12750-12800、12800-12850、12850-12900、12900-12950、12950-13000、13050-13100、13100-13150、13150-13200、13200-13250、13250-13300、13300-13350、13350-13400、13400-13450以及13450-13500之间。作为另一个非限制性实例，起始位点在httmrna序列上可以是核苷酸315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890、891、892、893、894、895、896、897、898、899、900、1375、1376、1377、1378、1379、1380、1381、1382、1383、1384、1385、1386、1387、1388、1389、1390、1391、1392、1393、1394、1395、1396、1397、1398、1399、1400、1401、1402、1403、1404、1405、1406、1407、1408、1409、1410、1411、1412、1413、1414、1415、1416、1417、1418、1419、1420、1421、1422、1423、1424、1425、1426、1427、1428、1429、1430、1431、1432、1433、1434、1435、1436、1437、1438、1439、1440、1441、1442、1443、1444、1445、1446、1447、1448、1449、1450、1660、1661、1662、1663、1664、1665、1666、1667、1668、1669、1670、1671、1672、1673、1674、1675、2050、2051、2052、2053、2054、2055、2056、2057、2058、2059、2060、2061、2062、2063、2064、2065、2066、2067、2068、2069、2070、2071、2072、2073、2074、2075、2076、2077、2078、2079、2080、2081、2082、2083、2084、2085、2086、2087、2088、2089、2090、2091、2092、2093、2094、2095、2096、2097、2098、2099、2100、2580、2581、2582、2583、2584、2585、2586、2587、2588、2589、2590、2591、2592、2593、2594、2595、2596、2597、2598、2599、2600、2601、2602、2603、2604、2605、4525、4526、4527、4528、4529、4530、4531、4532、4533、4534、4535、4536、4537、4538、4539、4540、4541、4542、4543、4544、4545、4546、4547、4548、4549、4550、4575、4576、4577、4578、4579、4580、4581、4582、4583、4584、4585、4586、4587、4588、4589、4590、4591、4592、4593、4594、4595、4596、4597、4598、4599、4600、4850、4851、4852、4853、4854、4855、4856、4857、4858、4859、4860、4861、4862、4863、4864、4865、4866、4867、4868、4869、4870、4871、4872、4873、4874、4875、4876、4877、4878、4879、4880、4881、4882、4883、4884、4885、4886、4887、4888、4889、4890、4891、4892、4893、4894、4895、4896、4897、4898、4899、4900、5460、5461、5462、5463、5464、5465、5466、5467、5468、5469、5470、5471、5472、5473、5474、5475、5476、5477、5478、5479、5480、6175、6176、6177、6178、6179、6180、6181、6182、6183、6184、6185、6186、6187、6188、6189、6190、6191、6192、6193、6194、6195、6196、6197、6198、6199、6200、6315、6316、6317、6318、6319、6320、6321、6322、6323、6324、6325、6326、6327、6328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在一些实施方案中，反义链和靶标mrna序列具有100％互补性。反义链可以与靶标mrna序列的任何部分互补。

在其它实施方案中，反义链和靶标mrna序列包含至少一个错配。作为非限制性实例，反义链和靶标mrna序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-99％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-99％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-99％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-99％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-99％、70-80％、70-90％、70-95％、70-99％、80-90％、80-95％、80-99％、90-95％、90-99％或95-99％的互补性。

根据本发明，sirna分子具有约10-50个或更多个核苷酸的长度，即每个链包含10-50个核苷酸(或核苷酸类似物)。优选地，sirna分子的长度为每条链约15-30，例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸，其中一条链与靶标区域充分互补。在一个实施方案中，sirna分子具有约19至25、19至24或19至21个核苷酸的长度。

在一些实施方案中，本发明的sirna分子可以是包含约19个核苷酸至约25个核苷酸的合成rna双链体，并且在3′端具有两个突出的核苷酸。在一些方面，sirna分子可以是未修饰的rna分子。在其它方面，sirna分子可含有至少一种经修饰的核苷酸，例如碱基、糖或主链修饰。

在一个实施方案中，本发明的sirna分子可包含核苷酸序列，例如但不限于表1中的反义(引导)序列或其片段或变体。作为非限制性实例，本发明的sirna分子中使用的反义序列是表1中核苷酸序列的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-99％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-99％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-99％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-99％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-99％、70-80％、70-90％、70-95％、70-99％、80-90％、80-95％、80-99％、90-95％、90-99％或95-99％。作为另一个非限制性实例，在本发明的sirna分子中使用的反义序列包含表1中核苷酸序列的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或大于21个连续核苷酸。作为另一个非限制性实例，本发明的sirna分子中使用的反义序列包含表1中序列的核苷酸1至22、1至21、1至20、1至19、1至18、1至17、1至16、1至15、1至14、1至13、1至12、1至11、1至10、1至9、1至8、2至22、2至21、2至20、2至19、2至18、2至17、2至16、2至15、2至14、2至13、2至12、2至11、2至10、2至9、2至8、3至22、3至21、3至20、3至19、3至18、3至17、3至16、3至15、3至14、3至13、3至12、3至11、3至10、3至9、3至8、4至22、4至21、4至20、4至19、4至18、4至17、4至16、4至15、4至14、4至13、4至12、4至11、4至10、4至9、4至8、5至22、5至21、5至20、5至19、5至18、5至17、5至16、5至15、5至14、5至13、5至12、5至11、5至10、5至9、5至8、6至22、6至21、6至20、6至19、6至18、6至17、6至16、6至15、6至14、6至13、6至12、6至11、6至10、7至22、7至21、7至20、7至19、7至18、7至17、7至16、7至15、7至14、7至13、7至12、8至22、8至21、8至20、8至19、8至18、8至17、8至16、8至15、8至14、8至13、8至12、9至22、9至21、9至20、9至19、9至18、9至17、9至16、9至15、9至14、10至22、10至21、10至20、10至19、10至18、10至17、10至16、10至15、10至14、11至22、11至21、11至20、11至19、11至18、11至17、11至16、11至15、11至14、12至22、12至21、12至20、12至19、12至18、12至17、12至16、13至22、13至21、13至20、13至19、13至18、13至17、13至16、14至22、14至21、14至20、14至19、14至18、14至17、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、16至22、16至21、16至20、17至22、17至21、或18至22。

表1.反义序列

在一个实施方案中，本发明的sirna分子可包含核苷酸序列，例如但不限于表2中的正义(过客)序列或其片段或变体。作为非限制性实例，在本发明的sirna分子中使用的正义序列是表2中核苷酸序列的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-99％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-99％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-99％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-99％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-99％、70-80％、70-90％、70-95％、70-99％、80-90％、80-95％、80-99％、90-95％、90-99％或95-99％。作为另一个非限制性实例，在本发明的sirna分子中使用的正义序列包含表2中核苷酸序列的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或大于21个连续核苷酸。作为另一个非限制性实例，在本发明的sirna分子中使用的正义序列包含表2中序列的核苷酸1至22、1至21、1至20、1至19、1至18、1至17、1至16、1至15、1至14、1至13、1至12、1至11、1至10、1至9、1至8、2至22、2至21、2至20、2至19、2至18、2至17、2至16、2至15、2至14、2至13、2至12、2至11、2至10、2至9、2至8、3至22、3至21、3至20、3至19、3至18、3至17、3至16、3至15、3至14、3至13、3至12、3至11、3至10、3至9、3至8、4至22、4至21、4至20、4至19、4至18、4至17、4至16、4至15、4至14、4至13、4至12、4至11、4至10、4至9、4至8、5至22、5至21、5至20、5至19、5至18、5至17、5至16、5至15、5至14、5至13、5至12、5至11、5至10、5至9、5至8、6至22、6至21、6至20、6至19、6至18、6至17、6至16、6至15、6至14、6至13、6至12、6至11、6至10、7至22、7至21、7至20、7至19、7至18、7至17、7至16、7至15、7至14、7至13、7至12、8至22、8至21、8至20、8至19、8至18、8至17、8至16、8至15、8至14、8至13、8至12、9至22、9至21、9至20、9至19、9至18、9至17、9至16、9至15、9至14、10至22、10至21、10至20、10至19、10至18、10至17、10至16、10至15、10至14、11至22、11至21、11至20、11至19、11至18、11至17、11至16、11至15、11至14、12至22、12至21、12至20、12至19、12至18、12至17、12至16、13至22、13至21、13至20、13至19、13至18、13至17、13至16、14至22、14至21、14至20、14至19、14至18、14至17、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、16至22、16至21、16至20、17至22、17至21或18至22。

表2.正义序列

在一个实施方案中，本发明的sirna分子可包含来自表1的反义序列和来自表2的正义序列或其片段或变体。作为非限制性实例，反义序列和正义序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-99％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-99％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-99％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-99％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-99％、70-80％、70-90％、70-95％、70-99％、80-90％、80-95％、80-99％、90-95％、90-99％或95-99％的互补性。

在一个实施方案中，本发明的sirna分子可包含表3-5中所述的正义和反义sirna双链体。作为非限制性实例，可以测试这些sirna双链体对内源性htt基因表达的体外抑制活性。

表3.httdsrna的正义和反义链序列

表4.httdsrna的正义和反义链序列

表5.httdsrna的反义和正义链序列

在其它实施方案中，本发明的sirna分子可以编码在质粒载体、病毒载体(例如，aav载体)、基因组或其它核酸表达载体中，以递送至细胞。

dna表达质粒可用于在细胞中稳定表达本发明的sirna双链体或dsrna，并实现靶标基因表达的长期抑制。在一个方面，sirna双链体的正义和反义链通常通过短间隔序列连接，导致称为短发夹rna(shrna)的茎环结构的表达。dicer识别并切割发夹，从而产生成熟的sirna分子。

在一个实施方案中，sirna双链体的正义和反义链可以通过短间隔序列连接，其可以任选地与额外的侧翼序列连接，导致侧翼臂-茎-环结构的表达，其称为初级微小rna(pri-mirna)。pri-mirna可以被drosha和dicer识别和切割，从而产生成熟的sirna分子。

根据本发明，产生包含编码sirna分子的核酸的aav载体，所述sirna分子靶向httmrna，aav载体血清型可以是aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav9.47、aav9(hu14)、aav10、aav11、aav12、aavrh8、aavrh10、aav-dj8、aav-dj、aav-php.a(php.a)和/或aav-php.b(php.b)及其变体。

在一些实施方案中，本发明的sirna双链体或编码的dsrna压制(或降解)靶标mrna(例如，htt)。因此，sirna双链体或编码的dsrna可用于基本上抑制细胞(例如神经元)中的htt基因表达。在一些方面，抑制htt基因表达是指抑制至少约20％，优选地至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。因此，靶标基因的蛋白产物可被抑制至少约20％，优选至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。

根据本发明，设计并分析sirna分子降低培养细胞中httmrna水平的能力。这类sirna分子可以形成双链体，例如但不限于包括表3、表4或表5中列出的那些。作为非限制性实例，sirna双链体可以是sirna双链体id：d-3500至d-3570。

在一个实施方案中，sirna分子包含mirna种子，其匹配位于引导链中的靶标(例如，htt)。在另一个实施方案中，sirna分子包含mirna种子，其匹配位于过客链中的靶标(例如，htt)。在另一个实施方案中，靶向htt基因的sirna双链体或编码的dsrna不包含匹配位于引导链或过客链中靶标(例如，htt)的种子。

在一个实施方案中，靶向htt基因的sirna双链体或编码的dsrna可能几乎没有引导链的显著全长脱靶。在另一个实施方案中，靶向htt基因的sirna双链体或编码的dsrna可能几乎没有过客链的显著全长脱靶。对于过客链而言，靶向htt基因的sirna双链体或编码的dsrna可能具有少于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、1-5％、2-6％、3-7％、4-8％、5-9％、5-10％、6-10％、5-15％、5-20％、5-25％5-30％、10-20％、10-30％、10-40％、10-50％、15-30％、15-40％、15-45％、20-40％、20-50％、25-50％、30-40％、30-50％、35-50％、40-50％、45-50％的全长脱靶作用。在另一个实施方案中，对于引导链或过客链而言，靶向htt基因的sirna双链体或编码的dsrna可能几乎没有显著的全长脱靶。对于引导链或过客链而言，靶向htt基因的sirna双链体或编码的dsrna可能具有少于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、1-5％、2-6％、3-7％、4-8％、5-9％、5-10％、6-10％、5-15％、5-20％、5-25％5-30％、10-20％、10-30％、10-40％、10-50％、15-30％、15-40％、15-45％、20-40％、20-50％、25-50％、30-40％、30-50％、35-50％、40-50％、45-50％的全长脱靶作用。

在一个实施方案中，靶向htt基因的sirna双链体或编码的dsrna可在体外具有高活性。在另一个实施方案中，sirna分子在体外可具有低活性。在另一个实施方案中，靶向htt基因的sirna双链体或dsrna在体外具有高引导链活性和低过客链活性。

在一个实施方案中，sirna分子在体外具有高引导链活性和低过客链活性。引导链的目标敲低(kd)可以是至少40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％或100％。引导链的目标敲低可以是40-50％、45-50％、50-55％、50-60％、60-65％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、60-99％、60-99.5％、60-100％、65-70％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、65-99％、65-99.5％、65-100％、70-75％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、70-99％、70-99.5％、70-100％、75-80％、75-85％、75-90％、75-95％、75-99％、75-99.5％、75-100％、80-85％、80-90％、80-95％、80-99％、80-99.5％、80-100％、85-90％、85-95％、85-99％、85-99.5％、85-100％、90-95％、90-99％、90-99.5％、90-100％、95-99％、95-99.5％、95-100％、99-99.5％、99-100％或99.5-100％。作为非限制性实例，引导链的目标敲低(kd)大于70％。作为非限制性实例，引导链的目标敲低(kd)大于60％。

在一个实施方案中，sirna双链体被设计成没有mirna种子匹配非htt序列的正义或反义序列。

在一个实施方案中，引导链对最近脱靶的ic50大于引导链对靶标ic50的100倍。作为非限制性实例，当引导链对最近脱靶的ic50大于引导链对靶标ic50的100倍时，则认为sirna分子在体外对于抑制htt具有高的引导链选择性。

在一个实施方案中，在体外或体内至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的时间，引导链的5′加工在5′末端具有正确的起始(n)。作为非限制性实例，引导链的5′加工是精确的，并且在体外至少99％的时间在5′末端具有正确的起点(n)。作为非限制性实例，引导链的5′加工是精确的，并且在体内至少99％的时间在5′末端具有正确的起点(n)。作为非限制性实例，引导链的5′加工是精确的，并且在体外至少90％的时间在5′末端具有正确的起点(n)。作为非限制性实例，引导链的5′加工是精确的，并且在体内至少90％的时间在5′末端具有正确的起点(n)。作为非限制性实例，引导链的5′加工是精确的，并且在体外至少85％的时间在5′末端具有正确的起点(n)。作为非限制性实例，引导链的5′加工是精确的，并且在体内至少85％的时间在5′末端具有正确的起点(n)。

在一个实施方案中，在体外或体内，表达的引导链相对于过客链(g∶p)(也称为反义相对于正义)的比率为1∶10、1∶9、1∶8、1∶7、1∶6、1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1；1、2∶10、2∶9、2∶8、2∶7、2∶6、2∶5、2∶4、2∶3、2∶2、2∶1、3∶10、3∶9、3∶8、3∶7、3∶6、3∶5、3∶4、3∶3、3∶2、3∶1、4∶10、4∶9、4∶8、4∶7、4∶6、4∶5、4∶4、4∶3、4∶2、4∶1、5∶10、5∶9、5∶8、5∶7、5∶6、5∶5、5∶4、5∶3、5∶2、5∶1、6∶10、6∶9、6∶8、6∶7、6∶6、6∶5、6∶4、6∶3、6∶2、6∶1、7∶10、7∶9、7∶8、7∶7、7∶6、7∶5、7∶4、7∶3、7∶2、7∶1、8∶10、8∶9、8∶8、8∶7、8∶6、8∶5、8∶4、8∶3、8∶2、8∶1、9∶10、9∶9、9∶8、9∶7、9∶6、9∶5、9∶4、9∶3、9∶2、9∶1、10∶10、10∶9、10∶8、10∶7、10∶6、10∶5、10∶4、10∶3、10∶2、10∶1、1∶99、5∶95、10∶90、15∶85、20∶80、25∶75、30∶70、35∶65、40∶60、45∶55、50∶50、55∶45、60∶40、65∶35、70∶30、75∶25、80∶20、85∶15、90∶10、95∶5或99∶1。引导链相对于过客链的比率是指细胞内加工pri-microrna后引导链相对于过客链的比。例如，80∶20的引导-对-过客比率将有8条引导链相对于每2条过客链从前体加工得到。作为非限制性实例，引导-对-过客链的比率在体外为8∶2。作为非限制性实例，引导-对-过客链的比率在体内为8∶2。作为非限制性实例，引导-对-过客链的比率在体外为9∶1。作为非限制性实例，引导-对-过客链的比率在体内为9∶1。

在一个实施方案中，表达的引导链相对于过客链(g∶p)(也称为反义相对于正义)的比率为大于1。

在一个实施方案中，表达的引导链相对于过客链(g∶p)(也称为反义相对于正义)的比率为大于2。

在一个实施方案中，表达的引导链相对于过客链(g∶p)(也称为反义相对于正义)的比率为大于5。

在一个实施方案中，表达的引导链相对于过客链(g∶p)(也称为反义相对于正义)的比率为大于10。

在一个实施方案中，表达的引导链相对于过客链(g∶p)(也称为反义相对于正义)的比率为大于20。

在一个实施方案中，表达的引导链相对于过客链(g∶p)(也称为反义相对于正义)的比率为大于50。

在一个实施方案中，表达的引导链相对于过客链(g∶p)(也称为反义相对于正义)的比率为至少3∶1。

在一个实施方案中，表达的引导链相对于过客链(g∶p)(也称为反义相对于正义)的比率为至少5∶1。

在一个实施方案中，表达的引导链相对于过客链(g∶p)(也称为反义相对于正义)的比率为至少10∶1。

在一个实施方案中，表达的引导链相对于过客链(g∶p)(也称为反义相对于正义)的比率为至少20∶1。

在一个实施方案中，表达的引导链相对于过客链(g∶p)(也称为反义相对于正义)的比率为至少50∶1。

在一个实施方案中，在体外或体内，表达的过客链相对于引导链(p∶g)(也称为正义相对于反义)的比率为1∶10、1∶9、1∶8、1∶7、1∶6、1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1；1、2∶10、2∶9、2∶8、2∶7、2∶6、2∶5、2∶4、2∶3、2∶2、2∶1、3∶10、3∶9、3∶8、3∶7、3∶6、3∶5、3∶4、3∶3、3∶2、3∶1、4∶10、4∶9、4∶8、4∶7、4∶6、4∶5、4∶4、4∶3、4∶2、4∶1、5∶10、5∶9、5∶8、5∶7、5∶6、5∶5、5∶4、5∶3、5∶2、5∶1、6∶10、6∶9、6∶8、6∶7、6∶6、6∶5、6∶4、6∶3、6∶2、6∶1、7∶10、7∶9、7∶8、7∶7、7∶6、7∶5、7∶4、7∶3、7∶2、7∶1、8∶10、8∶9、8∶8、8∶7、8∶6、8∶5、8∶4、8∶3、8∶2、8∶1、9∶10、9∶9、9∶8、9∶7、9∶6、9∶5、9∶4、9∶3、9∶2、9∶1、10∶10、10∶9、10∶8、10∶7、10∶6、10∶5、10∶4、10∶3、10∶2、10∶1、1∶99、5∶95、10∶90、15∶85、20∶80、25∶75、30∶70、35∶∶65、40∶60、45∶55、50∶50、55∶45、60∶40、65∶35、70∶30、75∶25、80∶20、85∶15、90∶10、95∶5或99∶1。过客相对于引导的比率是指切除引导链之后过客链相对于引导链的比。例如，80∶20的过客-对-引导比率将有8条过客链相对于每2条引导链从前体加工得到。作为非限制性实例，过客-对-引导链的比率在体外为80∶20。作为非限制性实例，过客-对-引导链的比率在体内为80∶20。作为非限制性实例，过客-对-引导链的比率在体外为8∶2。作为非限制性实例，过客-对-引导链的比率在体内为8∶2。作为非限制性实例，过客-对-引导链的比率在体外为9∶1。作为非限制性实例，过客-对-引导链的比率在体内为9∶1。

在一个实施方案中，表达的过客链相对于引导链(p∶g)(也称为正义相对于反义)的比率为大于1。

在一个实施方案中，表达的过客链相对于引导链(p∶g)(也称为正义相对于反义)的比率为大于2。

在一个实施方案中，表达的过客链相对于引导链(p∶g)(也称为正义相对于反义)的比率为大于5。

在一个实施方案中，表达的过客链相对于引导链(p∶g)(也称为正义相对于反义)的比率为大于10。

在一个实施方案中，表达的过客链相对于引导链(p∶g)(也称为正义相对于反义)的比率为大于20。

在一个实施方案中，表达的过客链相对于引导链(p∶g)(也称为正义相对于反义)的比率为大于50。

在一个实施方案中，表达的过客链相对于引导链(p∶g)(也称为正义相对于反义)的比率为大于3∶1。

在一个实施方案中，表达的过客链相对于引导链(p∶g)(也称为正义相对于反义)的比率为大于5∶1。

在一个实施方案中，表达的过客链相对于引导链(p∶g)(也称为正义相对于反义)的比率为大于10∶1。

在一个实施方案中，表达的过客链相对于引导链(p∶g)(也称为正义相对于反义)的比率为大于20∶1。

在一个实施方案中，表达的过客链相对于引导链(p∶g)(也称为正义相对于反义)的比率为大于50∶1。

在一个实施方案中，测量加工时，当pri-或pre-微小rna显示出(但是本领域已知的和本文所述的方法)大于2倍的引导链相对于过客链比率时，过客-引导链双链体被认为是有效的。作为非限制性实例，当测量加工时，pri-或pre-微小rna显示出大于2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、或2至5倍、2至10倍、2至15倍、3至5倍、3至10倍、3至15倍、4至5倍、4至10倍、4至15倍、5至10倍、5至15倍、6至10倍、6至15倍、7至10倍、7至15倍、8至10倍、8至15倍、9至10倍、9至15倍、10至15倍、11至15倍、12至15倍、13至15倍、或14至15倍的引导相对于过客链比率。

在一个实施方案中，编码dsrna的载体基因组包含这样的序列，其是全长构建体的至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或大于99％。作为非限制性实例，载体基因组包含构建体全长序列至少80％的序列。

在一个实施方案中，sirna分子可以通过靶向htt序列上的至少一个外显子用于沉默野生型或突变体htt。外显子可以是外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、外显子12、外显子13、外显子14、外显子15、外显子16、外显子17、外显子18、外显子19、外显子20、外显子21、外显子22、外显子23、外显子24、外显子25、外显子26、外显子27、外显子28、外显子29、外显子30、外显子31、外显子32、外显子33、外显子34、外显子35、外显子36、外显子37、外显子38、外显子39、外显子40、外显子41、外显子42、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子47、外显子48、外显子49、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53、外显子54、外显子55、外显子56、外显子57、外显子58、外显子59、外显子60、外显子61、外显子62、外显子63、外显子64、外显子65、外显子66和/或外显子67。作为非限制性实例，sirna分子可以通过靶向外显子1用于沉默野生型或突变体htt。作为另一个非限制性实例，sirna分子可以通过靶向外显子1以外的外显子用于沉默野生型或突变体htt。作为另一个非限制性实例，sirna分子可以通过靶向外显子50用于沉默野生型或突变体htt。作为另一个非限制性实例，sirna分子可以通过靶向外显子67用于沉默野生型或突变体htt。

在一个实施方案中，sirna分子可以通过靶向htt序列上的至少一个外显子用于沉默野生型和/或突变体htt。外显子可以是外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、外显子12、外显子13、外显子14、外显子15、外显子16、外显子17、外显子18、外显子19、外显子20、外显子21、外显子22、外显子23、外显子24、外显子25、外显子26、外显子27、外显子28、外显子29、外显子30、外显子31、外显子32、外显子33、外显子34、外显子35、外显子36、外显子37、外显子38、外显子39、外显子40、外显子41、外显子42、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子47、外显子48、外显子49、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53、外显子54、外显子55、外显子56、外显子57、外显子58、外显子59、外显子60、外显子61、外显子62、外显子63、外显子64、外显子65、外显子66和/或外显子67。作为非限制性实例，sirna分子可以通过靶向外显子1用于沉默野生型和/或突变体htt。作为另一个非限制性实例，sirna分子可以通过靶向外显子1以外的外显子用于沉默野生型和/或突变体htt。作为另一个非限制性实例，sirna分子可以通过靶向外显子50用于沉默野生型和/或突变体hhtt。作为另一个非限制性实例，sirna分子可以通过靶向外显子67用于沉默野生型和/或突变体htt。

sirna修饰

在一些实施方案中，当未作为前体或dna递送时，本发明的sirna分子可以被化学修饰以调节rna分子的一些特征，例如但不限于，增加体内sirna的稳定性。化学修饰的sirna分子可用于人类治疗应用，并且在不损害sirna分子的rnai活性的情况下得到改善。作为非限制性实例，sirna分子在正义链和反义链的3′和5′末端都被修饰。

在一些方面，本发明的sirna双链体可含有一个或多个修饰的核苷酸，例如但不限于糖修饰的核苷酸、核碱基修饰和/或骨架修饰。在一些方面，sirna分子可以含有组合的修饰，例如组合的核碱基和骨架修饰。

在一个实施方案中，修饰的核苷酸可以是糖修饰的核苷酸。糖修饰的核苷酸包括但不限于2′-氟、2′-氨基和2′-硫代修饰的核糖核苷酸，例如2′-氟代修饰的核糖核苷酸。修饰的核苷酸可以在糖部分上修饰，以及具有糖或其非核糖基类似物的核苷酸。例如，糖部分可以是或基于甘露糖、阿拉伯糖、吡喃葡萄糖、吡喃半乳糖、4′-硫代核糖和其它糖、杂环或碳环。

在一个实施方案中，修饰的核苷酸可以是核碱基修饰的核苷酸。

在一个实施方案中，修饰的核苷酸可以是骨架修饰的核苷酸。在一些实施方案中，本发明的sirna双链体可以进一步包含对骨架的其它修饰。如本文所用，正常“骨架”是指在dna或rna分子中重复交替的糖-磷酸序列。脱氧核糖/核糖在3′-羟基和5′-羟基上以酯键连接磷酸基团，也称为“磷酸二酯”键/连接(po键)。po骨架可以被修饰为“硫代磷酸酯骨架(ps连接)。在一些情况下，天然磷酸二酯键可以被酰胺键取代，但保留两个糖单元之间的四个原子。此类酰胺修饰可促进寡核苷酸的固相合成并增加sirna互补(complement)所形成的双链体的热力学稳定性。参见例如mesmaeker等人，pure&appl.chem.，1997，3，437-440；其内容通过引用整体并入本文。

修饰的碱基是指，通过取代或添加一个或多个原子或基团而被修饰的核苷酸碱基，例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、黄嘌呤、肌苷和辫苷(queuosine)。对核碱基部分进行修饰的一些实例包括但不限于，单独或组合的烷基化、卤化、硫醇化、胺化、酰胺化或乙酰化碱基。更具体的实例包括，例如5-丙炔基尿苷、5-丙炔基胞苷、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鸟嘌呤、n，n，-二甲基腺嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-丙基鸟嘌呤、2-氨基腺嘌呤、1-甲基肌苷、3-甲基尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿苷，及在5位具有修饰的其它核苷酸、5-(2-氨基)丙基尿苷、5-卤代胞苷、5-卤代尿苷、4-乙酰基胞苷、1-甲基腺苷、2-甲基腺苷、3-甲基胞苷、6-甲基尿苷、2-甲基鸟苷、7-甲基鸟苷、2,2-二甲基鸟苷、5-甲基氨基乙基尿苷、5-甲基氧基尿苷、脱氮核苷酸如7-脱氮腺苷、6-氮尿苷(6-azouridine)、6-氮胞苷、6-氮胸苷、5-甲基-2-硫尿苷、其它硫代碱基如2-硫尿苷和4-硫尿苷和2-硫代胞苷、二氢尿苷、假尿苷、辫苷(queuosine)、古嘌苷(archaeosine)、萘基和取代的萘基、任何o-和n-烷基化嘌呤和嘧啶如n6-甲基腺苷、5-甲基羰基甲基尿苷、尿苷5-羟基乙酸、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基和修饰的苯基如氨基苯酚或2,4,6-三甲氧基苯、作为g-钳核苷酸的修饰胞嘧啶、8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-取代的尿嘧啶和胸腺嘧啶、氮杂嘧啶、羧基羟烷基核苷酸、羧基烷基氨基烷基核苷酸和烷基羰基烷基化核苷酸。

在一个实施方案中，修饰的核苷酸可以仅在正义链上。

在另一个实施方案中，修饰的核苷酸可以仅在反义链上。

在一些实施方案中，修饰的核苷酸可以在正义和反义链上。

在一些实施方案中，化学修饰的核苷酸不影响反义链与靶标mrna序列(例如httmrna序列)配对的能力。

分子支架

在一个实施方案中，sirna分子可以编码在调节性多核苷酸中，调节性多核苷酸还包括分子支架。如本文所用，“分子支架”是形成序列或结构基础的框架或起始分子，针对分子支架设计或制备后续分子。

在一个实施方案中，分子支架包括至少一个5′侧翼区。作为非限制性实例，5′侧翼区可以包含5′侧翼序列，其可以是任何长度并且可以全部或部分源自野生型微小rna序列或完全是人工序列。

在一个实施方案中，分子支架包括至少一个3′侧翼区。作为非限制性实例，3′侧翼区可以包含3′侧翼序列，其可以是任何长度并且可以全部或部分地源自野生型微小rna序列或者是完全人工序列。

在一个实施方案中，分子支架包括至少一个环基序区。作为非限制性实例，环基序区可包括具有任何长度的序列。

在一个实施方案中，分子支架包括5′侧翼区、环基序区和/或3′侧翼区。

在一个实施方案中，至少一种有效负载(例如，sirna、mirna或本文所述的其它rnai剂)可以由调节性多核苷酸编码，所述调节性多核苷酸还可以包含至少一个分子支架。分子支架可以包含5′侧翼序列，其可以是任何长度并且可以全部或部分源自野生型微小rna序列或完全是人工的。3′侧翼序列可以在大小和来源上映射(mirror)5′侧翼序列和/或3′侧翼序列。可以不存在侧翼序列。3′侧翼序列可任选地含有一个或多个cnnc基序，其中“n”代表任何核苷酸。

形成茎环结构的茎是编码至少一个有效负载序列的最小调节性多核苷酸。在一些实施方案中，有效负载序列包含至少一个核酸序列，其部分互补靶标序列或与靶标序列杂交。在一些实施方案中，有效负载是sirna分子或sirna分子的片段。

在一些实施方案中，调节性多核苷酸的茎环结构的5′臂包含编码正义序列的核酸序列。可以由调节性多核苷酸编码的正义序列或其片段或变体的非限制性实例描述于表2中。

在一些实施方案中，调节性多核苷酸的茎环的3′臂包含编码反义序列的核酸序列。在某些情况下，反义序列在5′末端包含“g”核苷酸。可以由调节性多核苷酸编码的反义序列或其片段或变体的非限制性实例描述于表3中。

在其它实施方案中，正义序列可以位于3′臂上，而反义序列位于调节性多核苷酸茎环结构的茎的5′臂上。可以由调节性多核苷酸编码的正义和反义序列的非限制性实例描述于表2和3中。

在一个实施方案中，正义和反义序列可以在它们大部分长度上完全互补。在其它实施方案中，正义序列和反义序列可以在至少50、60、70、80、85、90、95或99％的链长度上各自具有至少70、80、90、95或99％的互补性。

正义序列的同一性和反义序列的同源性都不需要与靶标序列100％互补。

在一个实施方案中，隔开调节性多核苷酸的茎环结构的正义和反义序列是环序列(也称为环基序、接头或接头基序)。环序列可以是任何长度，4-30个核苷酸、4-20个核苷酸、4-15个核苷酸、5-15个核苷酸、6-12个核苷酸、6个核苷酸、7个核苷酸、8个核苷酸、9个核苷酸、10个核苷酸、11个核苷酸、12个核苷酸、13个核苷酸、14个核苷酸和/或15个核苷酸。

在一些实施方案中，环序列包含编码至少一个ugug基序的核酸序列。在一些实施方案中，编码ugug基序的核酸序列位于环序列的5′末端。

在一个实施方案中，间隔区可以存在于调节性多核苷酸中以将一个或多个模块(例如，5′侧翼区、环基序区、3′侧翼区、正义序列、反义序列)彼此分开。可能存在一个或多个这样的间隔区。

在一个实施方案中，正义序列和侧翼区序列之间可存在8-20个核苷酸，即8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸的间隔区。

在一个实施方案中，间隔区的长度为13个核苷酸，并位于正义序列的5′末端和侧翼序列的3′末端之间。在一个实施方案中，间隔序列具有足够的长度以形成序列的约一个螺旋转角。

在一个实施方案中，反义序列和侧翼序列之间可存在8-20个核苷酸，即8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸的间隔区。

在一个实施方案中，间隔序列在10-13个之间，即10、11、12或13个核苷酸，并且位于反义序列的3′末端和侧翼序列的5′末端之间。在一个实施方案中，间隔序列具有足够的长度以形成序列的约一个螺旋转角。

在一个实施方案中，按5′至3′方向，调节性多核苷酸包含5′侧翼序列、5′臂、环基序、3′臂和3′侧翼序列。作为非限制性实例，5′臂可包含正义序列，3′臂包含反义序列。在另一个非限制性实例中，5′臂包含反义序列，3′臂包含正义序列。

在一个实施方案中，5′臂、有效负载(例如，正义和/或反义序列)、环基序和/或3′臂序列可被改变(例如，取代1个或更多个核苷酸、添加核苷酸和/或删除核苷酸)。改变可以引起构建体功能的有益改变(例如，增加靶标序列的敲低、降低构建体的降解、降低脱靶作用、提高有效负载的效率、以及降低有效负载的降解)。

在一个实施方案中，调节性多核苷酸的分子支架是对齐的，以使引导链的切除率大于过客链的切除率。引导或过客链的切除率独立地为1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或大于99％。作为非限制性实例，引导链的切除率至少为80％。作为另一个非限制性实例，引导链的切除率至少为90％。

在一个实施方案中，引导链的切除率大于过客链的切除率。在一个方面，引导链的切除率可以比过客链多至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或大于99％。

在一个实施方案中，引导链的切除效率为至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或大于99％。作为非限制性实例，引导链的切除效率大于80％。

在一个实施方案中，引导链的切除效率大于过客链从分子支架的切除。切除引导链的效率可以比过客链从分子支架切除高2、3、4、5、6、7、8、9、10或大于10倍。

在一个实施方案中，分子支架包含双功能靶向调节性多核苷酸。如本文所用，“双功能靶向”调节性多核苷酸是其中引导链和过客链都敲低相同靶标或引导链和过客链敲低不同靶标的多核苷酸。

在一个实施方案中，本文所述的调节性多核苷酸的分子支架可包含5′侧翼区、环基序区和3′侧翼区。由本文所述调节性多核苷酸编码的5′侧翼区、环基序区(也可以称为接头区)和3′侧翼区的序列的非限制性实例显示在表6-8中。

表6.分子支架的5′侧翼区

表7.分子支架的环基序区

表8.分子支架的3′侧翼区

表6-8描述的区域或其片段中的任何一个，可以用作本文所述分子支架中的模块，其中u是t。

在一个实施方案中，分子支架可包含编码表6所列至少一个5′侧翼区的至少一个核酸序列。作为非限制性实例，5′侧翼区可以是5f1、5f2、5f3、5f4、5f5、5f6或5f7。

在一个实施方案中，分子支架可包含编码至少一个5f1侧翼区的至少一个核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含编码至少一个5f2侧翼区的至少一个核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含编码至少一个5f3侧翼区的至少一个核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含编码至少一个5f4侧翼区的至少一个核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含编码至少一个5f5侧翼区的至少一个核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含编码至少一个5f6侧翼区的至少一个核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含编码至少一个5f7侧翼区的至少一个核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可以包含编码表7所列至少一个环基序区的至少一个核酸序列。作为非限制性实例，环基序区可以是l1、l2、l3、l4、l5、l6、l7或l8。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个核酸序列，其编码至少一个l1环基序区。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个核酸序列，其编码至少一个l2环基序区。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个核酸序列，其编码至少一个l3环基序区。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个核酸序列，其编码至少一个l4环基序区。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个核酸序列，其编码至少一个l5环基序区。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个核酸序列，其编码至少一个l6环基序区。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个核酸序列，其编码至少一个l7环基序区。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个核酸序列，其编码至少一个l8环基序区。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个核酸序列，其编码表8所列至少一个3′侧翼区。作为非限制性实例，3′侧翼区可以是3f1、3f2、3f3、3f4或3f5。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个核酸序列，其编码至少一个3f1侧翼区。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个核酸序列，其编码至少一个3f2侧翼区。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个核酸序列，其编码至少一个3f3侧翼区。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个核酸序列，其编码至少一个3f4侧翼区。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个核酸序列，其编码至少一个3f5侧翼区。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个核酸序列，其编码表6和7中所述至少一个5′侧翼区和至少一个环基序区。作为非限制性实例，5′侧翼区和环基序区可以是5f1和l1、5f1和l2、5f1和l3、5f1和l4、5f1和l5、5f1和l6、5f1和l7、5f1和l8、5f2和l1、5f2和l2、5f2和l3、5f2和l4、5f2和l5、5f2和l6、5f2和l7、5f2和l8、5f3和l1、5f3和l2、5f3和l3、5f3和l4、5f3和l5、5f3和l6、5f3和l7、5f3和l8、5f4和l1、5f4和l2、5f4和l3、5f4和l4、5f4和l5、5f4和l6、5f4和l7、5f4和l8、5f5和l1、5f5和l2、5f5和l3、5f5和l4、5f5和l5、5f5和l6、5f5和l7、5f5和l8、5f6和l1、5f6和l2、5f6和l3、5f6和l4、5f6和l5、5f6和l6、5f6和l7、5f6和l8、5f7和l1、5f7和l2、5f7和l3、5f7和l4、5f7和l5、5f7和l6、5f7和l7、以及5f7和l8。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个5f2侧翼区的核酸序列和至少一个编码至少一个l1环基序区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个5f1侧翼区的核酸序列和至少一个编码至少一个l4环基序区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个5f7侧翼区的核酸序列和至少一个编码至少一个l8环基序区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个5f3侧翼区的核酸序列和至少一个编码至少一个l4环基序区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个5f3侧翼区的核酸序列和至少一个编码至少一个l5环基序区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个5f4侧翼区的核酸序列和至少一个编码至少一个l4环基序区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个5f3侧翼区的核酸序列和至少一个编码至少一个l7环基序区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个5f5侧翼区的核酸序列和至少一个编码至少一个l4环基序区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个5f6侧翼区的核酸序列和至少一个编码至少一个l4环基序区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个5f3侧翼区的核酸序列和至少一个编码至少一个l6环基序区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个5f7侧翼区的核酸序列和至少一个编码至少一个l4环基序区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个5f2侧翼区的核酸序列和至少一个编码至少一个l2环基序区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个5f1侧翼区的核酸序列和至少一个编码至少一个l1环基序区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个5f1侧翼区的核酸序列和至少一个编码至少一个l2环基序区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可以包含至少一个编码表7和8中至少一个所述3′侧翼区的核酸序列和至少一个编码至少一个环基序区的核酸序列。作为非限制性实例，3′侧翼区和环基序区可以是3f1和l1、3f1和l2、3f1和l3、3f1和l4、3f1和l5、3f1和l6、3f1和l7、3f1和l8、3f2和l1、3f2和l2、3f2和l3、3f2和l4、3f2和l5、3f2和l6、3f2和l7、3f2和l8、3f3和l1、3f3和l2、3f3和l3、3f3和l4、3f3和l5、3f3和l6、3f3和l7、3f3和l8、3f4和l1、3f4和l2、3f4和l3、3f4和l4、3f4和l5、3f4和l6、3f4和l7、3f4和l8、3f5和l1、3f5和l2、3f5和l3、3f5和l4、3f5和l5、3f5和l6、3f5和l7、以及3f5和l8。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个l1环基序区的核酸序列和至少一个编码至少一个3f2侧翼区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个l4环基序区的核酸序列和至少一个编码至少一个3f1侧翼区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个l8环基序区的核酸序列和至少一个编码至少一个3f5侧翼区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个l5环基序区的核酸序列和至少一个编码至少一个3f1侧翼区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个l4环基序区的核酸序列和至少一个编码至少一个3f4侧翼区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个l7环基序区的核酸序列和至少一个编码至少一个3f1侧翼区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个l6环基序区的核酸序列和至少一个编码至少一个3f1侧翼区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个l4环基序区的核酸序列和至少一个编码至少一个3f5侧翼区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个l2环基序区的核酸序列和至少一个编码至少一个3f2侧翼区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个l1环基序区的核酸序列和至少一个编码至少一个3f3侧翼区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个l5环基序区的核酸序列和至少一个编码至少一个3f4侧翼区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个l1环基序区的核酸序列和至少一个编码至少一个3f1侧翼区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个l2环基序区的核酸序列和至少一个编码至少一个3f1侧翼区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码表6和8中至少一个所述5′侧翼区的核酸序列和至少一个编码至少3′侧翼区的核酸序列。作为非限制性实例，侧翼区可以是5f1和3f1、5f1和3f2、5f1和3f3、5f1和3f4、5f1和3f5、5f2和3f1、5f2和3f2、5f2和3f3、5f2和3f4、5f2和3f5、5f3和3f1、5f3和3f2、5f3和3f3、5f3和3f4、5f3和3f5、5f4和3f1、5f4和3f2、5f4和3f3、5f4和3f4、5f4和3f5、5f5和3f1、5f5和3f2、5f5和3f3、5f5和3f4、5f5和3f5、5f6和3f1、5f6和3f2、5f6和3f3、5f6和3f4、5f6和3f5、5f7和3f1、5f7和3f2、5f7和3f3、5f7和3f4、以及5f7和3f5。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个5f25′侧翼区的核酸序列、以及至少一个编码至少一个3f23′侧翼区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个5f15′侧翼区的核酸序列、以及至少一个编码至少一个3f13′侧翼区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个5f75′侧翼区的核酸序列、以及至少一个编码至少一个3f53′侧翼区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个5f35′侧翼区的核酸序列、以及至少一个编码至少一个3f13′侧翼区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个5f45′侧翼区的核酸序列、以及至少一个编码至少一个3f43′侧翼区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个5f55′侧翼区的核酸序列、以及至少一个编码至少一个3f43′侧翼区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个5f65′侧翼区的核酸序列、以及至少一个编码至少一个3f13′侧翼区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个5f25′侧翼区的核酸序列、以及至少一个编码至少一个3f33′侧翼区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个5f35′侧翼区的核酸序列、以及至少一个编码至少一个3f43′侧翼区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个5f15′侧翼区的核酸序列、以及至少一个编码至少一个3f23′侧翼区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码表6-8中所述至少一个5′侧翼区的核酸序列、至少一个编码至少一个环基序区的核酸序列、以及至少一个编码至少一个3′侧翼区的核酸序列。作为非限制性实例，侧翼区和环基序区可以是5f1、l1和3f1；5f1、l1和3f2；5f1、l1和3f3；5f1、l1和3f4；5f1、l1和3f5；5f2、l1和3f1；5f2、l1和3f2；5f2、l1和3f3；5f2、l1和3f4；5f2、l1和3f5；5f3、l1和3f3；5f3、l1和3f2；5f3、l1和3f3；5f3、l1和3f4；5f3、l1和3f5；5f4、l1和3f4；5f4、l1和3f2；5f4、l1和3f3；5f4、l1和3f4；5f4、l1和3f5；5f5、l1和3f1；5f5、l1和3f2；5f5、l1和3f3；5f5、l1和3f4；5f5、l1和3f5；5f6、l1和3f1；5f6、l1和3f2；5f6、l1和3f3；5f6、l1和3f4；5f6、l1和3f5；5f7、l1和3f1；5f7、l1和3f2；5f7、l1和3f3；5f7、l1和3f4；5f7、l1和3f5；5f1、l2和3f1；5f1、l2和3f2；5f1、l2和3f3；5f1、l2和3f4；5f1、l2和3f5；5f2、l2和3f1；5f2、l2和3f2；5f2、l2和3f3；5f2、l2和3f4；5f2、l2和3f5；5f3、l2和3f1；5f3、l2和3f2；5f3、l2和3f3；5f3、l2和3f4；5f3、l2和3f5；5f4、l2和3f1；5f4、l2和3f2；5f4、l2和3f3；5f4、l2和3f4；5f4、l2和3f5；5f5、l2和3f1；5f5、l2和3f2；5f5、l2和3f3；5f5、l2和3f4；5f5、l2和3f5；5f6、l2和3f1；5f6、l2和3f2；5f6、l2和3f3；5f6、l2和3f4；5f6、l2和3f5；5f7、l2和3f1；5f7、l2和3f2；5f7、l2和3f3；5f7、l2和3f4；5f7、l2和3f5；5f1、l3和3f1；5f1、l3和3f2；5f1、l3和3f3；5f1、l3和3f4；5f1、l3和3f5；5f2、l3和3f1；5f2、l3和3f2；5f2、l3和3f3；5f2、l3和3f4；5f2、l3和3f5；5f3、l3和3f1；5f3、l3和3f2；5f3、l3和3f3；5f3、l3和3f4；5f3、l3和3f5；5f4、l3和3f1；5f4、l3和3f2；5f4、l3和3f3；5f4、l3和3f4；5f4、l3和3f5；5f5、l3和3f1；5f5、l3和3f2；5f5、l3和3f3；5f5、l3和3f4；5f5、l3和3f5；5f6、l3和3f1；5f6、l3和3f2；5f6、l3和3f3；5f6、l3和3f4；5f6、l3和3f5；5f7、l3和3f1；5f7、l3和3f2；5f7、l3和3f3；5f7、l3和3f4；5f7、l3和3f5；5f1、l4和3f1；5f1、l4和3f2；5f1、l4和3f3；5f1、l4和3f4；5f1、l4和3f5；5f2、l4和3f1；5f2、l4和3f2；5f2、l4和3f3；5f2、l4和3f4；5f2、l4和3f5；5f3、l4和3f1；5f3、l4和3f2；5f3、l4和3f3；5f3、l4和3f4；5f3、l4和3f5；5f4、l4和3f1；5f4、l4和3f2；5f4、l4和3f3；5f4、l4和3f4；5f4、l4和3f5；5f5、l4和3f1；5f5、l4和3f2；5f5、l4和3f3；5f5、l4和3f4；5f5、l4和3f5；5f6、l4和3f1；5f6、l4和3f2；5f6、l4和3f3；5f6、l4和3f4；5f6、l4和3f5；5f7、l4和3f1；5f7、l4和3f2；5f7、l4和3f3；5f7、l4和3f4；5f7、l4和3f5；5f1、l5和3f1；5f1、l5和3f2；5f1、l5和3f3；5f1、l5和3f4；5f1、l5和3f5；5f2、l5和3f1；5f2、l5和3f2；5f2、l5和3f3；5f2、l5和3f4；5f2、l5和3f5；5f3、l5和3f1；5f3、l5和3f2；5f3、l5和3f3；5f3、l5和3f4；5f3、l5和3f5；5f4、l5和3f1；5f4、l5和3f2；5f4、l5和3f3；5f4、l5和3f4；5f4、l5和3f5；5f5、l5和3f1；5f5、l5和3f2；5f5、l5和3f3；5f5、l5和3f4；5f5、l5和3f5；5f6、l5和3f1；5f6、l5和3f2；5f6、l5和3f3；5f6、l5和3f4；5f6、l5和3f5；5f7、l5和3f1；5f7、l5和3f2；5f7、l5和3f3；5f7、l5和3f4；5f7、l5和3f5；5f1、l6和3f1；5f1、l6和3f2；5f1、l6和3f3；5f1、l6和3f4；5f1、l6和3f5；5f2、l6和3f1；5f2、l6和3f2；5f2、l6和3f3；5f2、l6和3f4；5f2、l6和3f5；5f3、l6和3f1；5f3、l6和3f2；5f3、l6和3f3；5f3、l6和3f4；5f3、l6和3f5；5f4、l6和3f1；5f4、l6和3f2；5f4、l6和3f3；5f4、l6和3f4；5f4、l6和3f5；5f5、l6和3f1；5f5、l6和3f2；5f5、l6和3f3；5f5、l6和3f4；5f5、l6和3f5；5f6、l6和3f1；5f6、l6和3f2；5f6、l6和3f3；5f6、l6和3f4；5f6、l6和3f5；5f7、l6和3f1；5f7、l6和3f2；5f7、l6和3f3；5f7、l6和3f4；5f7、l6和3f5；5f1、l7和3f1；5f1、l7和3f2；5f1、l7和3f3；5f1、l7和3f4；5f1、l7和3f5；5f2、l7和3f1；5f2、l7和3f2；5f2、l7和3f3；5f2、l7和3f4；5f2、l7和3f5；5f3、l7和3f1；5f3、l7和3f2；5f3、l7和3f3；5f3、l7和3f4；5f3、l7和3f5；5f4、l7和3f1；5f4、l7和3f2；5f4、l7和3f3；5f4、l7和3f4；5f4、l7和3f5；5f5、l7和3f1；5f5、l7和3f2；5f5、l7和3f3；5f5、l7和3f4；5f5、l7和3f5；5f6、l7和3f1；5f6、l7和3f2；5f6、l7和3f3；5f6、l7和3f4；5f6、l7和3f5；5f7、l7和3f1；5f7、l7和3f2；5f7、l7和3f3；5f7、l7和3f4；5f7、l7和3f5；5f1、l8和3f1；5f1、l8和3f2；5f1、l8和3f3；5f1、l8和3f4；5f1、l8和3f5；5f2、l8和3f1；5f2、l8和3f2；5f2、l8和3f3；5f2、l8和3f4；5f2、l8和3f5；5f3、l8和3f1；5f3、l8和3f2；5f3、l8和3f3；5f3、l8和3f4；5f3、l8和3f5；5f4、l8和3f1；5f4、l8和3f2；5f4、l8和3f3；5f4、l8和3f4；5f4、l8和3f5；5f5、l8和3f1；5f5、l8和3f2；5f5、l8和3f3；5f5、l8和3f4；5f5、l8和3f5；5f6、l8和3f1；5f6、l8和3f2；5f6、l8和3f3；5f6、l8和3f4；5f6、l8和3f5；5f7、l8和3f1；5f7、l8和3f2；5f7、l8和3f3；5f7、l8和3f4；以及5f7、l8和3f5。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个5f25′侧翼区的核酸序列、至少一个编码至少一个l1环基序区的核酸序列、以及至少一个编码至少一个3f23′侧翼区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个5f15′侧翼区的核酸序列、至少一个编码至少一个l4环基序区的核酸序列、以及至少一个编码至少一个3f13′侧翼区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个5f75′侧翼区的核酸序列、至少一个编码至少一个l8环基序区的核酸序列、以及至少一个编码至少一个3f53′侧翼区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个5f35′侧翼区的核酸序列、至少一个编码至少一个l4环基序区的核酸序列、以及至少一个编码至少一个3f13′侧翼区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个5f35′侧翼区的核酸序列、至少一个编码至少一个l5环基序区的核酸序列、以及至少一个编码至少一个3f13′侧翼区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个5f45′侧翼区的核酸序列、至少一个编码至少一个l4环基序区的核酸序列、以及至少一个编码至少一个3f43′侧翼区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个5f35′侧翼区的核酸序列、至少一个编码至少一个l7环基序区的核酸序列、以及至少一个编码至少一个3f13′侧翼区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个5f55′侧翼区的核酸序列、至少一个编码至少一个l4环基序区的核酸序列、以及至少一个编码至少一个3f43′侧翼区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个5f65′侧翼区的核酸序列、至少一个编码至少一个l4环基序区的核酸序列、以及至少一个编码至少一个3f13′侧翼区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个5f35′侧翼区的核酸序列、至少一个编码至少一个l6环基序区的核酸序列、以及至少一个编码至少一个3f13′侧翼区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个5f75′侧翼区的核酸序列、至少一个编码至少一个l4环基序区的核酸序列、以及至少一个编码至少一个3f53′侧翼区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个5f25′侧翼区的核酸序列、至少一个编码至少一个l2环基序区的核酸序列、以及至少一个编码至少一个3f23′侧翼区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个5f25′侧翼区的核酸序列、至少一个编码至少一个l1环基序区的核酸序列、以及至少一个编码至少一个3f33′侧翼区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个5f35′侧翼区的核酸序列、至少一个编码至少一个l5环基序区的核酸序列、以及至少一个编码至少一个3f43′侧翼区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个5f15′侧翼区的核酸序列、至少一个编码至少一个l1环基序区的核酸序列、以及至少一个编码至少一个3f13′侧翼区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个5f15′侧翼区的核酸序列、至少一个编码至少一个l2环基序区的核酸序列、以及至少一个编码至少一个3f13′侧翼区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个5f15′侧翼区的核酸序列、至少一个编码至少一个l1环基序区的核酸序列、以及至少一个编码至少一个3f23′侧翼区的核酸序列。

在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个编码至少一个5f25′侧翼区的核酸序列、至少一个编码至少一个l3环基序区的核酸序列、以及至少一个编码至少一个3f33′侧翼区的核酸序列。

在一个实施方案中，调节性多核苷酸可包含编码表9和10中所述5′和3′侧翼区、环基序区、正义序列和反义序列的核酸序列。在表9和10中，描述了过客和引导链以及5′和3′侧翼区和环区(也称为接头区)。在表9和10中，序列名称的“mir”部分不一定对应于mirna基因的序列编号(例如，voyhtmir-102是序列的名称，并不一定意味着mir-102是序列的一部分)。

表9.含有过客和引导序列的pri-mirna盒(5′-3′)

表10.含有引导和过客序列的pri-mirna盒(5′-3′)

在一个实施方案中，分子支架可以包含一个或多个本领域已知的接头。接头可以将区域或一个分子支架与另一个隔开。作为非限制性实例，分子支架可以是多顺反子的。

在一个实施方案中，使用以下属性中的至少一个来设计调节性多核苷酸：环变体、种子错配/凸起(bulge)/摆动(wobble)变体、茎错配、环变体和附(vassal)茎错配变体、种子错配和基部茎错配变体、茎错配和基部茎错配变体、种子摆动和基部茎摆动变体或茎序列变体。

在一个实施方案中，分子支架可以是天然的pri-mirna支架。作为非限制性实例，分子支架可以是源自人mir155支架的支架。

在一个实施方案中，分子支架可以位于cmv启动子、其片段或变体的下游。

在一个实施方案中，分子支架可以位于cba启动子、其片段或变体的下游。

在一个实施方案中，分子支架可以是位于cmv启动子下游的天然pri-mirna支架。作为非限制性实例，天然pri-mirna支架源自人mir155支架。

在一个实施方案中，分子支架可以是位于cba启动子下游的天然pri-mirna支架。

在一个实施方案中，通过比较pri-mirna中调节性多核苷酸的方法确定分子支架和调节性多核苷酸的选择(参见例如，miniarikova等人，design，characterization，andleadselectionoftherapeuticmirnastargetinghuntingtinfordevelopmentofgenetherapyforhuntingtin’sdisease.moleculartherapy-nucleicacids(2016)5，e297以及国际公开no.wo2016102664中描述的方法；其各自的内容通过引用整体并入本文)。调节性多核苷酸可以是但不限于靶向外显子1、cag重复、外显子50中的snprs362331、和/或外显子67中的snprs362307。为了评价调节性多核苷酸的活性，可以使用的所用分子支架是人pri-mirna支架(例如，mir155支架)和启动子可以是cmv。可以使用hek293t细胞和报道分子(例如，荧光素酶)在体外确定活性。对于外显子1靶向，当敲低为80％或更高时，则确定调节性多核苷酸在htt敲低时是有效的。对于cag靶向，当敲低为至少60％时，则确定调节性多核苷酸在htt敲低时是有效的。对于snp靶向，当敲低是至少60％时，则确定调节性多核苷酸在htt敲低时是有效的。对于cag重复的等位基因选择性或snp靶向，调节性多核苷酸可包含至少1个取代以改善等位基因选择性。作为非限制性实例，取代可以是g或c替换为t或相应的u和a，或t/u替换为c。

为了评价调节性多核苷酸的最佳分子支架，调节性多核苷酸用在带有cag启动子的pri-mirna支架中。以50ng的报道分子(例如，荧光素酶报告分子)共转染构建体。在50ng共转染时敲低超过80％的构建体被认为是有效的。在一个方面，优选具有强引导链活性的构建体。在一个方面，优选具有强过客链活性的构建体。利用ngs在hek293t细胞中加工分子支架，以确定引导-过客比率和加工变异性。

为了体内评价分子支架和调节性多核苷酸，包含调节性多核苷酸的分子支架包装在aav中(例如，血清型可以是aav5(参见例如wo2015060722中描述的方法和构建体)，其内容通过引用整体并入本文)，并且施用于体内模型(例如，hu128/21hd小鼠)，可以在模型的不同区域中确定引导-过客比率、5′和3′末端加工、引导和过客链的逆转以及敲低。

在一个实施方案中，通过比较天然pri-mirna和合成pri-mirna中的调节性多核苷酸的方法，确定分子支架和调节性多核苷酸的选择。调节性多核苷酸可以是但不限于靶向外显子1以外的外显子。为了评价调节性多核苷酸的活性，分子支架与cba启动子一起使用。在一个方面，可以使用hek293t细胞、hela细胞和报道分子(例如，荧光素酶)在体外确定活性，并且敲低有效的调节性多核苷酸在测试的细胞中显示至少80％的htt敲低。另外，被认为最有效的调节性多核苷酸显示低显著性的乃至非显著性的过客链(p链)活性。在另一个方面，使用hek293t细胞、hela细胞和报道分子通过体外转染评价内源性htt敲低效力。有效的调节性多核苷酸显示大于50％的内源性htt敲低。在另一方面，在不同细胞类型(例如，hek293、hela、原代星形胶质细胞、u251星形胶质细胞、sh-sy5y神经元细胞和来自hd患者的成纤维细胞)中，通过感染(例如，aav2)评价内源性htt敲低效力。有效的调节性多核苷酸显示大于60％的内源性htt敲低。

为了体内评价分子支架和调节性多核苷酸，将包含调节性多核苷酸的分子支架包装在aav中并施用于体内模型(例如，yac128hd小鼠)，可以在模型的不同区域(例如，组织区)中确定引导-过客比率、5′和3′末端加工、引导和过客链的比率以及敲低。可以通过ngs从体内样品加工分子支架，以确定引导-过客比率和加工变异性。

载体

在一些实施方案中，本文所述的sirna分子可以由载体编码，例如质粒或病毒载体。在一个实施方案中，sirna分子由病毒载体编码。病毒载体可以是但不限于疱疹病毒(hsv)载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体等。在一些具体的实施方案中，病毒载体是aav载体。

逆转录病毒载体

在一些实施方案中，靶向htt基因的sirna双链体可以由逆转录病毒载体编码(参见，例如美国专利号5,399,346；5,124,263；4,650,764和4,980,289；各自的内容通过引用整体并入本文)。

腺病毒载体

腺病毒是真核dna病毒，其可被修饰以有效地将核酸在体内递送至多种细胞类型，并已广泛用于基因治疗方案，包括用于将基因靶向至神经细胞。已经描述了用于核酸治疗的各种复制缺陷型腺病毒和最小腺病毒载体(参见，例如pct专利公开号wo199426914、wo199502697、wo199428152、wo199412649、wo199502697和wo199622378；其各自的内容通过引用整体并入本文)。此类腺病毒载体也可用于将本发明的sirna分子递送至细胞。

腺相关病毒(aav)载体

腺相关病毒(aav)是依赖性细小病毒(如其它细小病毒)，其为单链非包膜dna病毒，基因组约为5000个核苷酸长，含有两个开放阅读框，所述开放阅读框编码负责复制的蛋白质(rep)和衣壳结构蛋白(cap)。开放阅读框的两侧是两个反向末端重复(itr)序列，它们作为病毒基因组的复制起点。此外，aav基因组包含包装序列，允许将病毒基因组包装到aav衣壳中。在受感染的细胞中，aav载体需要共辅助病毒(co-helper)(例如，腺病毒)进行生产性感染。在没有这种辅助功能的情况下，aav病毒颗粒基本上进入宿主细胞但不整合到细胞的基因组中。

由于几种独特的特征，已经研究了aav载体的sirna递送。特征的非限制性实例包括(i)感染分裂和非分裂细胞的能力；(ii)感染性的广泛宿主范围，包括人细胞；(iii)野生型aav与任何疾病无关，并且未显示在感染细胞中复制；(iv)缺乏针对载体的细胞介导的免疫应答和(v)宿主染色体中的非整合性质，从而降低了长期遗传改变的可能性。此外，aav载体感染对改变细胞基因表达模式的影响最小(stilwell和samulski等人，biotechniques，2003,34,148)。

通常，用于sirna递送的aav载体可以是重组病毒载体，其是复制缺陷的，因为它们在病毒基因组内缺乏编码功能性rep和cap蛋白的序列。在一些情况下，缺陷型aav载体可缺少大多数或所有编码序列，并且基本上仅含有一个或两个aavitr序列和包装序列。

在一个实施方案中，可以将包含编码本发明sirna分子的核酸序列的aav载体引入哺乳动物细胞中。

可以修饰aav载体以提高递送效率。可以有效包装这类修饰的aav载体，所述aav载体包含编码本发明sirna分子的核酸序列，并且可以用于以高频率和最小毒性成功感染靶标细胞。

在一些实施方案中，包含编码本发明sirna分子的核酸序列的aav载体可以是人血清型aav载体。这种人aav载体可以源自任何已知的血清型，例如来自血清型aav1-aav11中的任何一种。作为非限制性实例，aav载体可以是在aav1衍生衣壳中包含aav1衍生基因组的载体；在aav2衍生衣壳中包含aav2衍生基因组的载体；在aav4衍生衣壳中包含aav4衍生基因组的载体；在aav6衍生衣壳中包含aav6衍生基因组的载体或在aav9衍生衣壳中包含aav9衍生基因组的载体。

在其它实施方案中，包含编码本发明sirna分子的核酸序列的aav载体可以是假型杂交或嵌合aav载体，其含有源自至少两种不同aav血清型的序列和/或组分。假型aav载体可以是这样的载体，其包含源自一种aav血清型的aav基因组和至少部分源自不同aav血清型的衣壳蛋白。作为非限制性实例，这种假型aav载体可以是在aav1衍生衣壳中包含aav2衍生基因组的载体；或在aav6衍生衣壳中包含aav2衍生基因组的载体；或在aav4衍生衣壳中包含aav2衍生基因组的载体；或在aav9衍生衣壳中包含aav2衍生基因组的载体。以类似的方式，本发明考虑任何杂交或嵌合aav载体。

在其它实施方案中，包含编码本发明sirna分子的核酸序列的aav载体可用于将sirna分子递送至中枢神经系统(例如，美国专利号6,180,613；其内容通过引用整体并入本文)。

在一些方面，包含编码本发明sirna分子的核酸序列的aav载体可以进一步包含修饰的衣壳，其包括来自非病毒来源的肽。在其它方面，aav载体可以含有cns特异性嵌合衣壳，以促进编码的sirna双链体向脑和脊髓的递送。例如，对于表现出cns趋向性的aav变体，对来自该aav变体的cap核苷酸序列建立比对，以鉴定可变区(vr)序列和结构。

在一个实施方案中，包含编码本发明sirna分子的核酸序列的aav载体可以编码作为多顺反子分子的sirna分子。sirna分子可另外在sirna分子区域之间包含一个或多个接头。

自我互补性单链载体

在一个实施方案中，本发明中使用的aav载体是单链载体(ssaav)。

在另一个实施方案中，aav载体可以是自身互补的aav载体(scaav)。scaav载体含有两条dna链，它们一起退火形成双链dna。通过跳过第二链合成，scaav允许在细胞中快速表达。

在一个实施方案中，本发明中使用的aav载体是scaav。

用于产生和/或修饰aav载体的方法在本领域中公开，例如假型aav载体(国际专利公开号wo200028004；wo200123001；wo2004112727；wo2005005610和wo2005072364，其各自的内容通过引用整体并入本文)。

aav血清型

本发明的aav颗粒可包含或源自任何天然或重组aav血清型。根据本发明，aav颗粒可以利用或基于选自以下任何一种的血清型：aav1、aav2、aav2g9、aav3、aav3a、aav3b、aav3-3、aav4、aav4-4、aav5、aav6、aav6.1、aav6.2、aav6.1.2、aav7、aav7.2、aav8、aav9、aav9.11、aav9.13、aav9.16、aav9.24、aav9.45、aav9.47、aav9.61、aav9.68、aav9.84、aav9.9、aav10、aav11、aav12、aav16.3、aav24.1、aav27.3、aav42.12、aav42-1b、aav42-2、aav42-3a、aav42-3b、aav42-4、aav42-5a、aav42-5b、aav42-6b、aav42-8、aav42-10、aav42-11、aav42-12、aav42-13、aav42-15、aav42-aa、aav43-1、aav43-12、aav43-20、aav43-21、aav43-23、aav43-25、aav43-5、aav44.1、aav44.2、aav44.5、aav223.1、aav223.2、aav223.4、aav223.5、aav223.6、aav223.7、aav1-7/rh.48、aav1-8/rh.49、aav2-15/rh.62、aav2-3/rh.61、aav2-4/rh.50、aav2-5/rh.51、aav3.1/hu.6、aav3.1/hu.9、aav3-9/rh.52、aav3-11/rh.53、aav4-8/r11.64、aav4-9/rh.54、aav4-19/rh.55、aav5-3/rh.57、aav5-22/rh.58、aav7.3/hu.7、aav16.8/hu.10、aav16.12/hu.11、aav29.3/bb.1、aav29.5/bb.2、aav106.1/hu.37、aav114.3/hu.40、aav127.2/hu.41、aav127.5/hu.42、aav128.3/hu.44、aav130.4/hu.48、aav145.1/hu.53、aav145.5/hu.54、aav145.6/hu.55、aav161.10/hu.60、aav161.6/hu.61、aav33.12/hu.17、aav33.4/hu.15、aav33.8/hu.16、aav52/hu.19、aav52.1/hu.20、aav58.2/hu.25、aava3.3、aava3.4、aava3.5、aava3.7、aavc1、aavc2、aavc5、aav-dj、aav-dj8、aavf3、aavf5、aavh2、aavrh.72、aavhu.8、aavrh.68、aavrh.70、aavpi.1、aavpi.3、aavpi.2、aavrh.60、aavrh.44、aavrh.65、aavrh.55、aavrh.47、aavrh.69、aavrh.45、aavrh.59、aavhu.12、aavh6、aavlk03、aavh-1/hu.1、aavh-5/hu.3、aavlg-10/rh.40、aavlg-4/rh.38、aavlg-9/hu.39、aavn721-8/rh.43、aavch.5、aavch.5r1、aavcv.2、aavcy.3、aavcy.4、aavcy.5、aavcy.5r1、aavcy.5r2、aavcy.5r3、aavcy.5r4、aavcy.6、aavhu.1、aavhu.2、aavhu.3、aavhu.4、aavhu.5、aavhu.6、aavhu.7、aavhu.9、aavhu.10、aavhu.11、aavhu.13、aavhu.15、aavhu.16、aavhu.17、aavhu.18、aavhu.20、aavhu.21、aavhu.22、aavhu.23.2、aavhu.24、aavhu.25、aavhu.27、aavhu.28、aavhu.29、aavhu.29r、aavhu.31、aavhu.32、aavhu.34、aavhu.35、aavhu.37、aavhu.39、aavhu.40、aavhu.41、aavhu.42、aavhu.43、aavhu.44、aavhu.44r1、aavhu.44r2、aavhu.44r3、aavhu.45、aavhu.46、aavhu.47、aavhu.48、aavhu.48r1、aavhu.48r2、aavhu.48r3、aavhu.49、aavhu.51、aavhu.52、aavhu.54、aavhu.55、aavhu.56、aavhu.57、aavhu.58、aavhu.60、aavhu.61、aavhu.63、aavhu.64、aavhu.66、aavhu.67、aavhu.14/9、aavhu.t19、aavrh.2、aavrh.2r、aavrh.8、aavrh.8r、aavrh.10、aavrh.12、aavrh.13、aavrh.13r、aavrh.14、aavrh.17、aavrh.18、aavrh.19、aavrh.20、aavrh.21、aavh.22、aavrh.23、aavrh.24、aavrh.25、aavrh.31、aavrh.32、aavrh.33、aavrh.34、aavrh.35、aavrh.36、aavrh.37、aavrh.37r2、aavrh.38、aavrh.39、aavrh.40、aavrh.46、aavrh.48、aavrh.48.1、aavrh.48.1.2、aavrh.48.2、aavrh.49、aavrh.51、aavrh.52、aavrh.53、aavrh.54、aavrh.56、aavrh.57、aavrh.58、aavrh.61、aavrh.64、aavrh.64r1、aavrh.64r2、aavrh.67、aavr.h.73、aavrh.74、aavrh8r、aavrh8ra586r突变体、aavrh8rr533a突变体、aaav、baav、羊aav、牛aav、aavhe1.1、aavher1.5、aavher1.14、aavher1.8、aavher1.16、aavher1.18、aavher1.35、aavher1.7、aavher1.36、aavher2.29、aavher2.4、aavher2.16、aavher2.30、aavher2.31、aavher2.36、aavher1.23、aavher3.1、aav2.5t、aav-paec、aav-lk01、aav-lk02、aav-lk03、aav-lk04、aav-lk05、aav-lk06、aav-lk07、aav-lk08、aav-lk09、aav-lk10、aav-lk11、aav-lk12、aav-lk13、aav-lk14、aav-lk15、aav-lk16、aav-lk17、aav-lk18、aav-lk19、aav-paec2、aav-paec4、aav-paec6、aav-paec7、aav-paec8、aav-paec11、aav-paec12、aav-2-pre-mirna-101、aav-8h、aav-8b、aav-h、aav-b、aavsm10-2、aav穿梭100-1、aav穿梭100-3、aav穿梭100-7、aav穿梭10-2、aav穿梭10-6、aav穿梭10-8、aav穿梭100-2、aavsm10-1、aavsm10-8、aavsm100-3、aavsm100-10、bnp61aav、bnp62aav、bnp63aav、aavrh.50、aavrh.43、aavrh.62、aavrh.48、aavhu.19、aavhu.11、aavhu.53、aav4-8/rh.64、aavlg-9/hu.39、aav54.5/hu.23、aav54.2/hu.22、aav54.7/hu.24、aav54.1/hu.21、aav54.4r/hu.27、aav46.2/hu.28、aav46.6/hu.29、aav128.1/hu.43、真正类型的aav(ttaav)、upennaav10、日本aav10血清型、aavcbr-7.1、aavcbr-7.10、aavcbr-7.2、aavcbr-7.3、aavcbr-7.4、aavcbr-7.5、aavcbr-7.7、aavcbr-7.8、aavcbr-b7.3、aavcbr-b7.4、aavcbr-e1、aavcbr-e2、aavcbr-e3、aavcbr-e4、aavcbr-e5、aavcbr-e5、aavcbr-e6、aavcbr-e7、aavcbr-e8、aavcht-1、aavcht-2、aavcht-3、aavcht-6.1、aavcht-6.10、aavcht-6.5、aavcht-6.6、aavcht-6.7、aavcht-6.8、aavcht-p1、aavcht-p2、aavcht-p5、aavcht-p6、aavcht-p8、aavcht-p9、aavckd-1、aavckd-10、aavckd-2、aavckd-3、aavckd-4、aavckd-6、aavckd-7、aavckd-8、aavckd-b1、aavckd-b2、aavckd-b3、aavckd-b4、aavckd-b5、aavckd-b6、aavckd-b7、aavckd-b8、aavckd-h1、aavckd-h2、aavckd-h3、aavckd-h4、aavckd-h5、aavckd-h6、aavckd-n3、aavckd-n4、aavckd-n9、aavclg-f1、aavclg-f2、aavclg-f3、aavclg-f4、aavclg-f5、aavclg-f6、aavclg-f7、aavclg-f8、aavclv-1、aavclv1-1、aavclv1-10、aavclv1-2、aavclv-12、aavclv1-3、aavclv-13、aavclv1-4、aavclv1-7、aavclv1-8、aavclv1-9、aavclv-2、aavclv-3、aavclv-4、aavclv-6、aavclv-8、aavclv-d1、aavclv-d2、aavclv-d3、aavclv-d4、aavclv-d5、aavclv-d6、aavclv-d7、aavclv-d8、aavclv-e1、aavclv-k1、aavclv-k3、aavclv-k6、aavclv-l4、aavclv-l5、aavclv-l6、aavclv-m1、aavclv-m11、aavclv-m2、aavclv-m5、aavclv-m6、aavclv-m7、aavclv-m8、aavclv-m9、aavclv-r1、aavclv-r2、aavclv-r3、aavclv-r4、aavclv-r5、aavclv-r6、aavclv-r7、aavclv-r8、aavclv-r9、aavcsp-1、aavcsp-10、aavcsp-11、aavcsp-2、aavcsp-3、aavcsp-4、aavcsp-6、aavcsp-7、aavcsp-8、aavcsp-8.10、aavcsp-8.2、aavcsp-8.4、aavcsp-8.5、aavcsp-8.6、aavcsp-8.7、aavcsp-8.8、aavcsp-8.9、aavcsp-9、aav.hu.48r3、aav.vr-355、aav3b、aav4、aav5、aavf1/hsc1、aavf11/hsc11、aavf12/hsc12、aavf13/hsc13、aavf14/hsc14、aavf15/hsc15、aavf16/hsc16、aavf17/hsc17、aavf2/hsc2、aavf3/hsc3、aavf4/hsc4、aavf5/hsc5、aavf6/hsc6、aavf7/hsc7、aavf8/hsc8、aavf9/hsc9、aav-php.b(php.b)、aav-php.a(php.a)、g2b-26、g2b-13、th1.1-32和/或th1.1-35及其变体。作为非限制性实例，重组aav病毒的衣壳是aav1。作为非限制性实例，重组aav病毒的衣壳是aav2。作为非限制性实例，重组aav病毒的衣壳是aavrh10。作为非限制性实例，重组aav病毒的衣壳是aav9(hu14)。作为非限制性实例，重组aav病毒的衣壳是aav-dj。作为非限制性实例，重组aav病毒的衣壳是aav9.47。作为非限制性实例，重组aav病毒的衣壳是aav-dj8。作为非限制性实验，重组aav病毒的衣壳是aav-php.b。作为非限制性实例，重组aav病毒的衣壳是aav-php.a。

在一些实施方案中，aav血清型可以是或具有美国公开号us20030138772中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于aav1(us20030138772的seqidno：6和64)、aav2(us20030138772的seqidno：7和70)、aav3(us20030138772的seqidno：8和71)、aav4(us20030138772的seqidno：63)、aav5(us20030138772的seqidno：114)、aav6(us20030138772的seqidno：65)、aav7(us20030138772的seqidno：1-3)、aav8(us20030138772的seqidno：4和95)、aav9(us20030138772的seqidno：5和100)、aav10(us20030138772的seqidno：117)、aav11(us20030138772的seqidno：118)、aav12(us20030138772的seqidno：119)、aavrh10(us20030138772中seqidno：81的氨基酸1至738)、aav16.3(us20030138772的seqidno：10)、aav29.3/bb.1(us20030138772seqidno：11)、aav29.4(us20030138772seqidno：12)、aav29.5/bb.2(us20030138772seqidno：13)、aav1.3(us20030138772seqidno：14)、aav13.3(us20030138772seqidno：15)、aav24.1(us20030138772seqidno：16)、aav27.3(us20030138772seqidno：17)、aav7.2(us20030138772seqidno：18)、aavc1(us20030138772seqidno：19)、aavc3(us20030138772seqidno：20)、aavc5(us20030138772seqidno：21)、aavf1(us20030138772seqidno：22)、aavf3(us20030138772seqidno：23)、aavf5(us20030138772seqidno：24)、aavh6(us20030138772seqidno：25)、aavh2(us20030138772seqidno：26)、aav42-8(us20030138772seqidno：27)、aav42-15(us20030138772seqidno：28)、aav42-5b(us20030138772seqidno：29)、aav42-1b(us20030138772seqidno：30)、aav42-13(us20030138772seqidno：31)、aav42-3a(us20030138772seqidno：32)、aav42-4(us20030138772seqidno：33)、aav42-5a(us20030138772seqidno：34)、aav42-10(us20030138772seqidno：35)、aav42-3b(us20030138772seqidno：36)、aav42-11(us20030138772seqidno：37)、aav42-6b(us20030138772seqidno：38)、aav43-1(us20030138772seqidno：39)、aav43-5(us20030138772seqidno：40)、aav43-12(us20030138772seqidno：41)、aav43-20(us20030138772seqidno：42)、aav43-21(us20030138772seqidno：43)、aav43-23(us20030138772seqidno：44)、aav43-25(us20030138772seqidno：45)、aav44.1(us20030138772seqidno：46)、aav44.5(us20030138772seqidno：47)、aav223.1(us20030138772seqidno：48)、aav223.2(us20030138772seqidno：49)、aav223.4(us20030138772seqidno：50)、aav223.5(us20030138772seqidno：51)、aav223.6(us20030138772seqidno：52)、aav223.7(us20030138772seqidno：53)、aava3.4(us20030138772seqidno：54)、aava3.5(us20030138772seqidno：55)、aava3.7(us20030138772seqidno：56)、aava3.3(us20030138772seqidno：57)、aav42.12(us20030138772seqidno：58)、aav44.2(us20030138772seqidno：59)、aav42-2(us20030138772seqidno：9)或其变体。

在一些实施方案中，aav血清型可以是或具有美国公开号us20150159173中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于aav2(us20150159173的seqidno：7和23)、rh20(us20150159173的seqidno：1)、rh32/33(us20150159173的seqidno：2)、rh39(us20150159173的seqidno：3、20和36)、rh46(us20150159173的seqidno：4和22)、rh73(us20150159173的seqidno：5)、rh74(us20150159173的seqidno：6)、aav6.1(us20150159173的seqidno：29)、rh.8(us20150159173的seqidno：41)、rh.48.1(us20150159173的seqidno：44)、hu.44(us20150159173的seqidno：45)、hu.29(us20150159173的seqidno：42)、hu.48(us20150159173的seqidno：38)、rh54(us20150159173的seqidno：49)、aav2(us20150159173的seqidno：7)、cy.5(us20150159173的seqidno：8和24)、rh.10(us20150159173的seqidno：9和25)、rh.13(us20150159173的seqidno：10和26)、aav1(us20150159173的seqidno：11和27)、aav3(us20150159173的seqidno：12和28)、aav6(us20150159173的seqidno：13和29)、aav7(us20150159173的seqidno：14和30)、aav8(us20150159173的seqidno：15和31)、hu.13(us20150159173的seqidno：16和32)、hu.26(us20150159173的seqidno：17和33)、hu.37(us20150159173的seqidno：18和34)、hu.53(us20150159173的seqidno：19和35)、rh.43(us20150159173的seqidno：21和37)、rh2(us20150159173的seqidno：39)、rh.37(us20150159173的seqidno：40)、rh.64(us20150159173的seqidno：43)、rh.48(us20150159173的seqidno：44)、ch.5(us20150159173的seqidno46)、rh.67(us20150159173的seqidno：47)、rh.58(us20150159173的seqidno：48)或其变体，包括但不限于cy5r1、cy5r2、cy5r3、cy5r4、rh.13r、rh.37r2、rh.2r、rh.8r、rh.48.1、rh.48.2、rh.48.1.2、hu.44r1、hu.44r2、hu.44r3、hu.29r、ch.5r1、rh64r1、rh64r2、aav6.2、aav6.1、aav6.12、hu.48r1、hu.48r2和hu.48r3。

在一些实施方案中，aav血清型可以是或具有美国专利号us7198951中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于aav9(us7198951的seqidno：1-3)、aav2(us7198951的seqidno：4)、aav1(us7198951的seqidno：5)、aav3(us7198951的seqidno：6)和aav8(us7198951的seqidno：7)。

在一些实施方案中，aav血清型可以是或具有npulicherla等人((moleculartherapy19(6)：1070-1078(2011)，通过引用整体并入本文)描述的aav9序列中的突变，例如但不限于aav9.9、aav9.11、aav9.13、aav9.16、aav9.24、aav9.45、aav9.47、aav9.61、aav9.68、aav9.84。

在一些实施方案中，aav血清型可以是或具有美国专利号us6156303中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于aav3b(us6156303的seqidno：1和10)、aav6(us6156303的seqidno：2、7和11)、aav2(us6156303的seqidno：3和8)、aav3a(seqidno：4和9，us6156303)或其衍生物。

在一些实施方案中，aav血清型可以是或具有美国公开号us20140359799中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于aav8(us20140359799的seqidno：1)、aavdj(us20140359799的seqidno：2和3)或其变体。

在一些实施方案中，血清型可以是aavdj(或aav-dj)或其变体，如aavdj8(或aav-dj8)，grimm等人所述(journalofvirology82(12)：5887-5911(2008)，其通过引用整体并入本文。aavdj8的氨基酸序列可包含两个或更多个突变以去除肝素结合结构域(hbd)。作为非限制性实例，在美国专利号7,588,772中描述为seqidno：1的aav-dj序列，其内容通过引用整体并入本文，可以包括两个突变：(1)r587q，其中氨基酸587处的精氨酸(r；arg)变为谷氨酰胺(q；gln)和(2)r590t，其中氨基酸590处的精氨酸(r；arg)变为苏氨酸(t；thr)。作为另一个非限制性实例，可包含三个突变：(1)k406r，其中氨基酸406处的赖氨酸(k；lys)变为精氨酸(r；arg)，(2)r587q，其中氨基酸587处的精氨酸(r；arg)变为谷氨酰胺(q；gln)和(3)r590t，其中氨基酸590处的精氨酸(r；arg)变为苏氨酸(t；thr)。

在一些实施方案中，aav血清型可以是或具有国际公开号wo1998011244中所述的aav4序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于aav4(wo1998011244的seqidno：1-20)。

在一些实施方案中，aav血清型可以是或具有aav2序列中的突变以产生aav2g9，如国际公开号wo2014144229中所述，并通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，aav血清型可以是或具有国际公开号wo2005033321中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于aav3-3(wo2005033321的seqidno：217)、aav1(wo2005033321的seqidno：219和202)、aav106.1/hu.37(wo2005033321的seqidno：10)、aav114.3/hu.40(wo2005033321的seqidno：11)、aav127.2/hu.41(wo2005033321的seqidno：6和8)、aav128.3/hu.44(wo2005033321的seqidno：81)、aav130.4/hu.48(wo2005033321的seqidno：78)、aav145.1/hu.53(wo2005033321的seqidno：176和177)、aav145.6/hu.56(wo2005033321的seqidno：168和192)、aav16.12/hu.11(wo2005033321的seqidno：153和57)、aav16.8/hu.10(wo2005033321的seqidno：：156和56)、aav161.10/hu.60(wo2005033321的seqidno：170)、aav161.6/hu.61(wo2005033321的seqidno：174)、aav1-7/rh.48(wo2005033321的seqidno：32)、aav1-8/rh.49(wo2005033321的seqidno：103和25)、aav2(wo2005033321的seqidno：211和221)、aav2-15/rh.62(wo2005033321的seqidno：33和114)、aav2-3/rh.61(wo2005033321的seqidno：21)、aav2-4/rh.50(wo2005033321的seqidno：23和108)、aav2-5/rh.51(wo2005033321的seqidno：104和22)、aav3.1/hu.6(wo2005033321的seqidno：5和84)、aav3.1/hu.9(wo2005033321的seqidno：155和58)、aav3-11/rh.53(wo2005033321的seqidno：186和176)、aav3-3(wo2005033321的seqidno：200)、aav33.12/hu.17(wo2005033321的seqidno：4)、aav33.4/hu.15(wo2005033321的seqidno：50)、aav33.8/hu.16(wo2005033321的seqidno：51)、aav3-9/rh.52(wo2005033321的seqidno：96和18)、aav4-19/rh.55(wo2005033321的seqidno：117)、aav4-4(wo2005033321的seqidno：201和218)、aav4-9/rh.54(wo2005033321的seqidno：116)、aav5(wo2005033321的seqidno：199和216)、aav52.1/hu.20(wo2005033321的seqidno：63)、aav52/hu.19(wo2005033321的seqidno：133)、aav5-22/rh.58(wq2005033321的seqidno：27)、aav5-3/rh.57(wo2005033321的seqidno：105)、aav5-3/rh.57(wo2005033321的seqidno：26)、aav58.2/hu.25(wo2005033321的seqidno：49)、aav6(wo2005033321的seqidno：203和220)、aav7(wo2005033321的seqidno：222和213)、aav7.3/hu.7(wo2005033321的seqidno：55)、aav8(wo2005033321的seqidno：223和214)、aavh-1/hu.1(wo2005033321的seqidno：46)、aavh-5/hu.3(wo2005033321的seqidno：44)、aavhu.1(wo2005033321的seqidno：144)、aavhu.10(wo2005033321的seqidno：156)、aavhu.11(wo2005033321的seqidno：153)、aavhu.12(wo2005033321seqidno：59)、aavhu.13(wo2005033321的seqidno：129)、aavhu.14/aav9(wo2005033321的seqidno：123和3)、aavhu.15(wo2005033321的seqidno：147)、aavhu.16(wo2005033321的seqidno：148)、aavhu.17(wo2005033321的seqidno：83)、aavhu.18(wo2005033321的seqidno：149)、aavhu.19(wo2005033321的seqidno：133)、aavhu.2(wo2005033321的seqidno：143)、aavhu.20(wo2005033321的seqidno：134)、aavhu.21(wo2005033321的seqidno：135)、aavhu.22(wo2005033321的seqidno：138)、aavhu.23.2(wo2005033321的seqidno：137)、aavhu.24(wo2005033321的seqidno：136)、aavhu.25(wo2005033321的seqidno：146)、aavhu.27(wo2005033321的seqidno：140)、aavhu.29(wo2005033321的seqidno：132)、aavhu.3(wo2005033321的seqidno：145)、aavhu.31(wo2005033321的seqidno：121)、aavhu.32(wo2005033321的seqidno：122)、aavhu.34(wo2005033321的seqidno：125)、aavhu.35(wo2005033321的seqidno：164)、aavhu.37(wo2005033321的seqidno：88)、aavhu.39(wo2005033321的seqidno：102)、aavhu.4(wo2005033321的seqidno：141)、aavhu.40(wo2005033321的seqidno：87)、aavhu.41(wo2005033321的seqidno：91)、aavhu.42(wo2005033321的seqidno：85)、aavhu.43(wo2005033321的seqidno：160)、aavhu.44(wo2005033321的seqidno：144)、aavhu.45(wo2005033321的seqidno：127)、aavhu.46(wo2005033321的seqidno：159)、aavhu.47(wo2005033321的seqidno：128)、aavhu.48(wo2005033321的seqidno：157)、aavhu.49(wo2005033321的seqidno：189)、aavhu.51(wo2005033321的seqidno：190)、aavhu.52(wo2005033321的seqidno：191)、aavhu.53(wo2005033321的seqidno：186)、aavhu.54(wo2005033321的seqidno：188)、aavhu.55(wo2005033321的seqidno：187)、aavhu.56(wo2005033321的seqidno：192)、aavhu.57(wo2005033321的seqidno：193)、aavhu.58(wo2005033321的seqidno：194)、aavhu.6(wo2005033321的seqidno：84)、aavhu.60(wo2005033321的seqidno：184)、aavhu.61(wo2005033321的seqidno：185)、aavhu.63(wo2005033321的seqidno：195)、aavhu.64(wo2005033321的seqidno：196)、aavhu.66(wo2005033321的seqidno：197)、aavhu.67(wo2005033321的seqidno：198)、aavhu.7(wo2005033321的seqidno：150)、aavhu.8(wo2005033321seqidno：12)、aavhu.9(wo2005033321的seqidno：155)、aavlg-10/rh.40(wo2005033321的seqidno：14)、aavlg-4/rh.38(wo2005033321的seqidno：86)、aavlg-4/rh.38(wo2005033321的seqidno：7)、aavn721-8/rh.43(wo2005033321的seqidno：163)、aavn721-8/rh.43(wo2005033321的seqidno：43)、aavpi.1(wo2005033321seqidno：28)、aavpi.2(wo2005033321seqidno：30)、aavpi.3(wo2005033321seqidno：29)、aavrh.38(wo2005033321的seqidno：86)、aavrh.40(wo2005033321的seqidno：92)、aavrh.43(wo2005033321的seqidno：163)、aavrh.44(wo2005033321seqidno：34)、aavrh.45(wo2005033321seqidno：41)、aavrh.47(wo2005033321seqidno：38)、aavrh.48(wo2005033321的seqidno：115)、aavrh.49(wo2005033321的seqidno：103)、aavrh.50(wo2005033321的seqidno：108)、aavrh.51(wo2005033321的seqidno：104)、aavrh.52(wo2005033321的seqidno：96)、aavrh.53(wo2005033321的seqidno：97)、aavrh.55(wo2005033321seqidno：37)、aavrh.56(wo2005033321的seqidno：152)、aavrh.57(wo2005033321的seqidno：105)、aavrh.58(wo2005033321的seqidno：106)、aavrh.59(wo2005033321seqidno：42)、aavrh.60(wo2005033321seqidno：31)、aavrh.61(wo2005033321的seqidno：107)、aavrh.62(wo2005033321的seqidno：114)、aavrh.64(wo2005033321的seqidno：99)、aavrh.65(wo2005033321seqidno：35)、aavrh.68(wo2005033321seqidno：16)、aavrh.69(wo2005033321seqidno：39)、aavrh.70(wo2005033321seqidno：20)、aavrh.72(wo2005033321seqidno：9)或其变体，包括但不限于aavcy.2、aavcy.3、aavcy.4、aavcy.5、aavcy.6、aavrh.12、aavrh.17、aavrh.18、aavrh.19、aavrh.21、aavrh.22、aavrh.23、aavrh.24、aavrh.25、aavrh.25/4215、aavrh.31、aavrh.32、aavrh.33、aavrh.34、aavrh.35、aavrh.36、aavrh.37、aavrh14。变体的非限制性实例包括wo2005033321的seqidno：13、15、17、19、24、36、40、45、47、48、51-54、60-62、64-77、79、80、82、89、90、93-95、98、100、101、109-113、118-120、124、126、131、139、142、151、154、158、161、162、165-183、202、204-212、215、219、224-236，其内容通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，aav血清型可以是或具有国际公开号wo2015168666中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于aavrh8r(wo2015168666的seqidno：9)、aavrh8ra586r突变体(wo2015168666的seqidno：10)、aavrh8rr533a突变体(wo2015168666的seqidno：11)或其变体。

在一些实施方案中，aav血清型可以是或具有美国专利号us9233131中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于aavhe1.1(us9233131的seqidno：44)、aavher1.5(us9233131的seqidno：45)、aavher1.14(us9233131的seqidno：46)、aavher1.8(us9233131的seqidno：47)、aavher1.16(us9233131的seqidno：48)、aavher1.18(us9233131的seqidno：49)、aavher1.35(us9233131的seqidno：50)、aavher1.7(us9233131的seqidno：51)、aavher1.36(us9233131的seqidno：52)、aavher2.29(us9233131的seqidno：53)、aavher2.4(us9233131的seqidno：54)、aavher2.16(us9233131的seqidno：55)、aavher2.30(us9233131的seqidno：56)、aavher2.31(us9233131的seqidno：58)、aavher2.36(us9233131的seqidno：57)、aavher1.23(us9233131的seqidno：53)、aavher3.1(us9233131的seqidno：59)、aav2.5t(us9233131的seqidno：42)或其变体。

在一些实施方案中，aav血清型可以是或具有美国专利公开号us20150376607中所述序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于aav-paec(us20150376607的seqidno：1)、aav-lk01(us20150376607的seqidno：2)、aav-lk02(us20150376607的seqidno：3)、aav-lk03(us20150376607的seqidno：4)、aav-lk04(us20150376607的seqidno：5)、aav-lk05(us20150376607的seqidno：6)、aav-lk06(us20150376607的seqidno：7)、aav-lk07(us20150376607的seqidno：8)、aav-lk08(us20150376607的seqidno：9)、aav-lk09(us20150376607的seqidno：10)、aav-lk10(us20150376607的seqidno：11)、aav-lk11(us20150376607的seqidno：12)、aav-lk12(us20150376607的seqidno：13)、aav-lk13(us20150376607的seqidno：14)、aav-lk14(us20150376607的seqidno：15)、aav-lk15(us20150376607的seqidno：16)、aav-lk16(us20150376607的seqidno：17)、aav-lk17(us20150376607的seqidno：18)、aav-lk18(us20150376607的seqidno：19)、aav-lk19(us20150376607的seqidno：20)、aav-paec2(us20150376607的seqidno：21)、aav-paec4(us20150376607的seqidno：22)、aav-paec6(us20150376607的seqidno：23)、aav-paec7(us20150376607的seqidno：24)、aav-paec8(us20150376607的seqidno：25)、aav-paec11(us20150376607的seqidno：26)、aav-paec12(seqidno：27的us20150376607)或其变体。

在一些实施方案中，aav血清型可以是或具有美国专利号us9163261所述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于aav-2-pre-mirna-101(seqidno：1us9163261)或其变体。

在一些实施方案中，aav血清型可以是或具有美国专利公开号us20150376240中所述序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于aav-8h(us20150376240的seqidno：6)、aav-8b(us20150376240的seqidno：5)、aav-h(us20150376240的seqidno：2)、aav-b(us20150376240的seqidno：1)或其变体。

在一些实施方案中，aav血清型可以是或具有美国专利公开号us20160017295中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于aavsm10-2(us20160017295的seqidno：22)、aav穿梭100-1(us20160017295的seqidno：23)、aav穿梭100-3(us20160017295的seqidno：24)、aav穿梭100-7(us20160017295的seqidno：25)、aav穿梭10-2(us20160017295的seqidno：34)、aav穿梭10-6(us20160017295的seqidno：35)、aav穿梭10-8(us20160017295的seqidno：36)、aav穿梭100-2(us20160017295的seqidno：37)、aavsm10-1(us20160017295的seqidno：38)、aavsm10-8(us20160017295的seqidno：39)、aavsm100-3(us20160017295的seqidno：40)、aavsm100-10(us20160017295的seqidno：41)或其变体。

在一些实施方案中，aav血清型可以是或具有美国专利公开号us20150238550中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于bnp61aav(us20150238550的seqidno：1)、bnp62aav(us20150238550的seqidno：3)、bnp63aav(us20150238550的seqidno.4)或其变体。

在一些实施方案中，aav血清型可以是或具有美国专利公开号us20150315612中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于aavrh.50(us20150315612的seqidno：108)、aavrh.43(us20150315612的seqidno：163)、aavrh.62(us20150315612的seqidno：114)、aavrh.48(us20150315612的seqidno：115)、aavhu.19(us20150315612的seqidno：133)、aavhu.11(us20150315612的seqidno：153)、aavhu.53(us20150315612的seqidno：186)、aav4-8/rh.64(us20150315612的seqidno：15)、aavlg-9/hu.39(us20150315612的seqidno：24)、aav54.5/hu.23(us20150315612的seqidno：60)、aav54.2/hu.22(us20150315612的seqidno：67)、aav54.7/hu.24(us20150315612的seqidno：66)、aav54.1/hu.21(us20150315612的seqidno：65)、aav54.4r/hu.27(us20150315612的seqidno：64)、aav46.2/hu.28(us20150315612的seqidno：68)、aav46.6/hu.29(us20150315612的seqidno：69)、aav128.1/hu.43(us20150315612的seqidno：80)或其变体。

在一些实施方案中，aav血清型可以是或具有国际公开号wo2015121501中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于真正类型aav(ttaav)(wo2015121501的seqidno：2)、“upennaav10”(wo2015121501的seqidno.8)、“日本aav10”(wo2015121501的seqidno：9)或其变体。

根据本发明，aav衣壳血清型的选择或使用可以来自多种物种。在一个实施方案中，aav可以是禽aav(aaav)。aaav血清型可以是或具有美国专利号us9238800中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于aaav(us9,238,800的seqidno：1、2、4、6、8、10、12和14)或其变体。

在一个实施方案中，aav可以是牛aav(baav)。baav血清型可以是或具有美国专利号us9,193,769中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于baav(us9193769的seqidno：1和6)或其变体。baav血清型可以是或具有美国专利号us7427396中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于baav(us7427396的seqidno：5和6)或其变体。

在一个实施方案中，aav可以是羊aav。羊aav血清型可以是或具有美国专利号us7427396中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于羊aav(us7427396的seqidno：3)或其变体。

在其它实施方案中，aav可以被工程化为来自两种或更多种亲本血清型的杂交aav。在一个实施方案中，aav可以是aav2g9，其包含来自aav2和aav9的序列。aav2g9aav血清型可以是或具有美国专利公开号us20160017005中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文。

在一个实施方案中，如pulicherla等人(moleculartherapy19(6)：1070-1078(2011))所述，aav可以是由aav9衣壳文库产生的血清型(其中氨基酸390-627(vp1编号)存在突变)，其内容通过引用整体并入本文。血清型以及相应的核苷酸和氨基酸取代可以是但不限于aav9.1(g1594c；d532h)、aav6.2(t1418a和t1436x；v473d和i479k)、aav9.3(t1238a；f413y)、aav9.4(t1250c和a1617t；f417s)、aav9.5(a1235g、a1314t、a1642g、c1760t；q412r、t548a、a587v)、aav9.6(t1231a；f411i)、aav9.9(g1203a、g1785t；w595c)、aav9.10(a1500g、t1676c；m559t)、aav9.11(a1425t、a1702c、a1769t；t568p、q590l)、aav9.13(a1369c、a1720t；n457h、t574s)、aav9.14(t1340a、t1362c、t1560c、g1713a；l447h)、aav9.16(a1775t；q592l)、aav9.24(t1507c、t1521g；w503r)、aav9.26(a1337g、a1769c；y446c、q590p)、aav9.33(a1667c；d556a)、aav9.34(a1534g、c1794t；n512d)、aav9.35(a1289t、t1450a、c1494t、a1515t、c1794a、g1816a；q430l、y484n、n98k、v606i)、aav9.40(a1694t、e565v)、aav9.41(a1348t、t1362c；t450s)、aav9.44(a1684c、a1701t、a1737g；n562h、k567n)、aav9.45(a1492t、c1804t；n498y、l602f)、aav9.46(g1441c、t1525c、t1549g；g481r、w509r、l517v)、9.47(g1241a、g1358a、a1669g、c1745t；s414n、g453d、k557e、t582i)、aav9.48(c1445t、a1736t；p482l、q579l)、aav9.50(a1638t、c1683t、t1805a；q546h、l602h)、aav9.53(g1301a、a1405c、c1664t、g1811t；r134q、s469r、a555v、g604v)、aav9.54(c1531a、t1609a；l511i、l537m)、aav9.55(t1605a；f535l)、aav9.58(c1475t、c1579a；t492i、h527n)、aav.59(t1336c；y446h)、aav9.61(a1493t；n498i)、aav9.64(c1531a、a1617t；l511i)、aav9.65(c1335t、t1530c、c1568a；a523d)、aav9.68(c1510a；p504t)、aav9.80(g1441a；g481r)、aav9.83(c1402a、a1500t；p468t、e500d)、aav9.87(t1464c、t1468c；s490p)、aav9.90(a1196t；y399f)、aav9.91(t1316g、a1583t、c1782g、t1806c；l439r、k528i)、aav9.93(a1273g、a1421g、a1638c、c1712t、g1732a、a1744t、a1832t；s425g、q474r、q546h、p571l、g578r、t582s、d611v)、aav9.94(a1675t；m559l)和aav9.95(t1605a；f535l)。

在一些实施方案中，aav血清型可以是或具有国际公开号wo2016049230中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于aavf1/hsc1(wo2016049230的seqidno：2和20)、aavf2/hsc2(wo2016049230的seqidno：3和21)、aavf3/hsc3(wo2016049230的seqidno：5和22)、aavf4/hsc4(wo2016049230的seqidno：6和23)、aavf5/hsc5(wo2016049230的seqidno：11和25)、aavf6/hsc6(wo2016049230的seqidno：7和24)、aavf7/hsc7(wo2016049230的seqidno：8和27)、aavf8/hsc8(wo2016049230的seqidno：9和28)、aavf9/hsc9(wo2016049230的seqidno：10和29)、aavf11/hsc11(wo2016049230的seqidno：4和26)、aavf12/hsc12(wo2016049230的seqidno：12和30)、aavf13/hsc13(wo2016049230的seqidno：14和31)、aavf14/hsc14(wo2016049230的seqidno：15和32)、aavf15/hsc15(wo2016049230的seqidno：16和33)、aavf16/hsc16(wo2016049230的seqidno：17和34)、aavf17/hsc17(wo2016049230的seqidno：13和35)或其变体或衍生物。

在一些实施方案中，aav血清型可以是或具有美国专利号us8734809中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于aavcbr-e1(us8734809的seqidno：13和87)、aavcbr-e2(us8734809的seqidno：14和88)、aavcbr-e3(us8734809的seqidno：15和89)、aavcbr-e4(us8734809的seqidno：16和90)、aavcbr-e5(us8734809的seqidno：17和91)、aavcbr-e5(us8734809的seqidno：18和92)、aavcbr-e6(us8734809的seqidno：19和93)、aavcbr-e7(us8734809的seqidno：20和94)、aavcbr-e8(us8734809的seqidno：21和95)、aavclv-d1(us8734809的seqidno：22和96)、aavclv-d2(us8734809的seqidno：23和97)、aavclv-d3(us8734809的seqidno：24和98)、aavclv-d4(us8734809的seqidno：25和99)、aavclv-d5(us8734809的seqidno：26和100)、aavclv-d6(us8734809的seqidno：27和101)、aavclv-d7(us8734809的seqidno：28和102)、aavclv-d8(us8734809的seqidno：29和103)、aavclv-e1(us8734809的seqidno：13和87)、aavclv-r1(us8734809的seqidno：30和104)、aavclv-r2(us8734809的seqidno：31和105)、aavclv-r3(us8734809的seqidno：32和106)、aavclv-r4(us8734809的seqidno：33和107)、aavclv-r5(us8734809的seqidno：34和108)、aavclv-r6(us8734809的seqidno：35和109)、aavclv-r7(us8734809的seqidno：36和110)、aavclv-r8(us8734809的seqidno：37和111)、aavclv-r9(us8734809的seqidno：38和112)、aavclg-f1(us8734809的seqidno：39和113)、aavclg-f2(us8734809的seqidno：40和114)、aavclg-f3(us8734809的seqidno：41和115)、aavclg-f4(us8734809的seqidno：42和116)、aavclg-f5(us8734809的seqidno：43和117)、aavclg-f6(us8734809的seqidno：43和117)、aavclg-f7(us8734809的seqidno：44和118)、aavclg-f8(us8734809的seqidno：43和117)、aavcsp-1(us8734809的seqidno：45和119)、aavcsp-10(us8734809的seqidno：46和120)、aavcsp-11(us8734809的seqidno：47和121)、aavcsp-2(us8734809的seqidno：48和122)、aavcsp-3(us8734809的seqidno：49和123)、aavcsp-4(us8734809的seqidno：50和124)、aavcsp-6(us8734809的seqidno：51和125)、aavcsp-7(us8734809的seqidno：52和126)、aavcsp-8(us8734809的seqidno：53和127)、aavcsp-9(us8734809的seqidno：54和128)、aavcht-2(us8734809的seqidno：55和129)、aavcht-3(us8734809的seqidno：56和130)、aavckd-1(us8734809的seqidno：57和131)、aavckd-10(us8734809的seqidno：58和132)、aavckd-2(us8734809的seqidno：59和133)、aavckd-3(us8734809的seqidno：60和134)、aavckd-4(us8734809的seqidno：61和135)、aavckd-6(us8734809的seqidno：62和136)、aavckd-7(us8734809的seqidno：63和137)、aavckd-8(us8734809的seqidno：64和138)、aavclv-1(us8734809的seqidno：35和139)、aavclv-12(us8734809的seqidno：66和140)、aavclv-13(us8734809的seqidno：67和141)、aavclv-2(us8734809的seqidno：68和142)、aavclv-3(us8734809的seqidno：69和143)、aavclv-4(us8734809的seqidno：70和144)、aavclv-6(us8734809的seqidno：71和145)、aavclv-8(us8734809的seqidno：72和146)、aavckd-b1(us8734809的seqidno：73和147)、aavckd-b2(us8734809的seqidno：74和148)、aavckd-b3(us8734809的seqidno：75和149)、aavckd-b4(us8734809的seqidno：76和150)、aavckd-b5(us8734809的seqidno：77和151)、aavckd-b6(us8734809的seqidno：78和152)、aavckd-b7(us8734809的seqidno：79和153)、aavckd-b8(us8734809的seqidno：80和154)、aavckd-h1(us8734809的seqidno：81和155)、aavckd-h2(us8734809的seqidno：82和156)、aavckd-h3(us8734809的seqidno：83和157)、aavckd-h4(us8734809的seqidno：84和158)、aavckd-h5(us8734809的seqidno：85和159)、aavckd-h6(us8734809的seqidno：77和151)、aavcht-1(us8734809的seqidno：86和160)、aavclv1-1(us8734809的seqidno：171)、aavclv1-2(us8734809的seqidno：172)、aavclv1-3(us8734809的seqidno：173)、aavclv1-4(us8734809的seqidno：174)、aavclv1-7(us8734809的seqidno：175)、aavclv1-8(us8734809的seqidno：176)、aavclv1-9(us8734809的seqidno：177)、aavclv1-10(us8734809的seqidno：178)、aav.vr-355(us8734809的seqidno：181)、aav.hu.48r3(us8734809的seqidno：183)或其变体或衍生物。

在一些实施方案中，aav血清型可以是或具有国际公开号wo2016065001中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于aavcht-p2(wo2016065001的seqidno：1和51)、aavcht-p5(wo2016065001的seqidno：2和52)、aavcht-p9(wo2016065001的seqidno：3和53)、aavcbr-7.1(wo2016065001的seqidno：4和54)、aavcbr-7.2(wo2016065001的seqidno：5和55)、aavcbr-7.3(wo2016065001的seqidno：6和56)、aavcbr-7.4(wo2016065001的seqidno：7和57)、aavcbr-7.5(wo2016065001的seqidno：8和58)、aavcbr-7.7(wo2016065001的seqidno：9和59)、aavcbr-7.8(wo2016065001的seqidno：10和60)、aavcbr-7.10(wo2016065001的seqidno：11和61)、aavckd-n3(wo2016065001的seqidno：12和62)、aavckd-n4(wo2016065001的seqidno：13和63)、aavckd-n9(wo2016065001的seqidno：14和64)、aavclv-l4(wo2016065001的seqidno：15和65)、aavclv-l5(wo2016065001的seqidno：16和66)、aavclv-l6(wo2016065001的seqidno：17和67)、aavclv-k1(wo2016065001的seqidno：18和68)、aavclv-k3(wo2016065001的seqidno：19和69)、aavclv-k6(wo2016065001的seqidno：20和70)、aavclv-m1(wo2016065001的seqidno：21和71)、aavclv-m11(wo2016065001的seqidno：22和72)、aavclv-m2(wo2016065001的seqidno：23和73)、aavclv-m5(wo2016065001的seqidno：24和74)、aavclv-m6(wo2016065001的seqidno：25和75)、aavclv-m7(wo2016065001的seqidno：26和76)、aavclv-m8(wo2016065001的seqidno：27和77)、aavclv-m9(wo2016065001的seqidno：28和78)、aavcht-p1(wo2016065001的seqidno：29和79)、aavcht-p6(wo2016065001的seqidno：30和80)、aavcht-p8(wo2016065001的seqidno：31和81)、aavcht-6.1(wo2016065001的seqidno：32和82)、aavcht-6.10(wo2016065001的seqidno：33和83)、aavcht-6.5(wo2016065001的seqidno：34和84)、aavcht-6.6(wo2016065001的seqidno：35和85)、aavcht-6-7(wo2016065001的seqidno：36和86)、aavcht-6.8(wo2016065001的seqidno：37和87)、aavcsp-8.10(wo2016065001的seqidno：38和88)、aavcsp-8.2(wo2016065001的seqidno：39和89)、aavcsp-8.4(wo2016065001的seqidno：40和90)、aavcsp-8.5(wo2016065001的seqidno：41和91)、aavcsp-8.6(wo2016065001的seqidno：42和92)、aavcsp-8.7(wo2016065001的seqidno：43和93)、aavcsp-8.8(wo2016065001的seqidno：44和94)、aavcsp-8.9(wo2016065001的seqidno：45和95)、aavcbr-b7.3(wo2016065001的seqidno：46和96)、aavcbr-b7.4(wo2016065001的seqidno：47和97)、aav3b(wo2016065001的seqidno：48和98)、aav4(wo2016065001的seqidno：49和99)、aav5(wo2016065001的seqidno：50和100)或其变体或衍生物。

在一个实施方案中，aav可以是包含至少一个aav衣壳cd8+t细胞表位的血清型。作为非限制性实例，血清型可以是aav1、aav2或aav8。

在一个实施方案中，aav可以是选自表11所见的任何一种血清型。

在一个实施方案中，aav可以包含表11中序列的序列、片段或变体。

在一个实施方案中，aav可以由表11中所述序列、片段或变体编码。

表11.aav血清型

表11中列出的每篇专利、申请和/或公开均通过引用整体并入本文。

在一个实施方案中，aav血清型可以是或具有国际专利公开wo2015038958中所述的序列，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于aav9(wo2015038958的seqidno：2和11，或此处分别为seqidno：494和495)、aav-php.b(php.b)(wo2015038958的seqidno：8和9，此处为seqidno：1236和1237)、g2b-13(wo2015038958的seqidno：12，本文为seqidno：1238)、g2b-26(wo2015038958的seqidno：13，本文为seqidno：1236和1237)、th1.1-32(wo2015038958的seqidno：14，本文为seqidno：1239)、th1.1-35(wo2015038958的seqidno：15，本文为seqidno：1240)或其变体。此外，wo2015038958中描述的任何靶向肽或氨基酸插入物可以插入任何亲本aav血清型，例如但不限于aav9(dna序列为seqidno：494和氨基酸序列为seqidno：495)。在一个实施方案中，氨基酸插入物插入亲本aav(例如，aav9)的氨基酸586-592之间。在另一个实施方案中，将氨基酸插入物插入亲本aav序列的氨基酸588-589之间。氨基酸插入物可以是，但不限于以下任何氨基酸序列：tlavpfk(wo2015038958的seqidno：1；本文seqidno：1241)、kfpvalt(wo2015038958的seqidno：3；本文seqidno：1242)、lavpfk(wo2015038958的seqidno：31；本文seqidno：1243)、avpfk(wo2015038958的seqidno：32；本文seqidno：1244)、vpfk(wo2015038958的seqidno：33；本文seqidno：1245)、tlavpf(wo2015038958的seqidno：34；本文seqidno：1246)、tlavp(wo2015038958的seqidno：35；本文seqidno：1247)、tlav(wo2015038958的seqidno：36；本文seqidno：1248)、svskpfl(wo2015038958的seqidno：28；本文seqidno：1249)、ftlttpk(wo2015038958的seqidno：29；本文seqidno：1250)、mnatknv(wo2015038958的seqidno：30；本文seqidno：1251)、qssqtpr(wo2015038958的seqidno：54；本文seqidno：1252)、ilgtgts(wo2015038958的seqidno：55；本文seqidno：1253)、trtnpea(wo2015038958的seqidno：56；本文seqidno：1254)、nggtsss(wo2015038958的seqidno：58；本文seqidno：1255)或ytlsqgw(wo2015038958的seqidno：60；本文seqidno：1256)。可编码氨基酸插入物的核苷酸序列的非限制性实例包括以下：aagtttcctgtggcgttgact(对于wo2015038958的seqidno：3；本文seqidno：1257)、actttggcggtgccttttaag(wo2015038958的seqidno：24和49；本文seqidno：1258)、agtgtgagtaagccttttttg(wo2015038958的seqidno：25；本文seqidno：1259)、tttacgttgacgacgcctaag(wo2015038958的seqidno：26；本文seqidno：1260)、atgaatgctacgaagaatgtg(wo2015038958的seqidno：27；本文seqidno：1261)、cagtcgtcgcagacgcctagg(wo2015038958的seqidno：48；本文seqidno：1262)、attctggggactggtacttcg(wo2015038958的seqidno：50和52；本文seqidno：1263)、acgcggactaatcctgaggct(wo2015038958的seqidno：51；本文seqidno：1264)、aatggggggactagtagttct(wo2015038958的seqidno：53；本文seqidno：1265)或tatactttgtcgcagggttgg(wo2015038958的seqidno：59；本文seqidno：1266)。

在一个实施方案中，可以将aav血清型工程化为包含至少一个aav衣壳cd8+t细胞表位。hui等人(moleculartherapy-methods&clinicaldevelopment(2015)2，15029doi：10.1038/mtm.2015.29；其内容通过引用整体并入本文)鉴定了aav1和aav2的aav衣壳特异性cd8+t细胞表位(见例如，该公开中的表2)。作为非限制性实例，衣壳特异性cd8+t细胞表位可用于aav2血清型。作为非限制性实例，衣壳特异性cd8+t细胞表位可用于aav1血清型。

在一个实施方案中，可以将aav血清型工程化为包含至少一个aav2的aav衣壳cd8+t细胞表位，例如但不限于sadnnnsey(seqidno：1267)、lidqylyyl(seqidno：1268)、vpqygyltl(seqidno：1269)、ttstrtwal(seqidno：1270)、yhlngrdsl(seqidno：1271)、sqavgrssf(seqidno：1272)、vpanpsttf(seqidno：1273)、fpqsgvlif(seqidno：1274)、yfdfnrfhchfsprd(seqidno：1275)、vgnssgnwhcdstwm(seqidno：1276)、qfsqagasdirdqsr(seqidno：1277)、gasdirqsrnwlp(seqidno：1278)和gnrqaatadvntqgv(seqidno：1279)。

在一个实施方案中，可以将aav血清型工程化为包含至少一个针对aav1的aav衣壳cd8+t细胞表位，例如但不限于ldrlmnpli(seqidno：1280)、ttstrtwal(seqidno：1270)和qpakkrlnf(seqidno：1281)。

在一个实施方案中，可以使用hui等人描述的方法(moleculartherapy-methods&clinicaldevelopment(2015)2，15029doi：10.1038/mtm.2015.29；其内容通过引用整体并入本文)鉴定aav血清型中纳入的肽。作为非限制性实例，程序包括分离人脾细胞、使用单个跨aav衣壳蛋白氨基酸序列的肽在体外再刺激脾细胞、用体外再刺激所用单个肽进行ifn-γelispot、生物信息学分析以确定ifn-γelispot所鉴定的15-mer的hla限制、针对给定hla等位基因鉴定候选反应性9-mer表位、合成候选9-mer、从携带hla等位基因的受试者(预测所鉴定的aav表位结合该hla等位基因)中进行第二ifn-γelispot的脾细胞筛选、确定aav衣壳反应性cd8+t细胞表位并确定受试者对给定aav表位响应的频率。

在一个实施方案中，如deverman等人所述(naturebiotechnology34(2)：204-209(2016))，aav可以是通过基于cre重组的aav靶向进化(create)产生的血清型，其内容通过引用整体并入本文。在一个实施方案中，与其它aav血清型相比，以这种方式产生的aav血清型具有改善的cns转导和/或神经元和星形细胞向性。作为非限制性实例，aav血清型可以是php.b、php.b2、php.b3、php.a、g2a12、g2a15。在一个实施方案中，这些aav血清型可以是aav9(seqidno：494和495)衍生物，其在氨基酸588-589之间插入7-氨基酸。这些7-氨基酸插入物的非限制性实例包括tlavpfk(seqidno：1241)、svskpfl(seqidno：1249)、ftlttpk(seqidno：1250)、ytlsqgw(seqidno：1256)、qavrtsl(seqidno：1282)和/或lakerls(seqidno：1283)。

在一个实施方案中，aav血清型可以描述于jackson等人(frontiersinmolecularneuroscience9：154(2016))，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，aav血清型是php.b或aav9。在一些实施方案中，与使用更普遍的启动子(即cba或cmv)时相比，aav血清型与突触蛋白启动子配对以增强神经元转导。

在一个实施方案中，如下步骤鉴定aav血清型中纳入的肽：分离人脾细胞、使用单个跨aav衣壳蛋白氨基酸序列的肽在体外再刺激脾细胞、用体外再刺激所用单个肽进行ifn-γelispot、生物信息学分析以确定ifn-γelispot所鉴定的15-mer给定等位基因限制、针对给定等位基因鉴定候选反应性9-mer表位、合成候选9-mer、从携带特定等位基因的受试者(预测所鉴定的aav表位结合该等位基因)中进行第二ifn-γelispot的脾细胞筛选、确定aav衣壳反应性cd8+t细胞表位并确定受试者对给定aav表位响应的频率。

包含sirna分子核酸序列的aav载体，可以得以制备或衍生自各种aav血清型，包括但不限于aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav9.47、aav9(hu14)、aav10、aav11、aav12、aavrh8、aavrh10、aav-dj8、aav-dj、aav-php.a(php.a)和/或aav-php.b(php.b)。在一些情况下，可以将不同aav血清型混合在一起或与其它类型的病毒混合以产生嵌合aav载体。作为非限制性实例，aav载体源自aav9血清型。

病毒基因组组分：反向末端重复(itr)

本发明的aav颗粒包含具有至少一个itr区和有效负载区的病毒基因组。在一个实施方案中，病毒基因组有两个itr。这两个itr在位于5′和3′末端的有效负载区的两侧。itr作为复制起点起作用，包括用于复制的识别位点。itr包括可以互补和对称排列的序列区。并入本发明病毒基因组中的itr可以包含天然存在的多核苷酸序列或重组衍生的多核苷酸序列。

itr可以源自与衣壳相同的血清型，其选自表6中列出的任何血清型或其衍生物。itr可能与衣壳的血清型不同。在一个实施方案中，aav颗粒具有多于一个itr。在非限制性实例中，aav颗粒具有包含两个itr的病毒基因组。在一个实施方案中，itr具有彼此相同的血清型。在另一个实施方案中，itr具有不同的血清型。非限制性实例包括零个、一个或两个itr，其具有与衣壳相同的血清型。在一个实施方案中，aav颗粒的病毒基因组的itr均为aav2itr。

独立地，每个itr可以是约100至约150个核苷酸长。itr可以约100-105个核苷酸长、106-110个核苷酸长、111-115个核苷酸长、116-120个核苷酸长、121-125个核苷酸长、126-130个核苷酸长、131-135个核苷酸长、136-140个核苷酸长、141-145个核苷酸长或146-150个核苷酸长。在一个实施方案中，itr是140-142个核苷酸长。itr长度的非限制性实例是102、140、141、142、145个核苷酸长、以及与其具有至少95％同一性的那些。

在一个实施方案中，编码的sirna分子可位于表达载体中flipitr的5′末端附近。在另一个实施方案中，编码的sirna分子可位于表达载体中flipitr的3′末端附近。在另一个实施方案中，编码的sirna分子可位于表达载体中flopitr的5′末端附近。在另一个实施方案中，编码的sirna分子可以位于表达载体中flopitr的3′末端附近。在一个实施方案中，编码的sirna分子可以位于表达载体中flipitr的5′末端和flopitr的3′末端之间。在一个实施方案中，编码的sirna分子可位于(例如，flipitr的5′末端和flopitr的3′末端或flopitr的3′末端和flipitr的5′末端之间的中间位置)表达载体中flipitr的3′末端和flipitr的5′末端之间。作为非限制性实例，编码的sirna分子可位于表达载体中itr(例如，flip或flopitr)5′或3′末端下游的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或超过30个核苷酸之内。作为非限制性实例，编码的sirna分子可位于表达载体中itr(例如，flip或flopitr)5′或3′末端上游的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或超过30个核苷酸之内。作为另一个非限制性实例，编码的sirna分子可位于表达载体中itr(例如，flip或flopitr)5′或3′末端下游的1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、10-15、10-20、10-25、10-30、15-20、15-25、15-30、20-25、20-30或25-30个核苷酸之内。作为另一个非限制性实例，编码的sirna分子可位于表达载体中itr(例如，flip或flopitr)5′或3′末端上游的1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、10-15、10-20、10-25、10-30、15-20、15-25、15-30、20-25、20-30或25-30个之内。作为非限制性实例，编码的sirna分子可位于表达载体中itr(例如，flip或flopitr)5′或3′末端上游的前1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％或超过25％的核苷酸之内。作为另一个非限制性实例，编码的sirna分子可位于表达载体中itr(例如，flip或flopitr)5′或3′末端下游的前1-5％、1-10％、1-15％、1-20％、1-25％、5-10％、5-15％、5-20％、5-25％、10-15％、10-20％、10-25％、15-20％、15-25％或20-25％之内。

病毒基因组组成：启动子

本领域技术人员可以认识到，靶标细胞可能需要特定的启动子，包括但不限于物种特异性、诱导型、组织特异性或细胞周期特异性的启动子(parr等人，nat.med.3：1145-9(1997)；其内容通过引用整体并入本文)。

在一个实施方案中，启动子是被认为有效驱动调节性多核苷酸表达的启动子。

在一个实施方案中，启动子是具有靶标细胞向性的启动子。

在一个实施方案中，启动子是弱启动子，其在靶标组织(例如但不限于神经系统组织)中持续一段时间提供有效负载(例如调节性多核苷酸，例如sirna或dsrna)的表达。表达可以持续1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、8天、9天、10天、11天、12天、13天、2周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、3周、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、1月、2月、3月、4月、5月、6月、7月、8月、9月、10月、11月、1年、13月、14月、15月、16月、17月、18月、19月、20月、21月、22月、23月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或超过10年的时间段。表达可以持续1-5小时、1-12小时、1-2天、1-5天、1-2周、1-3周、1-4周、1-2月、1-4月、1-6月、2-6月、3-6月、3-9月、4-8月、6-12月、1-2年、1-5年、2-5年、3-6年、3-8年、4-8年或5-10年。作为非限制性实例，启动子是有效负载在神经组织中维持表达的弱启动子。

在一个实施方案中，启动子可以是小于1kb的启动子。启动子可具有200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800或超过800的长度。启动子可具有200-300、200-400、200-500、200-600、200-700、200-800、300-400、300-500、300-600、300-700、300-800、400-500、400-600、400-700、400-800、500-600、500-700、500-800、600-700、600-800或700-800之间的长度。

在一个实施方案中，启动子可以是两个或更多个组分的组合，例如但不限于cmv和cba。各组分可具有200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800或超过800的长度。各组分可具有200-300、200-400、200-500、200-600、200-700、200-800、300-400、300-500、300-600、300-700、300-800、400-500、400-600、400-700、400-800、500-600、500-700、500-800、600-700、600-800或700-800之间的长度。作为非限制性实例，启动子是382个核苷酸的cmv-增强子序列和260个核苷酸的cba-启动子序列的组合。

在一个实施方案中，载体基因组包含至少一个元件以便增强靶标特异性和表达(参见例如，powell等人，viralexpressioncassetteelementstoenhancetransgenetargetspecificityandexpressioningenetherapy，2015；其内容通过引用整体并入本文)。增强转基因靶标特异性和表达的元件的非限制性实例包括启动子、内源mirna、转录后调节元件(pre)、多腺苷酸化(polya)信号序列和上游增强子(use)、cmv增强子和内含子。

在一个实施方案中，载体基因组包含至少一个元件以便增强靶标特异性和表达(参见例如，powell等人，viralexpressioncassetteelementstoenhancetransgenetargetspecificityandexpressioningenetherapy，2015；其内容通过引用整体并入本文)，如启动子。

在大多数组织中促进表达的启动子包括但不限于人延伸因子1α-亚基(eflα)、即刻早期巨细胞病毒(cmv)、鸡β-肌动蛋白(cba)及其衍生物cag、β葡萄糖醛酸酶(gusb)或泛素c(ubc)。组织特异性表达元件可用于将表达限制在某些细胞类型，例如但不限于神经系统启动子，其可用于将表达限制在神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞。对于神经元，组织特异性表达元件的非限制性实例包括神经元特异性烯醇化酶(nse)、血小板衍生生长因子(pdgf)、血小板衍生生长因子b链(pdgf-β)、突触蛋白(syn)、甲基-cpg结合蛋白2(mecp2)、camkii、mglur2、nfl、nfh、nβ2、ppe、enk和eaat2启动子。对于星形胶质细胞，组织特异性表达元件的非限制性实例包括胶质纤维酸性蛋白(gfap)和eaat2启动子。对于少突胶质细胞，组织特异性表达元件的非限制性实例包括髓鞘碱性蛋白(mbp)启动子。

在一个实施方案中，载体基因组包含普遍存在的启动子。普遍存在的启动子的非限制性实例包括h1、u6、cmv、cba(包括衍生物cag、cbh等)、ef-1α、pgk、ubc、gusb(hgbp)以及ucoe(hnrpa2b1-cbx3的启动子)。yu等人(molecularpain2011，7：63；其内容通过引用整体并入本文)在大鼠drg细胞和原代drg细胞中使用慢病毒载体评价egfp在cag、efia，pgk和ubc启动子下的表达，发现ubc表达比其它3个启动子表达更弱，所有启动子只见10-12％神经胶质表达。soderblom等人(e.neuro2015；其内容通过引用整体并入本文)，在运动皮质中注射后，在带有cmv和ubc启动子的aav8中以及带有cmv启动子的aav2中egfp的表达。鼻内施用含有ubc或efia启动子的质粒，显示大于cmv启动子表达的持续气道表达(参见例如，gill等人，genetherapy2001，vol.8，1539-1546，其内容通过引用整体并入本文)。husain等人(genetherapy2009；其内容通过引用整体并入本文)评价带有hgusb启动子、hsv-1lat启动子和nse启动子的hβh构建体，发现hβh构建体表现出比小鼠脑中nse更弱的表达。passini和wolfe(j.virol.2001，12382-12392，其内容通过引用整体并入本文)评价在新生小鼠室内注射后hβh载体的长期作用，并发现其持续表达至少1年。xu等人(genetherapy2001，8，1323-1332；其内容通过引用整体并入本文)发现，相较于cmv-lacz、cmv-luc、ef、gfap、henk、nachr、ppe、ppe+wpre、nse(0.3kb)、nse(1.8kb)和nse(1.8kb+wpre)，当使用nf-l和nf-h启动子时，在所有脑区中低表达。xu等人发现，按降序排列，启动子活性为nse(1.8kb)、ef、nse(0.3kb)、gfap、cmv、henk、ppe、nfl和nfh。nfl是650个核苷酸的启动子，nfh是920个核苷酸的启动子，它们在肝脏中都不存在，但nfh在感觉本体感受神经元、脑和脊髓中是丰富的，并且nfh存在于心脏中。scn8a是470个核苷酸的启动子，在整个drg、脊髓和脑中表达，在海马神经元和小脑浦肯野细胞、皮质、丘脑和下丘脑中表现出尤其高的表达(见例如，drews等人，2007和raymond等人2004；其内容通过引用整体并入本文)。

在一个实施方案中，载体基因组包含ubc启动子。ubc启动子可具有300-350个核苷酸的大小。作为非限制性实例，ubc启动子是332个核苷酸。

在一个实施方案中，载体基因组包含gusb启动子。gusb启动子可能具有350-400个核苷酸的大小。作为非限制性实例，gusb启动子是378个核苷酸。作为非限制性实例，构建体可以是aav-启动子-cmv/珠蛋白内含子-调节性多核苷酸-rbg，其中aav可以是自身互补的，并且aav可以是dj血清型。

在一个实施方案中，载体基因组包含nfl启动子。nfl启动子可具有600-700个核苷酸的大小。作为非限制性实例，nfl启动子是650个核苷酸。作为非限制性实例，构建体可以是aav-启动子-cmv/珠蛋白内含子-调节性多核苷酸-rbg，其中aav可以是自身互补的，并且aav可以是dj血清型。

在一个实施方案中，载体基因组包含nfh启动子。nfh启动子可具有900-950个核苷酸的大小。作为非限制性实例，nfh启动子是920个核苷酸。作为非限制性实例，构建体可以是aav-启动子-cmv/珠蛋白内含子-调节性多核苷酸-rbg，其中aav可以是自身互补的，aav可以是dj血清型。

在一个实施方案中，载体基因组包含scn8a启动子。scn8a启动子可具有450-500个核苷酸的大小。作为非限制性实例，scn8a启动子是470个核苷酸。作为非限制性实例，构建体可以是aav-启动子-cmv/珠蛋白内含子-调节性多核苷酸-rbg，其中aav可以是自身互补的，aav可以是dj血清型。

在一个实施方案中，载体基因组包含poliii启动子。

在一个实施方案中，载体基因组包含p1启动子。

在一个实施方案中，载体基因组包含fxn启动子。

在一个实施方案中，载体基因组包含pgk启动子。

在一个实施方案中，载体基因组包含cba启动子。

在一个实施方案中，载体基因组包含cmv启动子。

在一个实施方案中，载体基因组包含h1启动子。

在一个实施方案中，载体基因组包含u6启动子。

在一个实施方案中，载体基因组包含肝脏或骨骼肌启动子。肝启动子的非限制性实例包括haat和tbg。骨骼肌启动子的非限制性实例包括desmin、mck和c5-12。

在一个实施方案中，aav载体包含增强子元件、启动子和/或5′utr内含子。增强子可以是但不限于cmv增强子，启动子可以是但不限于cmv、cba、ubc、gusb、nse、突触蛋白、mecp2和gfap启动子，5′utr/内含子可以是但不限于sv40和cba-mvm。作为非限制性实例，组合使用的增强子、启动子和/或内含子可以是：(1)cmv增强子、cmv启动子、sv405′utr内含子；(2)cmv增强子、cba启动子、sv405′utr内含子；(3)cmv增强子、cba启动子、cba-mvm5′utr内含子；(4)ubc启动子；(5)gusb启动子；(6)nse启动子；(7)突触蛋白启动子；(8)mecp2启动子；(9)gfap启动子、(10)h1启动子；以及(11)u6启动子。

在一个实施方案中，aav载体具有工程化的启动子。

病毒基因组组成：内含子

在一个实施方案中，载体基因组包含至少一个元件以增强转基因的靶标特异性和表达(参见例如，powell等人，viralexpressioncassetteelementstoenhancetransgenetargetspecificityandexpressioningenetherapy，2015；其内容通过引用整体并入本文)，例如内含子。内含子的非限制性实例包括mvm(67-97bp)、f.ix截短的内含子1(300bp)、β-珠蛋白sd/免疫球蛋白重链剪接受体(250bp)、腺病毒剪接供体/免疫球蛋白剪接受体(500bp)、sv40晚期剪接供体/剪接受体(19s/16s)(180bp)和杂交腺病毒剪接供体/igg剪接受体(230bp)。

在一个实施方案中，内含子可以是100-500个核苷酸长。内含子可以具有80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或500的长度。启动子可以具有80-100、80-120、80-140、80-160、80-180、80-200、80-250、80-300、80-350、80-400、80-450、80-500、200-300、200-400、200-500、300-400、300-500或400-500之间的长度。

在一个实施方案中，aav载体基因组可包含启动子，例如但不限于cmv或u6。作为非限制性实例，对于包含本发明sirna分子核酸序列的aav，启动子是cmv启动子。作为另一个非限制性实例，对于包含本发明sirna分子核酸序列的aav，启动子是u6启动子。

在一个实施方案中，aav载体可包含cmv启动子。

在一个实施方案中，aav载体可包含u6启动子。

在一个实施方案中，aav载体可包含cmv和u6启动子。

在一个实施方案中，aav载体可包含h1启动子。

在一个实施方案中，aav载体可包含cba启动子。

在一个实施方案中，在表达载体中编码的sirna分子可以位于启动子的下游，例如但不限于cmv、u6、h1、cba或具有内含子如sv40、βglobin或本领域已知的其它的内含子的cba启动子。此外，表达载体中编码的sirna分子也可以位于多聚腺苷酸化序列的上游。作为非限制性实例，在表达载体中，编码的sirna分子可位于启动子下游和/或多聚腺苷酸化序列上游的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或多于30个核苷酸之内。作为另一个非限制性实例，在表达载体中，编码的sirna分子可位于启动子下游和/或多聚腺苷酸化序列上游的1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、10-15、10-20、10-25、10-30、15-20、15-25、15-30、20-25、20-30或25-30个核苷酸之内。作为非限制性实例，在表达载体中，编码的sirna分子可位于启动子下游和/或多聚腺苷酸化序列上游的前1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％或超过25％的核苷酸之内。作为另一个非限制性实例，在表达载体中，编码的sirna分子可位于启动子下游和/或多聚腺苷酸化序列上游的前1-5％、1-10％、1-15％、1-20％、1-25％、5-10％、5-15％、5-20％、5-25％、10-15％、10-20％、10-25％、15-20％、15-25％或20-25％之内。

病毒基因组组成：多聚腺苷酸化序列

在一个实施方案中，本发明aav颗粒的病毒基因组包含至少一个多腺苷酸化序列。aav颗粒的病毒基因组可在有效负载编码序列的3′末端和3′itr的5′末端之间包含多聚腺苷酸化序列。

在一个实施方案中，多聚腺苷酸化序列或“polya序列”的范围可以从不存在到约500个核苷酸长。多聚腺苷酸化序列可以是但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499以及500个核苷酸长。

在一个实施方案中，多聚腺苷酸化序列是50-100个核苷酸长。

在一个实施方案中，多聚腺苷酸化序列是50-150个核苷酸长。

在一个实施方案中，多聚腺苷酸化序列是50-160个核苷酸长。

在一个实施方案中，多聚腺苷酸化序列是50-200个核苷酸长。

在一个实施方案中，多聚腺苷酸化序列是60-100个核苷酸长。

在一个实施方案中，多聚腺苷酸化序列是60-150个核苷酸长。

在一个实施方案中，多聚腺苷酸化序列是60-160个核苷酸长。

在一个实施方案中，多聚腺苷酸化序列是60-200个核苷酸长。

在一个实施方案中，多聚腺苷酸化序列是70-100个核苷酸长。

在一个实施方案中，多聚腺苷酸化序列是70-150个核苷酸长。

在一个实施方案中，多聚腺苷酸化序列是70-160个核苷酸长。

在一个实施方案中，多聚腺苷酸化序列是70-200个核苷酸长。

在一个实施方案中，多聚腺苷酸化序列是80-100个核苷酸长。

在一个实施方案中，多聚腺苷酸化序列是80-150个核苷酸长。

在一个实施方案中，多聚腺苷酸化序列是80-160个核苷酸长。

在一个实施方案中，多聚腺苷酸化序列是80-200个核苷酸长。

在一个实施方案中，多聚腺苷酸化序列是90-100个核苷酸长。

在一个实施方案中，多聚腺苷酸化序列是90-150个核苷酸长。

在一个实施方案中，多聚腺苷酸化序列是90-160个核苷酸长。

在一个实施方案中，多聚腺苷酸化序列是90-200个核苷酸长。

在一个实施方案中，表达载体中编码的sirna分子可以位于多聚腺苷酸化序列的上游。此外，在表达载体中编码的sirna分子可位于启动子的下游，例如但不限于cmv、u6、h1、cba或带有sv40或βglobin内含子的cba启动子。作为非限制性实例，在表达载体中编码的sirna分子可位于启动子下游和/或多聚腺苷酸化序列上游的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或超过30个核苷酸之内。作为另一个非限制性实例，在表达载体中编码的sirna分子可位于启动子下游和/或多聚腺苷酸化序列上游的1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、10-15、10-20、10-25、10-30、15-20、15-25、15-30、20-25、20-30或25-30个核苷酸之内。作为非限制性实例，在表达载体中编码的sirna分子可位于启动子下游和/或多聚腺苷酸化序列上游的前1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％或超过25％的核苷酸之内。作为另一个非限制性实例，在表达载体中，编码的sirna分子可位于启动子下游和/或多聚腺苷酸化序列上游的前1-5％、1-10％、1-15％、1-20％、1-25％、5-10％、5-15％、5-20％、5-25％、10-15％、10-20％、10-25％、15-20％、15-25％或20-25％之内。

表达载体

在一个实施方案中，表达载体(例如，aav载体)可包含至少一个调节性多核苷酸，其编码本文所述sirna序列或双链体中的至少一种。

在一个实施方案中，表达载体可以从itr到itr包含，按照5′至3′的方向为itr、启动子、内含子、调节性多核苷酸、polya序列和itr。

基因组大小

在一个实施方案中，包含编码本文所述调节性多核苷酸的核酸序列的载体基因组可以是单链或双链载体基因组。载体基因组的大小可以是小、中、大或最大的大小。另外，载体基因组可包含启动子和polya尾。

在一个实施方案中，包含编码本文所述调节性多核苷酸的核酸序列的载体基因组可以是小的单链载体基因组。小的单链载体基因组的大小可以是2.7至3.5kb，例如大小约2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4和3.5kb。作为非限制性实例，小的单链载体基因组的大小可以是3.2kb。另外，载体基因组可包含启动子和polya尾。

在一个实施方案中，包含编码本文所述调节性多核苷酸的核酸序列的载体基因组可以是小的双链载体基因组。小的双链载体基因组的大小可以是1.3至1.7kb，例如大小约为1.3、1.4、1.5、1.6和1.7kb。作为非限制性实例，小的双链载体基因组的大小可以是1.6kb。另外，载体基因组可包含启动子和polya尾。

在一个实施方案中，包含编码本文所述调节性多核苷酸(例如，sirna或dsrna)的核酸序列的载体基因组可以是中等单链载体基因组。中等单链载体基因组的大小可以是3.6至4.3kb，例如大小为约3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2和4.3kb。作为非限制性实例，中等单链载体基因组的大小可以为4.0kb。另外，载体基因组可包含启动子和polya尾。

在一个实施方案中，包含编码本文所述调节性多核苷酸的核酸序列的载体基因组可以是中等双链载体基因组。中等双链载体基因组的大小可以是1.8至2.1kb，例如大小为约1.8、1.9、2.0和2.1kb。作为非限制性实例，中等双链载体基因组的大小可以是2.0kb。另外，载体基因组可包含启动子和polya尾。

在一个实施方案中，包含编码本文所述调节性多核苷酸的核酸序列的载体基因组可以是大单链载体基因组。大单链载体基因组大小可以是4.4到6.0kb，例如大小约4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9和6.0kb。作为非限制性实例，大单链载体基因组的大小可以为4.7kb。作为另一个非限制性实例，大单链载体基因组的大小可以是4.8kb。作为另一个非限制性实例，大单链载体基因组的大小可以是6.0kb。另外，载体基因组可包含启动子和polya尾。

在一个实施方案中，包含编码本文所述调节性多核苷酸的核酸序列的载体基因组可以是大双链载体基因组。大双链载体基因组大小可以是2.2至3.0kb，例如大小约2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9和3.0kb。作为非限制性实例，大双链载体基因组的大小可以是2.4kb。另外，载体基因组可包含启动子和polya尾。

病毒生产

本公开内容提供了通过病毒复制细胞中病毒基因组的复制而用于产生细小病毒颗粒的方法，例如aav颗粒，所述方法包括使病毒复制细胞与aav多核苷酸或aav基因组接触。

本公开内容提供了用于产生具有增强的(增加的、改善的)转导效率的aav颗粒的方法，其包括以下步骤：1)用杆粒(bacmid)载体和病毒构建体载体和/或aav有效负载构建体载体共同转染感受态细菌细胞，2)分离得到的病毒构建体表达载体和aav有效负载构建体表达载体，并分别转染病毒复制细胞，3)分离和纯化所得有效负载和病毒构建体颗粒，其包含病毒构建体表达载体或aav有效负载构建体表达载体，4)用aav有效负载和病毒构建体颗粒共同感染病毒复制细胞，其包含病毒构建体表达载体或aav有效负载构建体表达载体，5)收获和纯化包含细小病毒基因组的病毒颗粒。

在一个实施方案中，本发明提供了生产aav颗粒的方法，包括以下步骤：1)用有效负载区、表达rep和cap基因的构建体和辅助构建体，同时共转染哺乳动物细胞，例如但不限于hek293细胞，2)收获和纯化包含病毒基因组的aav颗粒。

细胞

本公开提供了包含aav多核苷酸和/或aav基因组的细胞。

本文公开的病毒生产描述了用于生产aav颗粒的过程和方法，所述aav颗粒接触靶标细胞以递送有效负载构建体(如重组病毒构建体)，所述构建体包含编码有效负载分子的多核苷酸序列。

在一个实施方案中，aav颗粒可以在包含昆虫细胞的病毒复制细胞中产生。

培养物中昆虫细胞的生长条件和在培养物中在昆虫细胞中生产异源产物在本领域是公知的，参见美国专利号6,204,059，其内容通过引用整体并入本文。

根据本发明，可以使用允许细小病毒复制并且可以保持在培养物中的任何昆虫细胞。使用的细胞系可以来自草地夜蛾(spodopterafrugiperda)，包括但不限于sf9或sf21细胞系，果蝇(drosophila)细胞系或蚊子细胞系，例如白纹伊蚊(aedesalbopictus)衍生的细胞系。昆虫细胞用于表达异源蛋白的用途已被充分证明，将核酸(如载体，例如昆虫细胞相容载体)导入这些细胞的方法以及将这些细胞维持在培养物中的方法也是如此。参见，例如methodsinmolecularbiology，ed.richard，humanapress，nj(1995)；o′reilly等人，baculovirusexpressionvectors，laboratorymanual，oxforduniv.press(1994)；samulski等人，j.vir.63：3822-8(1989)；kajigaya等人，proc.nat′l.acad.sci.usa88：4646-50(1991)；ruffing等人，j.vir.66：6922-30(1992)；kimbauer等人，vir.219：37-44(1996)；zhao等人，vir.272：382-93(2000)；以及samulski等人，u.s.pat.no.6,204,059；其每一个的内容通过引用整体并入本文。

病毒复制细胞可选自任何生物有机体，包括原核(例如细菌)细胞和真核细胞，包括昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞。病毒复制细胞可包含哺乳动物细胞，例如源自哺乳动物的a549、weh1、3t3、10t1/2、bhk、mdck、cos1、cos7、bsc1、bsc40、bmt10、vero.w138、hela、hek293、saos、c2c12、l细胞、ht1080、hepg2和原代成纤维细胞、肝细胞和成肌细胞。病毒复制细胞包括源自哺乳动物物种的细胞，包括但不限于人、猴、小鼠、大鼠、兔和仓鼠或细胞类型，包括但不限于成纤维细胞、肝细胞、肿瘤细胞、细胞系转化细胞等。

aav颗粒的小规模生产

本文公开的病毒生产描述了用于生产aav颗粒的过程和方法，所述aav颗粒与靶标细胞接触以递送有效负载(例如，重组病毒构建体)，所述构建体包含编码有效负载的多核苷酸序列。

在一个实施方案中，aav颗粒可以在包含哺乳动物细胞的病毒复制细胞中生产。

通常用于生产重组aav颗粒的病毒复制细胞包括但不限于293细胞、cos细胞、hela细胞、kb细胞和其它哺乳动物细胞系，如美国专利号6,156,303、5,387,484、5,741,683、5,691,176和5,688,676；美国专利申请2002/0081721和国际专利申请wo00/47757、wo00/24916和wo96/17947中所述的，其各自的内容通过引用整体并入本文。

在一个实施方案中，在哺乳动物细胞中生产aav颗粒，其中所有三种vp蛋白以接近1∶1∶10(vp1∶vp2∶vp3)的化学计量表达。允许这种受控表达水平的调节机制包括通过差异剪接产生两种mrna，一种用于vp1，另一种用于vp2和vp3。

在另一个实施方案中，使用三重转染方法在哺乳动物细胞中生产aav颗粒，其中有效负载构建体、细小病毒rep和细小病毒cap和辅助构构体包含在三种不同构建体内。aav颗粒生产的三种组成的三重转染方法可用于生产少量批次的病毒用于测定，包括转导效率、靶标组织(向性)评价和稳定性。

杆状病毒

本文公开的颗粒生产描述了用于生产aav颗粒的过程和方法，所述aav颗粒与靶标细胞接触以递送有效负载构建体，所述构建体包含编码有效负载的多核苷酸序列。

简而言之，通过本领域技术人员已知和进行的标准分子生物学技术，通过转座子供体/受体系统，将病毒构建体载体和aav有效负载构建体载体各自掺入杆粒(也称为杆状病毒质粒)。转染单独的病毒复制细胞群产生两种杆状病毒，一种包含病毒构建体表达载体，另一种包含aav有效负载构建体表达载体。两种杆状病毒可用于感染单个病毒复制细胞群以生产aav颗粒。

用于在昆虫细胞中生产病毒颗粒的杆状病毒表达载体，昆虫细胞包括但不限于草地夜蛾(spodopterafrugiperda)(sf9)细胞，所述杆状病毒表达载体提供高滴度的病毒颗粒产物。编码病毒构建体表达载体和aav有效负载构建体表达载体的重组杆状病毒启动病毒复制细胞的生产性感染。从原发感染中释放的感染性杆状病毒颗粒继发感染培养物中的其它细胞，在数个感染周期中指数感染整个细胞培养物群体，所述感染周期是初始感染阶数(multiplicity)的函数，参见urabe，m.等人，jvirol.2006feb；80(4)：1874-85，其内容通过引用整体并入本文。

在昆虫细胞系统中用杆状病毒生产aav颗粒可以解决已知的杆状病毒遗传和物理不稳定性。在一个实施方案中，生产系统通过利用无滴度感染细胞保存和放大系统来解决多次传代的杆状病毒不稳定性。用病毒表达构建体转染病毒生产细胞的小规模种子培养物，所述表达构建体编码病毒颗粒的结构、非结构组成。将杆状病毒感染的病毒生产细胞收获成等分试样，等分试样可以在液氮中冷冻保存；等分试样保留活力和感染大规模病毒生产细胞培养物的感染性，wasilkodj等人，proteinexprpurif.2009jun；65(2)：122-32，其内容通过引用整体并入本文。

遗传稳定的杆状病毒可用于生产一种或多种用于在无脊椎动物细胞中生产aav颗粒的组分来源。在一个实施方案中，有缺陷的杆状病毒表达载体可以在昆虫细胞中游离(episomally)维持。在这样的实施方案中，杆粒载体被设计有复制控制元件，包括但不限于启动子、增强子和/或细胞周期调节复制元件。

在一个实施方案中，可以用(非)选择标记将杆状病毒工程化从而重组在几丁质酶/组织蛋白酶基因座。chia/v-cath基因座对于在组织培养中繁殖杆状病毒不是必需的，并且v-cath(ec3.4.22.50)是对含有arg-arg二肽的底物最具活性的半胱氨酸内切蛋白酶。arg-arg二肽存在于浓核病毒和细小病毒衣壳结构蛋白中，但很少出现在依赖病毒vp1中。

在一个实施方案中，允许用于杆状病毒感染的稳定病毒复制细胞被工程化为具有任何aav复制和病毒颗粒生产所需元件的至少一个稳定整合拷贝，所述元件包括但不限于整个aav基因组、rep和cap基因、rep基因、cap基因，每个rep蛋白作为单独的转录盒，每个vp蛋白作为单独的转录盒，aap(装配激活蛋白)或带有天然或非天然启动子的至少一个杆状病毒辅助基因。

大规模生产

在一些实施方案中，可以修饰aav颗粒的生产以增加生产规模。根据本公开的大规模病毒生产方法可包括美国专利号5,756,283、6,258,595、6,261,551、6,270,996、6,281,010、6,365,394、6,475,769、6,482,634、6,485,966、6,943,019、6,953,690、7,022,519、7,238,526、7,291,498和7,491,508或国际公开号wo1996039530、wo1998010088、wo1999014354、wo1999015685、wo1999047691、wo2000055342、wo2000075353和wo2001023597中所教导的任何方法，其各自的内容通过引用整体并入本文。增加病毒颗粒生产规模的方法通常包括增加病毒复制细胞的数量。在一些实施方案中，病毒复制细胞包含贴壁细胞。为了通过贴壁病毒复制细胞增加病毒颗粒生产的规模，需要更大的细胞培养表面。在一些情况下，大规模生产方法包括使用滚瓶来增加细胞培养表面。其它具有增加的表面积的细胞培养基质是本领域已知的。具有增加的表面积的其它贴壁细胞培养产品的实例包括但不限于(corningcorp.，corning，ny)和nunc^tmcellfactory^tm(thermoscientific，waltham，ma.)。在某些情况下，大规模贴壁细胞表面可包含约1,000cm²至约100,000cm²。在一些情况下，大规模贴壁细胞培养物可包含约10⁷至约10⁹细胞、约10⁸至约10¹⁰细胞、约10⁹至约10¹²细胞或至少10¹²细胞。在一些情况下，大规模贴壁细胞培养物可生产约10⁹至约10¹²、约10¹⁰至约10¹³、约10¹¹至约10¹⁴、约10¹²至约10¹⁵或至少10¹⁵病毒颗粒。

在一些实施方案中，本公开的大规模病毒生产方法可包括使用悬浮细胞培养。悬浮细胞培养允许显著增加细胞数量。通常，可在约10-50cm²表面积上生长的贴壁细胞数量可以悬浮生长在约1cm³体积中。

可以根据本领域已知的任何方法进行大规模培养形式的复制细胞的转染。对于大规模贴壁细胞培养，转染方法可包括但不限于使用无机化合物(例如，磷酸钙)、有机化合物(例如聚乙烯亚胺(pei))或使用非化学方法(如电穿孔)。对于悬浮生长的细胞，转染方法可包括但不限于使用磷酸钙和使用pei。在一些情况下，大规模悬浮培养物的转染可以根据feng，l.等人，2008.biotechnolappl.biochem.50：121-32所述的标题为transfectionprocedure的部分进行，其内容通过引用整体并入本文。根据这些实施方案，可以形成pei-dna复合物用于引入待转染的质粒。在一些情况下，用pei-dna复合物转染的细胞可能在转染前进行“休克(shocked)”。这包括将细胞培养温度降至4℃，持续约1小时。在一些情况下，细胞培养物可以休克约10分钟至约5小时的时间。在一些情况下，细胞培养物可在约0℃至约20℃的温度下进行休克。

在一些情况下，转染可包括一个或多个用于表达rna效应分子的载体，以降低来自一个或多个aav有效负载构建体的核酸表达。这些方法可以通过降低在表达有效负载构建体上浪费的细胞资源来增强病毒颗粒的生产。在一些情况下，这些方法可以根据美国公开号us2014/0099666中教导的那些方法进行，其内容通过引用整体并入本文。

生物反应器

在一些实施方案中，可以使用细胞培养生物反应器用于大规模病毒生产。在一些情况下，生物反应器包括搅拌釜反应器。这类反应器通常包括容器，通常为圆柱形，带有搅拌器(例如，推进器)。在一些实施方案中，这些生物反应器容器可放置在水套内以控制容器温度和/或使环境温度变化的影响最小化。生物反应器容器的体积大小的范围可为约500ml至约2l、约1l至约5l、约2.5l至约20l、约10l至约50l、约25l至约100l、约75l至约500l、约250l至约2,000l、约1,000l至约10,000l、约5,000l至约50,000l或至少50,000l。容器底部可以是圆形或扁平的。在一些情况下，动物细胞培养物可以维持在具有圆形容器底部的生物反应器中。

在某些情况下，可以通过使用热循环器加热生物反应器容器。热循环器在水套周围泵送加热的水。在某些情况下，可以通过生物反应器容器中存在的管道(例如，盘管)泵送加热的水。在一些情况下，热气体可以在生物反应器周围循环，包括但不限于直接在培养介质上方的气体空间。另外，可维持ph和co2水平以优化细胞活力。

在一些情况下，生物反应器可包括中空纤维反应器。中空纤维生物反应器可以支持锚定依赖性和锚定非依赖性细胞的培养。其它生物反应器可包括但不限于填充床或固定床生物反应器。这类生物反应器可以包括具有玻璃珠的容器，玻璃珠用于贴壁细胞附着。其它填充床反应器可包括陶瓷珠。

在一些情况下，通过使用一次性生物反应器生产病毒颗粒。在一些实施方案中，这类生物反应器可包括wave^tm一次性生物反应器。

在一些实施方案中，动物细胞生物反应器培养物中的aav颗粒生产可以根据美国专利号5,064764、6,194,191、6,566,118、8,137,948或美国专利申请号us2011/0229971中教导的方法进行，其各自的内容通过引用整体并入本文。

细胞裂解

可以根据本领域已知的任何方法对本发明的细胞(包括但不限于病毒生产细胞)进行细胞裂解。可以进行细胞裂解以获得一种或多种存在于本发明任何细胞内的剂(例如，病毒颗粒)。在一些实施方案中，细胞裂解可以根据美国专利号7,326,555、7,579,181、7,048,920、6,410,300、6,436,394、7,732,129、7,510,875、7,445,930、6,726,907、6,194,191、7,125,706、6,995,006、6,676,935、7,968,333、5,756,283、6,258,595、6,261,551、6,270,996、6,281,010、6,365,394、6,475,769、6,482,634、6,485,966、6,943,019、6,953,690、7,022,519、7,238,526、7,291,498和7,491,508或国际公开号wo1996039530、wo1998010088、wo1999014354、wo1999015685、wo1999047691、wo2000055342、wo2000075353和wo2001023597中列出的任何方法进行，其各自的内容通过引用整体并入本文。细胞裂解方法可以是化学或机械的。化学细胞裂解通常包括使一个或多个细胞与一种或多种裂解剂接触。机械裂解通常包括使一个或多个细胞经历一种或多种裂解条件和/或一种或多种裂解力。

在一些实施方案中，化学裂解可用于裂解细胞。如本文所用，术语“裂解剂”是指可以帮助破坏细胞的任何试剂。在一些情况下，将裂解剂引入溶液中，称为裂解溶液或裂解缓冲液。如本文所用，术语“裂解溶液”是指包含一种或多种裂解剂的溶液(通常为水性的)。除裂解剂外，裂解溶液可包括一种或多种缓冲剂、增溶剂、表面活性剂、防腐剂、冷冻保护剂、酶、酶抑制剂和/或螯合剂。裂解缓冲液是包含一种或多种缓冲剂的裂解溶液。裂解溶液的其它组成可包括一种或多种增溶剂。如本文所用，术语“增溶剂”是指这样的化合物，其增强一种或多种组合物在溶液中的溶解度和/或溶液所应用至的一种或多种实体的溶解度。在某些情况下，增溶剂增强了蛋白的溶解性。在一些情况下，基于它们增强蛋白溶解度同时保持蛋白构象和/或活性的能力来选择增溶剂。

示例性裂解剂可包括美国专利号8,685,734、7,901,921、7,732,129、7,223,585、7,125,706、8,236,495、8,110,351、7,419,956、7,300,797、6,699,706和6,143,567中所述那些中的任一种，其各自的内容通过引用整体并入本文。在一些情况下，裂解剂可选自裂解盐、两性试剂、阳离子试剂、离子去污剂和非离子去污剂。裂解盐可包括但不限于氯化钠(nacl)和氯化钾(kcl)。其它裂解盐可包括美国专利号8,614,101、7,326,555、7,579,181、7,048,920、6,410,300、6,436,394、7,732,129、7,510,875、7,445,930、6,726,907、6,194,191、7,125,706、6,995,006、6,676,935和7,968,333中描述的任何一种，其各自的内容通过引用整体并入本文。可以增加或降低盐的浓度以获得破裂细胞膜的有效浓度。如本文所提及的两性试剂是能够作为酸或碱反应的化合物。两性试剂可包括但不限于溶血磷脂酰胆碱、3-((3-胆酰胺基丙基)二甲基铵)-1-丙磺酸盐(chaps)、等。阳离子试剂可包括但不限于十六烷基三甲基溴化铵(c(16)tab)和苯扎氯铵。包含去污剂的裂解剂可包括离子去污剂或非离子去污剂。去污剂可起到分解或溶解细胞结构的作用，包括但不限于细胞膜、细胞壁、脂质、碳水化合物、脂蛋白和糖蛋白。示例性离子去污剂包括美国专利号7,625,570和6,593,123或美国公开号us2014/0087361中教导的那些中的任一种，其各自的内容通过引用整体并入本文。一些离子型去污剂可包括但不限于十二烷基硫酸钠(sds)、胆酸盐和脱氧胆酸盐。在一些情况下，离子去污剂可作为增溶剂包含在裂解溶液中。非离子型去污剂可包括但不限于辛基葡糖苷、洋地黄皂苷、芦布若尔(lubrol)、c12e8、tritonx-100和noniodetp-40。非离子型去污剂通常是较弱的裂解剂，但可以作为增溶剂包括在内以溶解细胞和/或病毒蛋白。其它裂解剂可包括酶和尿素。在一些情况下，可以将一种或多种裂解剂组合在裂解溶液中，以增强细胞裂解和蛋白溶解度中的一种或多种。在一些情况下，酶抑制剂可以包括在裂解溶液中，以防止可能由细胞膜破坏引发的蛋白裂解。

在一些实施方案中，进行机械细胞裂解。机械细胞裂解方法可包括使用一种或多种裂解条件和/或一种或多种裂解力。如本文所用，术语“裂解条件”是指促进细胞破坏的状态或环境。裂解条件可包括某些温度、压力、渗透纯度、盐度等。在一些情况下，裂解条件包括升高或降低的温度。根据一些实施方案，裂解条件包括温度变化以促进细胞破坏。根据这样的实施方案进行细胞裂解可包括冻融裂解。如本文所用，术语“冻融裂解”是指在其中细胞溶液经历一个或多个冻融循环的细胞裂解。根据冻融裂解方法，溶液中的细胞被冷冻以诱导由冰晶形成和膨胀引起的细胞膜机械破坏。根据冻融裂解方法使用的细胞溶液可以进一步包含一种或多种裂解剂、增溶剂、缓冲剂、冷冻保护剂、表面活性剂、防腐剂、酶、酶抑制剂和/或螯合剂。一旦经过冷冻的细胞溶液进行解冻，这种组合物可以增强所需细胞产物的回收。在一些情况下，一种或多种冷冻保护剂包括在经历冻融裂解的细胞溶液中。如本文所用，术语“冷冻保护剂”是指用于保护一种或多种物质免于因冷冻而遭破坏的试剂。冷冻保护剂可以包括美国公开号us2013/0323302或美国专利号6,503,888、6,180,613、7,888,096、7,091,030中教导的任何一种，其各自的内容通过引用整体并入本文。在某些情况下，冷冻保护剂可包括但不限于二甲基亚砜、1，2-丙二醇、2,3-丁二醇、甲酰胺、甘油、乙二醇、1，3-丙二醇和正二甲基甲酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基淀粉、琼脂糖、葡聚糖、肌醇、葡萄糖、羟乙基淀粉、乳糖、山梨糖醇、甲基葡萄糖、蔗糖和尿素。在一些实施方案中，可以根据美国专利号7,704,721中描述的任何方法进行冻融裂解，其内容通过引用整体并入本文。

如本文所用，术语“裂解力”是指用于破坏细胞的物理活动。裂解力可包括但不限于机械力、声力、重力、光学力、电动力等。通过机械力进行的细胞裂解在本文称为“机械裂解”。可根据机械裂解使用的机械力可包括高剪切流体力。根据这类机械裂解方法，可以使用微流化器。微流化器通常包括可以施加细胞溶液的入口贮存器。然后可以通过泵(例如，高压泵)以高速和/或高压将细胞溶液泵送到相互作用室中，以产生剪切流体力。然后可以将得到的裂解物收集在一个或多个输出贮存器中。可调节泵速和/或压力以调节细胞裂解并增强产物的回收(例如，病毒颗粒)。其它机械裂解方法可包括通过刮擦对细胞进行物理破坏。

可以基于待裂解细胞的细胞培养形式选择细胞裂解方法。例如，对于贴壁细胞培养物，可以使用一些化学和机械裂解方法。这类机械裂解方法可包括冻融裂解或刮擦。在另一个实例中，贴壁细胞培养物的化学裂解可以通过与包含表面活性剂(例如triton-x-100)的裂解溶液一起孵育来进行。在一些情况下，可以用一种或多种核酸酶处理由贴壁细胞培养物产生的细胞裂解物，以降低由释放的dna引起的裂解物粘度。

在一个实施方案中，用于在没有裂解的情况下收获aav颗粒的方法可用于有效且可规模化的aav颗粒生产。在非限制性实例中，可以通过培养缺乏肝素结合位点的aav颗粒来生产aav颗粒，从而允许aav颗粒进入细胞培养物的上清液，从培养物中收集上清液；以及从上清液中分离aav颗粒，如美国专利申请20090275107所述，其内容通过引用整体并入本文。

澄清

对包含病毒颗粒的细胞裂解物进行澄清。澄清是指从细胞裂解物中纯化病毒颗粒所采取的初始步骤。澄清用于通过去除较大的不溶性碎片来制备用于进一步纯化的裂解物。澄清步骤可包括但不限于离心和过滤。在澄清期间，可以低速进行离心以仅去除较大的碎片。类似地，可以使用具有较大孔径的过滤器进行过滤，从而仅去除较大的碎片。在某些情况下，在澄清过程中可以使用切向流过滤。病毒澄清的目标包括细胞裂解物的高通量加工和优化最终的病毒回收。包括澄清步骤的优点包括用于更大体积裂解物的加工的可规模化。在一些实施方案中，澄清可以根据美国专利号8,524,446、5,756,283、6,258,595、6,261,551、6,270,996、6,281,010、6,365,394、6,475,769、6,482,634、6,485,966、6,943,019、6,953,690、7,022,519、7,238,526、7,291,498、7,491,508、us公开号us2013/0045186、us2011/0263027、us2011/0151434、us2003/0138772和国际公开号wo2002012455、wo1996039530、wo1998010088、wo1999014354、wo1999015685、wo1999047691、wo2000055342、wo2000075353和wo2001023597中提出的任何方法进行，其各自的内容通过引用整体并入本文。

通过过滤澄清细胞裂解物的方法在本领域中是公知的，并且可以根据多种可用方法进行，包括但不限于被动过滤和流动过滤。使用的过滤器可包括各种材料和孔径。例如，细胞裂解物过滤器可包括约1μm至约5μm、约0.5μm至约2μm、约0.1μm至约1μm、约0.05μm至约0.05μm和约0.001μm至约0.1μm的孔径。细胞裂解物过滤器的示例性孔径可包括但不限于2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.95、0.9、0.85、0.8、0.75、0.7、0.65、0.6、0.55、0.5、0.45、0.4、0.35、0.3、0.25、0.2、0.15、0.1、0.05、0.22、0.21、0.20、0.19、0.18、0.17、0.16、0.15、0.14、0.13、0.12、0.11、0.1、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01、0.02、0.019、0.018、0.017、0.016、0.015、0.014、0.013、0.012、0.011、0.01、0.009、0.008、0.007、0.006、0.005、0.004、0.003、0.002、0.001和0.001μm。在一个实施方案中，澄清可以包括通过具有2.0μm孔径的过滤器过滤以除去大的碎片，然后通过具有0.45μm孔径的过滤器以除去完整的细胞。

过滤器的材料可以由多种材料组成。这些材料可包括但不限于聚合物材料和金属材料(例如，烧结金属和有孔的铝)。示例性材料可包括但不限于尼龙、纤维素材料(例如，醋酸纤维素)、聚偏二氟乙烯(pvdf)、聚醚砜、聚酰胺、聚砜、聚丙烯和聚对苯二甲酸乙二醇酯。在一些情况下，用于澄清细胞裂解物的过滤器可包括但不限于ultipleatprofile^tm过滤器(pallcorporation，portwashington，ny)、supor^tm膜过滤器(pallcorporation，portwashington，ny)。

在某些情况下，可以进行流动过滤以提高过滤速度和/或有效性。在一些情况下，流动过滤可包括真空过滤。根据这类的方法，在与待过滤细胞裂解物相对的过滤器一侧产生真空。在一些情况下，细胞裂解物可通过离心力通过过滤器。在某些情况下，泵用于强制细胞裂解物通过澄清过滤器。可以通过调节通道尺寸和/或流体压力中的一个，来调节细胞裂解物通过一个或多个过滤器的流速。

根据一些实施方案，可以通过离心使细胞裂解物澄清。离心可用于在裂解物中沉淀不溶性颗粒。在澄清期间，离心强度(以重力单位(g)表示，其表示标准重力的倍数)可以低于随后的纯化步骤。在一些情况下，以约200g至约800g、约500g至约1500g、约1000g至约5000g、约1200g至约10000g或约8000g至约15000g，在细胞裂解物上进行离心。在一些实施方案中，以8000g进行细胞裂解物的15分钟离心。在一些情况下，可以进行密度梯度离心以通过沉降速率分配细胞裂解物中的颗粒。根据本公开的方法使用的梯度可以包括但不限于氯化铯梯度和碘克沙醇分阶梯度。

纯化：色谱法

在一些情况下，可以通过一种或多种色谱法从澄清的细胞裂解物中纯化aav颗粒。色谱法是指本领域已知的用于从混合物中分离出一种或多种要素的任何数量的方法。这些方法可包括但不限于离子交换色谱法(例如，阳离子交换色谱和阴离子交换色谱)、免疫亲和色谱和尺寸排阻色谱。在一些实施方案中，病毒色谱的方法可包括美国专利号5,756,283、6,258,595、6,261,551、6,270,996、6,281,010、6,365,394、6,475,769、6,482,634、6,485,966、6,943,019、6,953,690、7,022,519、7,238,526、7,291,498和7,491,508或国际公开号wo1996039530、wo1998010088、wo1999014354、wo1999015685、wo1999047691、wo2000055342、wo2000075353和wo2001023597中教导的那些的任一种，其各自的内容通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，离子交换色谱可用于分离病毒颗粒。基于存在于衣壳蛋白和固定相上带电位点之间的电荷-电荷相互作用，离子交换色谱用于结合病毒颗粒，所述固定相通常是病毒制备物(例如，澄清裂解物)流穿的柱。在施加病毒制备物后，然后可以通过应用洗脱溶液以破坏电荷-电荷相互作用来洗脱结合的病毒颗粒。可以通过调节盐浓度和/或ph来优化洗脱溶液以增强结合的病毒颗粒的回收。根据分离的病毒衣壳的电荷，可以选择阳离子或阴离子交换色谱法。离子交换色谱的方法可包括但不限于美国专利号7,419,817、6,143,548、7,094,604、6,593,123、7,015,026和8,137,948中所教导的任何方法，其各自的内容通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，可以使用免疫亲和色谱。免疫亲和色谱是利用一种或多种免疫化合物(例如抗体或抗体相关结构)以保留病毒颗粒的色谱形式。免疫化合物可以特异性结合病毒颗粒表面上的一种或多种结构，包括但不限于一个或多个病毒外壳蛋白。在一些情况下，免疫化合物可能对特定病毒变体具有特异性。在一些情况下，免疫化合物可以与多种病毒变体结合。在一些实施方案中，免疫化合物可包括重组单链抗体。此类重组单链抗体可包括smith，r.h等人，2009.mol.ther.17(11)：1888-96中所述的那些，其内容通过引用整体并入本文。此类免疫化合物能够结合几种aav衣壳变体，包括但不限于aav1、aav2、aav6和aav8。

在一些实施方案中，可以使用尺寸排阻色谱法(sec)。sec可包括使用凝胶根据尺寸分离颗粒。在病毒颗粒纯化中，sec过滤有时被称为“精制”。在一些情况下，可以进行sec以产生接近均匀的最终产物。在某些情况下，这些最终产品可用于临床前研究和/或临床研究(kotin，r.m.2011.humanmoleculargenetics.20(1)：r2-r6，其内容通过引用整体并入本文)。在一些情况下，sec可以根据美国专利号6,143,548、7,015,026、8,476,418、6,410,300、8,476,418、7,419,817、7,094,604、6,593,123和8,137,948中教导的任何方法进行，其各自的内容通过引用整体并入本文。

在一个实施方案中，可以使用美国专利号us6146874中描述的方法分离或纯化包含至少一个aav颗粒的组合物，其内容通过引用整体并入本文。

在一个实施方案中，可以使用美国专利号us6660514中描述的方法分离或纯化包含至少一个aav颗粒的组合物，其内容通过引用整体并入本文。

在一个实施方案中，可以使用美国专利号us8283151中描述的方法分离或纯化包含至少一个aav颗粒的组合物，其内容通过引用整体并入本文。

在一个实施方案中，可以使用美国专利号us8524446中描述的方法分离或纯化包含至少一个aav颗粒的组合物，其内容通过引用整体并入本文。

ii.制剂和递送

药物组合物和制剂

除了本文提供的药物组合物(载体，例如包含编码sirna分子的核酸序列的aav载体)是适于对人施用的药物组合物之外，本领域技术人员将理解这类组合物通常适用于任何其它动物，例如非人动物，例如非人哺乳动物。修饰适于人施用的药物组合物以使得组合物适合施用于各种动物是公知的，并且普通兽医药理学家可以仅通过普通(如有)实验来设计和/或进行这种修饰。施用药物组合物的受试者，认为包括但不限于人和/或其它灵长类动物；哺乳动物，包括商业上相关的哺乳动物，如牛、猪、马、羊、猫、狗、小鼠和/或大鼠；以及/或禽，包括商业上相关的禽，例如家禽、鸡、鸭、鹅和/或火鸡。

在一些实施方案中，将组合物施用于人、人患者或受试者。出于本公开的目的，短语“活性成分”通常指合成的sirna双链体、编码sirna双链体的载体例如aav载体，或本文所述载体所递送的sirna分子。

可以通过药物学领域中已知或以后开发的任何方法制备本文所述的药物组合物的制剂。通常，这类制备方法包括将活性成分与赋形剂和/或一种或多种其它辅助成分结合的步骤，然后(如果必要和/或期望)将产品分装、成形和/或包装成所需的单一或多剂量单位。

根据本发明的药物组合物中活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何其它成分的相对量，将根据所治疗受试者的身份、大小和/或状况而变化，并且还取决于组合物的施用途径。

可以使用一种或多种赋形剂配制包含编码本发明sirna分子的核酸序列的载体例如aav载体，以便：(1)增加稳定性；(2)增加细胞转染或转导；(3)允许持续或延迟释放；或(4)改变生物分布(例如，将病毒载体靶向特定组织或细胞类型，例如脑和神经元)。

本发明的制剂可包括但不限于盐水、类脂质、脂质体、脂质纳米颗粒、聚合物、脂质复合物、核-壳纳米颗粒、肽、蛋白、用病毒载体转染的细胞(例如，用于移植到受试者中)、纳米颗粒模拟物及其组合。此外，可以使用自组装核酸纳米颗粒配制本发明的病毒载体。

可以通过药物学领域中已知或以后开发的任何方法制备本文所述的药物组合物的制剂。通常，此类制备方法包括将活性成分与赋形剂和/或一种或多种其它辅助成分相结合的步骤。

根据本公开的药物组合物可以作为单一单位剂量和/或作为多个单一单位剂量批量制备、包装和/或销售。如本文所用，“单位剂量”是指包含预定量活性成分的离散量的药物组合物。活性成分的量通常等于施用于受试者的活性成分的剂量和/或该剂量的方便部分，例如这种剂量的一半或三分之一。

根据本公开的药物组合物中活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何其它成分的相对量可以根据所治疗受试者的身份、大小和/或状况而变化，并且还取决于组合物的施用途径。例如，组合物可包含0.1％和99％(w/w)的活性成分。举例来说，组合物可包含0.1％至100％之间，例如0.5％至50％之间、1-30％之间、5-80％之间、至少80％(w/w)的活性成分。

在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂可以是至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％纯。在一些实施方案中，赋形剂被批准用于人和兽医用途。在一些实施方案中，赋形剂可以由美国食品和药物管理局批准。在一些实施方案中，赋形剂可以是药用级的。在一些实施方案中，赋形剂可以符合美国药典(usp)、欧洲药典(ep)、英国药典和/或国际药典的标准。

如本文所用，赋形剂包括但不限于适合所需特定剂型的任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其它液体载体、分散剂或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂等。用于配制药物组合物的各种赋形剂和用于制备组合物的技术是本领域已知的(参见remington：thescienceandpracticeofpharmacy，21^st版，a.r.gennaro，lippincott，williams&wilkins，baltimore，md，2006；通过引用整体并入本文)。除非任何常规赋形剂介质可能与物质或其衍生物不相容，例如通过产生任何不希望的生物效应、或与药物组合物中任何其它组成以有害方式相互作用，否则在本公开的范围内考虑使用常规赋形剂介质。

示例性稀释剂包括但不限于碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠、乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉、糖粉等和/或它们的组合。

在一些实施方案中，制剂可包含至少一种非活性成分。如本文所用，术语“非活性成分”是指制剂中包含的一种或多种非活性剂。在一些实施方案中，可以在本发明的制剂中使用的所有、无或一些非活性成分可以由美国食品和药品管理局(fda)批准。

包含本发明sirna分子的核酸序列的载体制剂可包括阳离子或阴离子。在一个实施方案中，制剂包括金属阳离子，例如但不限于zn2+、ca2+、cu2+、mg+及其组合。

如本文所用，“药学上可接受的盐”是指公开化合物的衍生物，其中通过现有的酸或碱基部分转化为其盐形式来修饰母体化合物(例如，通过使游离碱基与合适的有机酸反应)。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基(例如胺)的无机或有机酸盐；酸性残基(例如羧酸)的碱金属或有机盐；等。代表性的酸加成盐包括乙酸盐、乙酸、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯磺酸、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂烷硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。代表性的碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等，以及无毒的铵、季铵和胺阳离子包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。本公开的药学上可接受的盐包括由例如无毒无机或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐。本公开的药学上可接受的盐可以通过常规化学方法由含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。通常，这些盐可以通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量适当的碱或酸在水中或在有机溶剂中或两种的混合物中进行反应来制备；通常，非水介质如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈是优选的。合适的盐的列表可发现于remington’spharmaceuticalsciences，17^th版，mackpublishingcompany，easton，pa.，1985，p.1418，pharmaceuticalsalts：properties，selection，anduse，p.h.stahl和c.g.wermuth(编)，wiley-vch，2008，以及berge等人，journalofpharmaceuticalscience，66，1-19(1977)；其各自的内容通过引用整体并入本文。

本文所用的术语“药学上可接受的溶剂化物”是指其中合适的溶剂分子掺入晶格中的本发明化合物。合适的溶剂在施用剂量下是生理上可耐受的。例如，溶剂化物可以通过结晶、重结晶或从溶液中沉淀来制备，所述溶液包括有机溶剂、水或其混合物。合适溶剂的实例是乙醇、水(例如，单水合物、二水合物和三水合物)、n-甲基吡咯烷酮(nmp)、二甲基亚砜(dmso)、n，n′-二甲基甲酰胺(dmf)、n，n′-二甲基乙酰胺(dmac)、1，3-二甲基-2-咪唑烷酮(dmeu)、1，3-二甲基-3，4，5，6-四氢-2-(1h)-嘧啶酮(dmpu)、乙腈(acn)、丙二醇、乙酸乙酯、苯甲醇、2-吡咯烷酮、苯甲酸苄酯等。当水是溶剂时，溶剂化物被称为“水合物”。

根据本发明，包含本发明sirna分子的核酸序列的载体例如aav载体，可以配制用于cns递送。可以使用穿过血脑屏障(bbb)的剂。例如，一些可以将sirna分子靶向bbb内皮的细胞穿透肽可以用于配制靶向htt基因的sirna双链体。

非活性成分

在一些实施方案中，制剂可以包含至少一种赋形剂，其是非活性成分。如本文所用，术语“非活性成分”是指制剂中包含的一种或多种非活性剂。在一些实施方案中，可以在本公开的制剂中使用的所有、无或一些非活性成分可以由美国食品和药品管理局(fda)批准。

本文所述的aav颗粒和携带病毒载体的组合物的制剂可包括阳离子或阴离子。在一个实施方案中，制剂包括金属阳离子，例如但不限于zn2+、ca2+、cu2+、mg+及其组合。作为非限制性实例，制剂可以包括与金属阳离子复合的本文所述的聚合物和组合物(参见例如美国专利号6,265,389和6,555,525，其各自通过引用整体并入本文)。

递送

在一个实施方案中，可以使用欧洲专利申请号ep1857552中所述的递送aav病毒粒子的方法来施用或递送包含本文所述病毒载体的组合物，其内容通过引用整体并入本文。

在一个实施方案中，可以使用欧洲专利申请号ep2678433中描述的利用aav载体递送蛋白的方法，来施用或递送包含本文所述病毒载体的组合物，其内容通过引用整体并入本文。

在一个实施方案中，可以使用美国专利号us5,858,351中描述的使用aav载体递送dna分子的方法，施用或递送包含本文所述病毒载体的组合物，其内容通过引用整体并入本文。

在一个实施方案中，可以使用美国专利号us6,211,163中描述的将dna递送至血流的方法，施用或递送包含本文所述病毒载体的组合物，其内容通过引用整体并入本文。

在一个实施方案中，可以使用美国专利us6,325,998中描述的递送aav病毒粒子的方法，施用或递送包含本文所述病毒载体的组合物，其内容通过引用整体并入本文。

在一个实施方案中，可以使用美国专利us7,588,757中描述的将有效负载递送至中枢神经系统的方法，施用或递送包含本文所述病毒载体的组合物，其内容通过引用整体并入本文。

在一个实施方案中，可以使用美国专利号us8283151中描述的递送有效负载的方法，施用或递送包含本文所述病毒载体的组合物，其内容通过引用整体并入本文。

在一个实施方案中，可以使用国际专利公开号wo2001089583中描述的使用谷氨酸脱羧酶(gad)递送载体递送有效负载的方法，来施用或递送包含本文所述病毒载体的组合物，其内容通过引用整体并入本文。

在一个实施方案中，可以使用国际专利公开号wo2012057363中描述的向神经细胞递送有效负载的方法，施用或递送包含本文所述病毒载体的组合物，其内容通过引用整体并入本文。

递送至细胞

本公开内容提供了向细胞或组织递送任何上述aav多核苷酸或aav基因组的方法，包括使细胞或组织与所述aav多核苷酸或aav基因组接触、或使细胞或组织与包含所述aav多核苷酸或aav基因组的颗粒接触、或使细胞或组织与任何所述组合物(包括药物组合物)接触。将aav多核苷酸或aav基因组递送至细胞或组织的方法可以在体外、离体或体内完成。

引入细胞-合成dsrna

为了确保sirna分子(例如，sirna双链体和dsrna)的化学和生物稳定性，重要的是在靶标细胞内递送sirna分子。在一些实施方案中，细胞可包括但不限于哺乳动物来源的细胞、人来源的细胞、胚胎干细胞、诱导的多能干细胞、神经干细胞和神经祖细胞。

在正常生理条件下，核酸(包括sirna)在糖-磷酸骨架上携带净负电荷。为了进入细胞，sirna分子必须与细胞膜的脂质双层接触，其头部基团也带负电荷。

sirna双链体可与载体复合，使其能够穿过细胞膜如包装颗粒以促进sirna的细胞摄取。包装颗粒可包括但不限于脂质体、纳米颗粒、阳离子脂质、聚乙烯亚胺衍生物、树枝状大分子、碳纳米管和碳制纳米颗粒与树枝状大分子的组合。脂质可以是阳离子脂质和/或中性脂质。除了在sirna分子和阳离子载体之间建立良好的亲脂性复合物之外，sirna分子还可以与疏水部分缀合，例如胆固醇(例如，美国专利公开号20110110937；其内容通过引用整体并入本文)。该递送方法具有改善sirna分子的体外细胞摄取和体内药理学性质的潜力。本发明的sirna分子也可以与某些阳离子细胞穿透肽(cpp)共价或非共价缀合，例如mpg、转运蛋白或穿膜肽(penetratin)(例如，美国专利公开号20110086425；其内容通过引用整体并入本文)。

引入细胞-aav载体

通过使用多种方法中的任何一种，例如但不限于病毒载体(例如，aav载体)，本发明的sirna分子(例如，sirna双链体)可引入细胞中。对这些病毒载体进行工程化和优化，以促进sirna分子进入不易于转染的细胞中。此外，一些合成的病毒载体具有将shrna整合到细胞基因组中的能力，从而导致稳定的sirna表达和靶标基因的长期敲低。以这种方式，病毒载体被工程化为用于特异性递送的载体，同时缺乏野生型病毒中发现的有害复制和/或整合特征。

在一些实施方案中，通过使细胞与包含亲脂性载体和载体的组合物(例如aav载体)接触，将本发明的sirna分子引入细胞中，所述载体包含本发明sirna分子核酸序列。在其它实施方案中，通过用载体(例如aav载体)转染或感染细胞将sirna分子引入细胞，所述载体包含当在细胞中转录时能够生产sirna分子的核酸序列。在一些实施方案中，通过将载体(例如aav载体)注入细胞，将sirna分子导入细胞，所述载体包含在细胞中转录时能够生产sirna分子的核酸序列。

在一些实施方案中，在转染之前，可以将包含编码本发明sirna分子的核酸序列的载体(例如aav载体)转染到细胞中。

在其它实施方案中，可以通过电穿孔将包含编码本发明sirna分子的核酸序列的载体(例如aav载体)递送到细胞中(例如，美国专利公开号20050014264；其内容通过引用整体并入本文)。

用于引入包含本文所述sirna分子的核酸序列的载体(例如，aav载体)的其它方法可包括美国专利公开号20120264807中所述的光化学内化；其内容通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，本文所述的制剂可含有至少一种载体，例如aav载体，其包含编码本文所述sirna分子的核酸序列。在一个实施方案中，sirna分子可以在一个靶标位点处靶向htt基因。在另一个实施方案中，制剂包含多种载体，例如aav载体，每种载体包含编码sirna分子的核酸序列，所述sirna分子在不同靶标位点处靶向htt基因。可以在2、3、4、5或多于5个位点处靶向htt。

在一个实施方案中，可以将来自任何相关物种，例如但不限于人、狗、小鼠、大鼠或猴的载体(例如aav载体)引入细胞中。

在一个实施方案中，可以将载体(例如，aav载体)引入与待治疗疾病相关的细胞中。作为非限制性实例，疾病是hd，靶标细胞是神经元和星形胶质细胞。作为另一个非限制性实例，疾病是hd并且靶标细胞是中型多棘神经元、皮质神经元和星形胶质细胞。

在一个实施方案中，可以将载体(例如，aav载体)引入具有靶标序列高水平内源表达的细胞中。

在另一个实施方案中，可以将载体(例如aav载体)引入具有靶标序列低水平内源表达的细胞中。

在一个实施方案中，细胞可以是具有高效aav转导的细胞。

向受试者递送

本公开另外提供向受试者(包括哺乳动物受试者)递送任何上述aav多核苷酸或aav基因组的方法，所述方法包括向受试者施用所述aav多核苷酸或aav基因组、或向受试者施用包含所述aav多核苷酸或aav基因组的颗粒、或向受试者施用任何所述组合物(包括药物组合物)。

本文所述病毒载体的药物组合物的特征可在于生物利用度、治疗窗和/或分布体积中的一种或多种。

iii.施用和给药

施用

可通过任何导致治疗有效结果的途径，施用包含编码本发明sirna分子的核酸序列的载体(例如，aav载体)。这些包括但不限于器官的实质内，例如但不限于脑(例如，脑实质内)、纹状体(纹状体内)、肠内(进入肠)、胃肠、硬膜上(epidural)、口腔(通过口腔)、透皮、硬膜外(peridural)、脑内(进入大脑)、脑室内(进入脑室)、表皮(应用于皮肤)、皮内(进入皮肤本身)、皮下(皮肤下)、鼻施用(通过鼻)、静脉注射(进入静脉)、静脉推注、静脉滴注、动脉内(动脉内)、肌内(肌肉内)、心内(心脏内)、骨内输注(进入骨髓)、鞘内(intrathecal)(进入椎管)、软膜下(软膜(pia)和下层组织之间)、神经节内(进入神经节)、腹膜内(输注或注射入腹膜)、膀胱内输注、玻璃体内(通过眼)、海绵窦内注射(进入病理腔)、腔内(阴茎根部内)、阴道内施用、子宫内、羊膜外施用、透皮(通过完整皮肤扩散全身分布)、透粘膜(通过粘膜扩散)、经阴道、吹入(鼻吸)、舌下、阴唇下、灌肠、滴眼(结膜上)、滴耳、耳廓(耳内或通过耳)、颊(指向脸颊)、结膜、皮肤、牙齿(向牙)、电渗、宫颈内、内窥镜、气管内、体外、血液透析、浸润、间质、腹腔内、羊膜腔内、关节内、胆管内、支气管内、囊内(intrabursal)、软骨内(软骨内)、尾内(马尾内)、脑池内(小脑延髓池内)、角膜内(角膜内)、牙冠内、冠状动脉内(冠状动脉内)、海绵体内(在阴茎海绵体的可扩张空间内)、盘内(椎间盘内)、导管内(腺管内)、十二指肠内(十二指肠内)、硬膜内(硬脑膜内或下)、表皮内(至表皮)、食管内(食管内)、胃内(胃内)、龈内(牙龈内)、回肠内(在小肠远端部分内)、病灶内(在局部病变内或直接引入局部病变)、管腔内(管腔内)、淋巴内(淋巴内)、髓内(骨髓腔内)、脑膜内(脑膜内)、眼内(眼内)、卵巢内(卵巢内)、心包内(心包内)、胸膜内(胸膜内)、前列腺内(前列腺内)、肺内(肺内或支气管内)、窦内(鼻内或眶周窦内)、椎内(椎体内)、滑膜内(关节滑膜腔内)、腱内(肌腱内)、睾丸内(睾丸内)、鞘内(在脑脊髓轴任何水平的脑脊液内)、胸内(胸腔内)、管内(器官小管内)、肿瘤内(肿瘤内)、鼓室内(aurusmedia内)、血管内(血管内)、室内(室内)、离子电渗疗法(通过电流，可溶性盐的离子迁移到身体组织中)、盥洗(洗或冲洗开放的伤口或体腔)、喉(直接在喉上)、鼻胃管(通过鼻进入胃)、闭塞敷料技术(局部途径的施用，然后覆盖敷料以覆盖区域)、眼科(至外眼)、口咽(直接到口和咽)、肠外、经皮、关节周围、硬膜外、神经周、牙周、直肠、呼吸道(通过口服或鼻腔吸入呼吸道以产生局部或全身效应)、眼球后(脑桥后方或眼球后方)、软组织，蛛网膜下腔、结膜下、粘膜下、局部、经胎盘(通过或穿过胎盘)、经气管(通过气管壁)、经鼓室(穿过或通过鼓室)、输尿管(到输尿管)、尿道(到尿道)、阴道、尾部阻滞、诊断、神经阻滞、胆道灌注、心脏灌注、光照或脊髓。

在具体的实施方案中，可以以促进载体或sirna分子进入中枢神经系统并渗透到中型多棘和/或皮质神经元和/或星形胶质细胞的方式，施用包含编码本发明sirna分子核酸序列的载体(例如，aav载体)的组合物。

在一些实施方案中，可以通过肌内注射，施用包含编码本发明sirna分子核酸序列的载体(例如，aav载体)。

在一个实施方案中，可以通过实质内注射，施用包含编码本发明sirna分子核酸序列的载体(例如，aav载体)。

在一个实施方案中，可以通过实质内注射和鞘内注射，施用包含编码本发明sirna分子核酸序列的载体(例如，aav载体)。

在一个实施方案中，可以通过纹状内注射，施用包含编码本发明sirna分子核酸序列的载体(例如，aav载体)。

在一个实施方案中，可以通过纹状内注射和本文所述的另一种施用途径，施用包含编码本发明sirna分子核酸序列的载体(例如，aav载体)。

在一些实施方案中，可以通过外周注射(例如，静脉内)和/或鼻内递送将表达本发明sirna双链体的aav载体施用于受试者。本领域公开了外周施用sirna双链体的aav载体可以转运至中枢神经系统，例如转运至神经元(例如，美国专利公开号20100240739以及20100130594；其各自的内容通过引用整体并入本文)。

在其它实施方案中，可以通过颅内递送给受试者施用包含至少一个载体(例如，aav载体)的组合物，所述载体包含编码本发明sirna分子的核酸序列(参见，例如美国专利号8,119,611；其内容通过引用整体并入本文)。

可以以任何合适的形式，作为液体溶液或悬浮液、作为适于液体溶液或悬浮于液体溶液中的固体形式，施用包含编码本发明sirna分子核酸序列的载体(例如，aav载体)。sirna双链体可以与任何合适的和药学上可接受的赋形剂一起配制。

可以“治疗有效”量，即足以缓解和/或预防与疾病相关的至少一种症状、或提供受试者情况改善的量，施用包含编码本发明sirna分子的核酸序列的载体(例如，aav载体)。

在一个实施方案中，载体(例如aav载体)可以以治疗有效量施用于cns，以改善亨廷顿氏舞蹈病(hd)受试者的功能和/或生存。作为非限制性实例，可以通过直接输注到纹状体中来施用载体。

在一个实施方案中，载体(例如aav载体)可以以sirna双链体或dsrna的治疗有效量施用至受试者(例如，通过鞘内施用至受试者的cns)，以靶向中型多棘神经元、皮质神经元和/或星形胶质细胞。作为非限制性实例，sirna双链体或dsrna可降低htt蛋白或mrna的表达。作为另一个非限制性实例，sirna双链体或dsrna可以抑制htt并降低htt介导的毒性。可以在几乎没有增强炎症的情况下，实现htt蛋白和/或mrna以及htt介导的毒性的降低。

在一个实施方案中，载体(例如aav载体)可以以治疗有效量施用于受试者(例如，受试者的cns)以减缓受试者的功能衰退(例如，使用已知的评价方法确定，如统一的亨廷顿氏舞蹈病评定量表(uhdrs))。作为非限制性实例，可通过实质内注射施用载体。

在一个实施方案中，载体(例如aav载体)可以以治疗有效量施用于小脑延髓池以转导中型多棘神经元、皮质神经元和/或星形胶质细胞。作为非限制性实例，可以鞘内施用载体。

在一个实施方案中，载体(例如aav载体)可以以治疗有效量鞘内输注来施用以转导中型多棘神经元、皮质神经元和/或星形胶质细胞。作为非限制性实例，载体可以鞘内施用。

在一个实施方案中，载体(例如aav载体)可以以治疗有效量施用于小脑延髓池以转导中型多棘神经元、皮质神经元和/或星形胶质细胞。作为非限制性实例，载体可以通过实质内注射施用。

在一个实施方案中，可以配制包含调节性多核苷酸的载体(例如aav载体)。作为非限制性实例，可以优化制剂的baricity和/或重量摩尔渗透压浓度以确保在中枢神经系统或中枢神经系统的区域或组成中最佳药物分布。

在一个实施方案中，包含调节性多核苷酸的载体(例如aav载体)可以通过单一途径施用递送给受试者。

在一个实施方案中，包含调节性多核苷酸的载体(例如aav载体)可以通过多位点途径施用递送给受试者。受试者可以在2、3、4、5或超过5个位点施用包含调节性多核苷酸的载体(例如，aav载体)。

在一个实施方案中，可以使用推注给受试者注射施用包含本文所述的调节性多核苷酸的载体(例如，aav载体)。

在一个实施方案中，受试者可以在分钟、小时或天的时间段内通过持续递送来施用包含本文所述调节性多核苷酸的载体(例如，aav载体)。输注速率可以根据受试者、分布、制剂或其它递送参数而改变。

在一个实施方案中，通过壳和尾状核输注来施用本文所述的载体(例如aav载体)。作为非限制性实例，双输注提供广泛的纹状体分布以及额叶和颞叶皮质分布。

在一个实施方案中，载体(例如aav载体)是通过单侧壳输注施用的aav-dj8。作为非限制性实例，施用的aav-dj8的分布类似于通过单侧壳输注递送的aav1的分布。

在一个实施方案中，本文所述的载体(例如aav载体)通过c1处的鞘内(it)输注施用。输注可以持续1、2、3、4、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或超过15小时。

在一个实施方案中，施用本文所述载体(例如，aav载体)的受试者选择、和/或剂量的有效性、施用途径和/或施用体积使用血管周围空间(pvs)的成像来评价，pvs也称为virchow-robin空间。pvs环绕小动脉和小静脉，因为它们穿透脑实质并充满脑脊液(csf)/组织间液。pvs在中脑、基底神经节和半卵圆中心中很常见。虽然不希望受理论束缚，但pvs可能在代谢物的正常清除中发挥作用，并且与更严重的认知和包括帕金森病在内的几种疾病状态相关。pvs通常尺寸是正常的，但它们可以在一些疾病状态时尺寸上增加。potter等人(cerebrovascdis.2015jan；39(4)：224-231；其内容通过引用整体并入本文)开发了一种分级方法，其中他们研究了全范围的pvs和评定的基底神经节、半卵圆中心和中脑pvs。他们使用mac和lullich等人使用的pvs频率和范围(jneurolneurosurgpsychiatry.2004nov；75(11)：1519-23；其内容通过引用整体并入本文)，并且potter等人对基底神经节和半卵圆中心pvs给出5个评级：0(无)、1(1-10)、2(11-20)、3(21-40)和4(＞40)，以及对中脑pvs的2个评级：0(不可见)或1(可见)。potter等人的评级系统用户指南可以在以下找到：

www.sbirc.ed.ac.uk/documents/epvs-rating-scale-user-guide.pdf

剂量

使用有效降低、预防和/或治疗htt相关病症(例如，亨廷顿氏病(hd))的任何量将本发明的药物组合物施用至受试者。所需的确切量因受试者而异，取决于物种、年龄、受试者的一般状况、疾病的严重程度、特定成分、施用方式、活性方式等。

本发明的组合物通常配制成单位剂型，以便于施用和剂量均匀。然而，应该理解，本发明组合物的每日总用量可以在合理医学判断范围内由主治医师来决定。任何特定患者的特定治疗效果将取决于多种因素，包括所治疗的疾病和疾病的严重程度；所用特定化合物的活性；所用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用时间、施用途径和所用sirna双链体的排泄速率；治疗持续时间；组合使用的药物或与所用特定化合物同时使用的药物；以及医学领域中众所周知的相似因素。

在一个实施方案中，受试者的年龄和性别可用于确定本发明组合物的剂量。作为非限制性实例，与年轻受试者相比，年龄较大的受试者可接受更大剂量的组合物(例如，多5-10％、10-20％、15-30％、20-50％、25-50％或至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或超过90％)。作为另一个非限制性实例，与年龄较大的受试者相比，年轻的受试者可以接受更大剂量的组合物(例如，多5-10％、10-20％、15-30％、20-50％、25-50％或至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或超过90％)。作为另一个非限制性实例，与男性受试者相比，女性受试者可以接受更大剂量的组合物(例如，多5-10％、10-20％、15-30％、20-50％、25-50％或至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或超过90％)。作为另一个非限制性实例，与女性受试者相比，男性受试者可以接受更大剂量的组合物(例如，多5-10％、10-20％、15-30％、20-50％、25-50％或至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或超过90％)。

在一些具体实施方案中，可以根据疾病状况、受试者和治疗策略调整用于递送本发明sirna双链体的aav载体剂量。

在一个实施方案中，将根据本发明的组合物递送至细胞包括由[vg/小时＝ml/小时*vg/ml]定义的递送速率，其中vg是病毒基因组，vg/ml是组合物浓度，ml/小时是延长递送的速率。

在一个实施方案中，将根据本发明的组合物递送至细胞可以包括约1×10⁶vg至约1×10¹⁶vg的每受试者总浓度。在一些实施方案中，递送可包括约1x10⁶、2x10⁶、3x10⁶、4x10⁶、5x10⁶、6x10⁶、7x10⁶、8x10⁶、9x10⁶、1x10⁷、2x10⁷、3x10⁷、4x10⁷、5x10⁷、6x10⁷、7x10⁷、8x10⁷、9x10⁷、1x10⁸、2x10⁸、3x10⁸、4x10⁸、5x10⁸、6x10⁸、7x10⁸、8x10⁸、9x10⁸、1x10⁹、2x10⁹、3x10⁹、4x10⁹、5x10⁹、6x10⁹、7x10⁹、8x10⁹、9x10⁹、1x10¹⁰、2x10¹⁰、3x10¹⁰、4x10¹⁰、5x10¹⁰、6x10¹⁰、7x10¹⁰、8x10¹⁰、9x10¹⁰、1x10¹¹、1.1x10¹¹、1.2x10¹¹、1.3x10¹¹、1.4x10¹¹、1.5x10¹¹、1.6x10¹¹、1.7x10¹¹、1.8x10¹¹、1.9x10¹¹、2x10¹¹、2.1x10¹¹、2.2x10¹¹、2.3x10¹¹、2.4x10¹¹、2.5x10¹¹、2.6x10¹¹、2.7x10¹¹、2.8x10¹¹、2.9x10¹¹、3x10¹¹、4x10¹¹、5x10¹¹、6x10¹¹、7x10¹¹、7.1x10¹¹、7.2x10¹¹、7.3x10¹¹、7.4x10¹¹、7.5x10¹¹、7.6x10¹¹、7.7x10¹¹、7.8x10¹¹、7.9x10¹¹、8x10¹¹、9x10¹¹、1x10¹²、1.1x10¹²、1.2x10¹²、1.3x10¹²、1.4x10¹²、1.5x10¹²、1.6x10¹²、1.7x10¹²、1.8x10¹²、1.9x10¹²、2x10¹²、2.1x10¹²、2.2x10¹²、2.3x10¹²、2.4x10¹²、2.5x10¹²、2.6x10¹²、2.7x10¹²、2.8x10¹²、2.9x10¹²、3x10¹²、3.1x10¹²、3.2x10¹²、3.3x10¹²、3.4x10¹²、3.5x10¹²、3.6x10¹²、3.7x10¹²、3.8x10¹²、3.9x10¹²、4x10¹²、4.1x10¹²、4.2x10¹²、4.3x10¹²、4.4x10¹²、4.5x10¹²，4.6x10¹²、4.7x10¹²、4.8x10¹²、4.9x10¹²、5x10¹²、6x10¹²、6.1x10¹²、6.2x10¹²、6.3x10¹²、6.4x10¹²、6.5x10¹²、6.6x10¹²、6.7x10¹²、6.8x10¹²、6.9x10¹²、7x10¹²、8x10¹²、8.1x10¹²、8.2x10¹²、8.3x10¹²、8.4x10¹²、8.5x10¹²、8.6x10¹²、8.7x10¹²、8.8x10¹²、8.9x10¹²、9x10¹²、1x10¹³、1.1x10¹³、1.2x10¹³、1.3x10¹³、1.4x10¹³、1.5x10¹³、1.6x10¹³、1.7x10¹³、1.8x10¹³、1.9x10¹³、2x10¹³、3x10¹³、4x10¹³、5x10¹³、6x10¹³、6.7x10¹³、7x10¹³、8x10¹³、9x10¹³、1x10¹⁴、2x10¹⁴、3x10¹⁴、4x10¹⁴、5x10¹⁴、6x10¹⁴、7x10¹⁴、8x10¹⁴、9x10¹⁴、1x10¹⁵、2x10¹⁵、3x10¹⁵、4x10¹⁵、5x10¹⁵、6x10¹⁵、7x10¹⁵、8x10¹⁵、9x10¹⁵或1x10¹⁶vg/受试者的组合物浓度。

在一个实施方案中，将根据本发明的组合物递送至细胞可以包括约1×10⁶vg/kg至约1×10¹⁶vg/kg的每受试者总浓度。在一些实施方案中，递送可包括约1x10⁶、2x10⁶、3x10⁶、4x10⁶、5x10⁶、6x10⁶、7x10⁶、8x10⁶、9x10⁶、1x10⁷、2x10⁷、3x10⁷、4x10⁷、5x10⁷、6x10⁷、7x10⁷、8x10⁷、9x10⁷、1x10⁸、2x10⁸、3x10⁸、4x10⁸、5x10⁸、6x10⁸、7x10⁸、8x10⁸、9x10⁸、1x10⁹、2x10⁹、3x10⁹、4x10⁹、5x10⁹、6x10⁹、7x10⁹、8x10⁹、9x10⁹、1x10¹⁰、2x10¹⁰、3x10¹⁰、4x10¹⁰、5x10¹⁰、6x10¹⁰、7x10¹⁰、8x10¹⁰、9x10¹⁰、1x10¹¹、1.1x10¹¹、1.2x10¹¹、1.3x10¹¹、1.4x10¹¹、1.5x10¹¹、1.6x10¹¹、1.7x10¹¹、1.8x10¹¹、1.9x10¹¹、2x10¹¹、2.1x10¹¹、2.2x10¹¹、2.3x10¹¹、2.4x10¹¹、2.5x10¹¹、2.6x10¹¹、2.7x10¹¹、2.8x10¹¹、2.9x10¹¹、3x10¹¹、4x10¹¹、5x10¹¹、6x10¹¹、7x10¹¹、7.1x10¹¹、7.2x10¹¹、7.3x10¹¹、7.4x10¹¹、7.5x10¹¹、7.6x10¹¹、7.7x10¹¹、7.8x10¹¹、7.9x10¹¹、8x10¹¹、9x10¹¹、1x10¹²、1.1x10¹²、1.2x10¹²、1.3x10¹²、1.4x10¹²、1.5x10¹²、1.6x10¹²、1.7x10¹²、1.8x10¹²、1.9x10¹²、2x10¹²、2.1x10¹²、2.2x10¹²、2.3x10¹²、2.4x10¹²、2.5x10¹²、2.6x10¹²、2.7x10¹²、2.8x10¹²、2.9x10¹²、3x10¹²、3.1x10¹²、3.2x10¹²、3.3x10¹²、3.4x10¹²、3.5x10¹²、3.6x10¹²、3.7x10¹²、3.8x101²、3.9x10¹²、4x10¹²、4.1x10¹²、4.2x10¹²、4.3x10¹²、4.4x10¹²、4.5x10¹²，4.6x10¹²、4.7x10¹²、4.8x10¹²、4.9x10¹²、5x10¹²、6x10¹²、6.1x10¹²、6.2x10¹²、6.3x10¹²、6.4x10¹²、6.5x10¹²、6.6x10¹²、6.7x10¹²、6.8x10¹²、6.9x10¹²、7x10¹²、8x10¹²、8.1x10¹²、8.2x10¹²、8.3x10¹²、8.4x10¹²、8.5x10¹²、8.6x10¹²、8.7x10¹²、8.8x10¹²、8.9x10¹²、9x10¹²、1x10¹³、1.1x10¹³、1.2x10¹³、1.3x10¹³、1.4x10¹³、1.5x10¹³、1.6x10¹³、1.7x10¹³、1.8x10¹³、1.9x10¹³、2x10¹³、3x10¹³、4x10¹³、5x10¹³、6x10¹³、6.7x10¹³、7x10¹³、8x10¹³、9x10¹³、1x10¹⁴、2x10¹⁴、3x10¹⁴、4x10¹⁴、5x10¹⁴、6x10¹⁴、7x10¹⁴、8x10¹⁴、9x10¹⁴、1x10¹⁵、2x10¹⁵、3x10¹⁵、4x10¹⁵、5x10¹⁵、6x10¹⁵、7x10¹⁵、8x10¹⁵、9x10¹⁵或1x10¹⁶vg/kg的组合物浓度。

在一个实施方案中，每剂量可施用约10⁵至10⁶个病毒基因组(单位)。

在一个实施方案中，将根据本发明的组合物递送至细胞可以包括约1×10⁶vg/ml至约1×10¹⁶vg/ml的总浓度。在一些实施方案中，递送可包括约1x10⁶、2x10⁶、3x10⁶、4x10⁶、5x10⁶、6x10⁶、7x10⁶、8x10⁶、9x10⁶、1x10⁷、2x10⁷、3x10⁷、4x10⁷、5x10⁷、6x10⁷、7x10⁷、8x10⁷、9x10⁷、1x10⁸、2x10⁸、3x10⁸、4x10⁸、5x10⁸、6x10⁸、7x10⁸、8x10⁸、9x10⁸、1x10⁹、2x10⁹、3x10⁹、4x10⁹、5x10⁹、6x10⁹、7x10⁹、8x10⁹、9x10⁹、1x10¹⁰、2x10¹⁰、3x10¹⁰、4x10¹⁰、5x10¹⁰、6x10¹⁰、7x10¹⁰、8x10¹⁰、9x10¹⁰、1x10¹¹、1.1x10¹¹、1.2x10¹¹、1.3x10¹¹、1.4x10¹¹、1.5x10¹¹、1.6x10¹¹、1.7x10¹¹、1.8x10¹¹、1.9x10¹¹、2x10¹¹、3x10¹¹、4x10¹¹、5x10¹¹、6x10¹¹、7x10¹¹、8x10¹¹、9x10¹¹、1x10¹²、1.1x10¹²、1.2x10¹²、1.3x10¹²、1.4x10¹²、1.5x10¹²、1.6x10¹²、1.7x10¹²、1.8x10¹²、1.9x10¹²、2x10¹²、2.1x10¹²、2.2x10¹²、2.3x10¹²、2.4x10¹²、2.5x10¹²、2.6x10¹²、2.7x10¹²、2.8x10¹²、2.9x10¹²、3x10¹²、3.1x10¹²、3.2x10¹²、3.3x10¹²、3.4x10¹²、3.5x10¹²、3.6x10¹²、3.7x10¹²、3.8x10¹²、3.9x10¹²、4x10¹²、4.1x10¹²、4.2x10¹²、4.3x10¹²、4.4x10¹²、4.5x10¹²、4.6x10¹²、4.7x10¹²、4.8x10¹²、4.9x10¹²、5x10¹²、6x10¹²、6.1x10¹²、6.2x10¹²、6.3x10¹²、6.4x10¹²、6.5x10¹²、6.6x10¹²、6.7x10¹²、6.8x10¹²、6.9x10¹²、7x10¹²、8x10¹²、9x10¹²、1x10¹³、1.1x10¹³、1.2x10¹³、1.3x10¹³、1.4x10¹³、1.5x10¹³、1.6x10¹³、1.7x10¹³、1.8x10¹³、1.9x10¹³、2x10¹³、3x10¹³、4x10¹³、5x10¹³、6x10¹³、6.7x10¹³、7x10¹³、8x10¹³、9x10¹³、1x10¹⁴、2x10¹⁴、3x10¹⁴、4x10¹⁴、5x10¹⁴、6x10¹⁴、7x10¹⁴、8x10¹⁴、9x10¹⁴、1x10¹⁵、2x10¹⁵、3x10¹⁵、4x10¹⁵、5x10¹⁵、6x10¹⁵、7x10¹⁵、8x10¹⁵、9x10¹⁵或1x10¹⁶vg/ml的组合物浓度。

在某些实施方案中，可以使用多个施用来递送期望的sirna双链体剂量(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个或更多个施用)。当采用多个施用时，可以使用本文所述的分开给药方案。如本文所用，“分开剂量”是将单个单位剂量或总日剂量分成两个或更多个剂量，例如单个单位剂量的两个或更多个施用。如本文所用，“单一单位剂量”是以一剂/一次/单一途径/单一接触点(即单次施用事件)施用的任何调节性多核苷酸治疗剂的剂量。如本文所用，“总日剂量”是在24小时内给出或规定的量。它可以作为单一单位剂量施用。在一个实施方案中，将包含本发明调节性多核苷酸的病毒载体以分开剂量施用至受试者。它们可以仅配制在缓冲剂中或本文所述的制剂中。

在一个实施方案中，可以根据施用后尾状核或壳相对于皮质和皮质下分布的贡献，来调节本文所述组合物的剂量、浓度和/或体积。施用可以是室内、壳内、丘脑内、实质内、软膜下和/或鞘内施用。

在一个实施方案中，室内、壳内、丘脑内、实质内、软膜下和/或鞘内递送施用后，可以根据皮质和轴索分布，来调节本文所述组合物的剂量、浓度和/或体积。

iv.本发明组合物的方法和用途

亨廷顿氏舞蹈病的治疗方法

本发明提供了用于将包含编码本发明sirna分子的核酸序列的载体(例如aav载体)引入细胞的方法，该方法包括以足以使得靶标httmrna发生降解的量向所述细胞中引入任何载体，从而激活细胞中的靶标特异性rnai。在一些方面，细胞可以是干细胞、神经元如中型多棘或皮质神经元、肌细胞和神经胶质细胞如星形胶质细胞。

本发明公开了在有治疗需求的受试者中治疗与htt蛋白相关的亨廷顿氏舞蹈病(hd)的方法。方法任选地包括向受试者施用治疗有效量的至少包含载体(例如aav载体)的组合物，所述载体包含编码本发明sirna分子的核酸序列。作为非限制性实例，sirna分子可沉默htt基因表达、抑制htt蛋白生产、并减少受试者中hd的一种或多种症状从而治疗hd。

在一些实施方案中，将包含载体(例如aav载体)的组合物施用至受试者的中枢神经系统，所述载体包含编码本发明sirna分子的核酸序列。在其它实施方案中，将包含载体(例如aav载体)的组合物施用于受试者的组织(例如，受试者的脑)，所述载体包含编码本发明sirna分子的核酸序列。

在一个实施方案中，通过实质内注射，将包含载体(例如aav载体)的组合物施用至受试者的中枢神经系统，所述载体包含编码本发明sirna分子的核酸序列。

在一个实施方案中，通过实质内注射和鞘内注射，将包含载体(例如aav载体)的组合物施用至受试者的中枢神经系统，所述载体包含编码本发明sirna分子的核酸序列。

在一个实施方案中，通过实质内注射和室内注射，将包含载体(例如aav载体)的组合物施用至受试者的中枢神经系统，所述载体包含编码本发明sirna分子的核酸序列。

在一个实施方案中，包含编码本发明sirna分子的核酸序列的载体(例如aav载体)可以被递送到特定类型的靶标细胞，包括但不限于神经元，包括中型多棘或皮质神经元；胶质细胞，包括少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞；和/或神经元周围的其它细胞如t细胞。

在一个实施方案中，包含编码本发明sirna分子的核酸序列的载体(例如aav载体)可以被递送至纹状体中的神经元和/或皮层神经元中。

在一些实施方案中，包含编码本发明sirna分子核酸序列的载体(例如aav载体)可用作hd的疗法。

在一些实施方案中，包含编码本发明sirna分子的核酸序列的载体(例如aav载体)可用于压制纹状体和/或皮质中神经元和/或星形胶质细胞中的htt蛋白。作为非限制性实例，压制htt蛋白是在纹状体的中型多棘神经元和/或皮质神经元中。

在一些实施方案中，包含编码本发明sirna分子的核酸序列的载体(例如aav载体)可用于压制纹状体和/或皮质中神经元和/或星形胶质细胞中的htt蛋白，并降低相关的神经元毒性。压制纹状体和/或皮质的神经元和/或星形胶质细胞中的htt蛋白可以独立地降低5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或超过95％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、5-35％、5-40％、5-45％、5-50％、5-55％、5-60％、5-65％、5-70％、5-75％、5-80％、5-85％、5-90％、5-95％、10-20％、10-25％、10-30％、10-35％、10-40％、10-45％、10-50％、10-55％、10-60％、10-65％、10-70％、10-75％、10-80％、10-85％、10-90％、10-95％、15-25％、15-30％、15-35％、15-40％、15-45％、15-50％、15-55％、15-60％、15-65％、15-70％、15-75％、15-80％、15-85％、15-90％、15-95％、20-30％、20-35％、20-40％、20-45％、20-50％、20-55％、20-60％、20-65％、20-70％、20-75％、20-80％、20-85％、20-90％、20-95％、25-35％、25-40％、25-45％、25-50％、25-55％、25-60％、25-65％、25-70％、25-75％、25-80％、25-85％、25-90％、25-95％、30-40％、30-45％、30-50％、30-55％、30-60％、30-65％、30-70％、30-75％、30-80％、30-85％、30-90％、30-95％、35-45％、35-50％、35-55％、35-60％、35-65％、35-70％、35-75％、35-80％、35-85％、35-90％、35-95％、40-50％、40-55％、40-60％、40-65％、40-70％、40-75％、40-80％、40-85％、40-90％、40-95％、45-55％、45-60％、45-65％、45-70％、45-75％、45-80％、45-85％、45-90％、45-95％、50-60％、50-65％、50-70％、50-75％、50-80％、50-85％、50-90％、50-95％、55-65％、55-70％、55-75％、55-80％、55-85％、55-90％、55-95％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、75-85％、75-90％、75-95％、80-90％、80-95％或90-95％。相关的神经元毒性降低5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或超过95％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、5-35％、5-40％、5-45％、5-50％、5-55％、5-60％、5-65％、5-70％、5-75％、5-80％、5-85％、5-90％、5-95％、10-20％、10-25％、10-30％、10-35％、10-40％、10-45％、10-50％、10-55％、10-60％、10-65％、10-70％、10-75％、10-80％、10-85％、10-90％、10-95％、15-25％、15-30％、15-35％、15-40％、15-45％、15-50％、15-55％、15-60％、15-65％、15-70％、15-75％、15-80％、15-85％、15-90％、15-95％、20-30％、20-35％、20-40％、20-45％、20-50％、20-55％、20-60％、20-65％、20-70％、20-75％、20-80％、20-85％、20-90％、20-95％、25-35％、25-40％、25-45％、25-50％、25-55％、25-60％、25-65％、25-70％、25-75％、25-80％、25-85％、25-90％、25-95％、30-40％、30-45％、30-50％、30-55％、30-60％、30-65％、30-70％、30-75％、30-80％、30-85％、30-90％、30-95％、35-45％、35-50％、35-55％、35-60％、35-65％、35-70％、35-75％、35-80％、35-85％、35-90％、35-95％、40-50％、40-55％、40-60％、40-65％、40-70％、40-75％、40-80％、40-85％、40-90％、40-95％、45-55％、45-60％、45-65％、45-70％、45-75％、45-80％、45-85％、45-90％、45-95％、50-60％、50-65％、50-70％、50-75％、50-80％、50-85％、50-90％、50-95％、55-65％、55-70％、55-75％、55-80％、55-85％、55-90％、55-95％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、75-85％、75-90％、75-95％、80-90％、80-95％或90-95％。

在一个实施方案中，包含编码本发明sirna分子的核酸序列的载体(例如aav载体)可用于降低hd受试者的认知和/或运动衰退，其中由标准评价系统确定衰退量，如但不限于统一的亨廷顿氏舞蹈病评定量表(uhdrs)、子分数、以及认知测试。

在一个实施方案中，包含编码本发明sirna分子的核酸序列的载体(例如aav载体)可用于降低功能能力和日常生活活动的衰退，如通过标准评价系统所测量的，例如但不限于总功能能力(tfc)量表。

在一些实施方案中，作为用于治疗hd的单独治疗剂或组合治疗剂来施用本组合物。

编码靶向htt基因的sirna双链体的载体(例如aav载体)可以与一种或多种其它治疗剂组合使用。“与......组合”并不意味着试剂必须同时施用和/或一起配制用于递送，尽管这些递送方法落入本公开的范围内。组合物可以与一种或多种其它所需治疗剂或医疗程序同时、之前或之后施用。通常，将以针对该药剂确定的剂量和/或按时间表施用每种试剂。

可以与编码本发明sirna分子的核酸序列的载体(例如aav载体)组合使用的治疗剂，可以是小分子化合物，其是抗氧化剂、抗炎剂、抗凋亡剂、钙调节剂、抗谷氨酸能试剂、结构蛋白抑制剂、参与肌肉功能的化合物、以及参与金属离子调节的化合物。

可以与本文所述载体组合使用的用于治疗hd的测试化合物包括但不限于多巴胺消耗剂(例如，用于舞蹈病的丁苯那嗪)、苯并二氮杂卓(例如，用于肌阵挛、舞蹈病、肌张力障碍、僵直和/或痉挛状态的氯硝西泮)、抗惊厥药(例如，用于肌阵挛的丙戊酸钠和左乙拉西坦)、多巴胺的氨基酸前体(例如，用于僵直的左旋多巴，上述僵直尤其与青少年hd或年轻成人发病的帕金森病表型相关)、骨骼肌松弛剂(例如，用于僵直和/或痉挛状态的巴氯芬、替扎尼定)、用于乙酰胆碱在神经肌肉接头处释放以引起肌肉麻痹的抑制剂(例如，用于磨牙症和/或肌张力障碍的肉毒杆菌毒素)、非典型神经松弛剂(例如，用于精神病和/或烦躁的奥氮平和喹硫平；利培酮、舒必利、和用于精神病、舞蹈病和/或烦躁的氟哌啶醇；用于治疗耐受性精神病的氯氮平；用于伴有明显阴性症状的精神病的阿立哌唑)、增加atp/细胞能的药物(例如，肌酸)、选择性血清素再摄取抑制剂(ssri)(例如，用于抑郁症、焦虑症、强迫性行为和/或烦躁的西酞普兰、氟西汀、帕罗西汀、舍曲林、米氮平、文拉法辛)、催眠药(例如，改变睡眠-觉醒周期的佐匹克隆和/或唑吡坦)、抗惊厥药(例如，用于躁狂或轻度躁狂的丙戊酸钠和卡马西平)和情绪稳定剂(例如，用于躁狂或轻度躁狂的锂)。

神经营养因子可以与编码本发明sirna分子的核酸序列的载体(例如aav载体)组合使用来用于治疗hd。通常，神经营养因子被定义为促进神经元的生存、生长、分化、增殖和/或成熟，或刺激神经元活性增加的物质。在一些实施方案中，本方法还包括将一种或多种营养因子递送到有治疗需求的受试者中。营养因子可包括但不限于igf-i、gdnf、bdnf、ctnf、vegf、colivelin、扎利罗登(xaliproden)、促甲状腺激素释放激素和adnf及其变体。

在一个方面，编码至少一个靶向htt基因的sirna双链体的核酸序列的载体(例如，aav载体)可以与表达神经营养因子的aav载体共同施用，例如aav-igf-i(参见例如vincent等人，neuromolecularmedicine，2004，6，79-85；其内容通过引用整体并入本文)和aav-gdnf(参见例如wang等人，jneurosci.，2002，22，6920-6928；其内容通过引用整体并入本文)。

在一些实施方案中，通过静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、实质内、软膜下、鞘内和/或室内，将用于治疗hd的本发明组合物施用至有需求的受试者，从而允许sirna分子或包含sirna分子的载体通过血脑屏障和血液脊髓屏障的一个或两个、或直接进入脑和/或脊髓。在一些方面，方法包括(使用例如输注泵和/或递送支架)直接向受试者的中枢神经系统(cns)施用(例如，实质内施用、软膜下施用、室内施用和/或鞘内施用)治疗有效量的组合物，所述组合物包含编码本发明sirna分子的核酸序列的载体(例如aav载体)。载体可用于沉默或压制htt基因表达和/或减少受试者中hd的一种或多种症状，使得治疗hd。

在一些实施方案中，用于治疗hd的本发明组合物通过实质内施用施用于有需求的受试者。

在某些方面，hd的症状包括行为困难和症状，例如但不限于冷漠或缺乏主动性、烦躁不安、烦躁、激动或焦虑、自我护理差、判断力差、僵硬、去抑制、抑郁、自杀意念欣快感、攻击性、妄想、强迫症、性欲亢进、幻觉、语言恶化、言语不清、吞咽困难、体重减轻、损害执行功能的认知功能障碍(例如，组织、计划、检查或调整替代方案以及延迟获得新运动技能)、不稳定步态和不自主运动(舞蹈病)。在其它方面，本发明的组合物应用于脑和脊髓中的一种或两种。在一个实施方案中，通过治疗本文所述的任何hd症状来延长受试者的生存。

在一个实施方案中，对受试者施用编码本发明sirna的载体(例如，aav载体)，可以降低受试者中的htt(例如，突变体和/或野生型htt)。在一个实施方案中，对受试者施用载体(例如aav载体)可以降低受试者中的野生型htt。在一个实施方案中，对受试者施用载体(例如aav载体)可以降低受试者中的突变体htt。在另一个实施方案中，对受试者施用载体(例如aav载体)可降低受试者中的突变体htt和野生型htt。在受试者中，例如但不限于cns、cns区或受试者cns的特定细胞中，突变体和/或野生型htt可以降低约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％、或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。作为非限制性实例，载体(例如，aav载体)可以在中型多棘神经元中将htt的表达降低至少50％。作为非限制性实例，载体(例如，aav载体)可以在中型多棘神经元中将htt的表达降低至少40％。作为非限制性实例，载体(例如，aav载体)可以在壳的中型多棘神经元中将htt的表达降低至少40％。作为非限制性实例，载体(例如，aav载体)可以在壳的中型多棘神经元中将htt的表达降低至少30％。作为非限制性实例，载体(例如，aav载体)可以在壳中将htt的表达降低至少30％。作为另一个非限制性实例，载体(例如aav载体)可以在壳和皮质中使htt的表达降低至少40％。作为另一个非限制性实例，载体(例如aav载体)可以在壳和皮质中使htt的表达降低至少30％。作为另一个非限制性实例，载体(例如aav载体)可在壳中使htt的表达降低至少30％并且在皮质中降低至少15％。

在一个实施方案中，对受试者施用载体(例如aav载体)将降低受试者中htt的表达，并且降低htt的表达将降低受试者中hd的作用。

在一个实施方案中，载体(例如aav载体)可以施用于已经历生物标志物评价的受试者。血液中用于hd显现前(premanifest)和早期进展的潜在生物标志物包括但不限于8-ohdg氧化应激标志物、代谢标志物(例如，肌酸激酶、支链氨基酸)、胆固醇代谢物(例如，24-oh胆固醇)、免疫和炎症蛋白(例如，簇蛋白、补体组分、白细胞介素6和8)、基因表达变化(例如，转录组标志物)、内分泌标志物(例如，皮质醇、胃饥饿素和瘦蛋白)、bdnf、腺苷2a受体。用于hd显现前和早期进展的脑成像的潜在生物标志物包括但不限于纹状体体积、皮质下白质体积、皮质厚度、全脑和室容积、功能性成像(例如，功能性mri)、pet(例如，用氟脱氧葡萄糖)和磁共振光谱法(例如，乳酸盐)。用于hd的显现前和早期进展的定量临床工具的潜在生物标志物包括但不限于定量运动评价、运动生理评价(例如，经颅磁刺激)和定量眼运动测量。定量临床生物标志物评价的非限制性实例包括舌力变异性、节拍器-引导的拍击、握力、眼运动评价和认知测试。多中心观察研究的非限制性实例包括predict-hd和track-hd。受试者可具有hd的症状，被诊断为hd或hd可能无症状。

在一个实施方案中，载体(例如aav载体)可以施用于已经使用神经成像进行生物标志物评价的受试者。受试者可具有hd的症状，被诊断为hd或hd可能无症状。

在一个实施方案中，载体(例如aav载体)可以施用于hd无症状的受试者。受试者可能是无症状的，但可能已经历预测性基因检测或生物标志物评价，以确定他们是否有hd风险和/或受试者可能有已被诊断患有hd的家庭成员(例如，母亲、父亲、兄弟、姐妹、姑姨、叔舅、祖父母)。

在一个实施方案中，载体(例如aav载体)可以施用于处于hd早期阶段的受试者。在早期阶段，在协调、一些不自主运动(舞蹈病)、情绪变化如烦躁和抑郁、解决问题困难、人们在正常日常生活中运作能力降低方面，受试者存在微妙的变化。

在一个实施方案中，载体(例如aav载体)可以施用于处于hd中期的受试者。在中期，受试者的运动障碍增加、言语减少、吞咽困难并且普通活动将变得更难。在这个阶段，受试者可能有职业和物理治疗师帮助维持对自主运动的控制，并且受试者可能有语言病理学家。

在一个实施方案中，载体(例如aav载体)可以施用于处于hd晚期的受试者。在晚期阶段，hd受试者几乎完全或完全依赖他人进行护理，因为受试者不再能走路而且无法说话。受试者通常仍能理解语言，并且知道家人和朋友，但是窒息是主要关注的问题。

在一个实施方案中，载体(例如aav载体)可以用于治疗具有青少年形式hd的受试者，其hd发作在20岁之前，甚至早至2岁。

在一个实施方案中，载体(例如aav载体)可以用于治疗具有完全外显性(penetrance)hd的hd受试者，其中htt基因具有41或更多个cag重复(例如，41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90或超过90个cag重复)。

一个实施方案中，载体(例如aav载体)可用于治疗具有不完全外显性的hd受试者，其中htt基因具有36至40个cag重复(例如，36、37、38、39和40个cag重复)。

在一个实施方案中，载体(例如aav载体)可用于降低受试者中的htt蛋白。可以独立地降低5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或超过95％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、5-35％、5-40％、5-45％、5-50％、5-55％、5-60％、5-65％、5-70％、5-75％、5-80％、5-85％、5-90％、5-95％、10-20％、10-25％、10-30％、10-35％、10-40％、10-45％、10-50％、10-55％、10-60％、10-65％、10-70％、10-75％、10-80％、10-85％、10-90％、10-95％、15-25％、15-30％、15-35％、15-40％、15-45％、15-50％、15-55％、15-60％、15-65％、15-70％、15-75％、15-80％、15-85％、15-90％、15-95％、20-30％、20-35％、20-40％、20-45％、20-50％、20-55％、20-60％、20-65％、20-70％、20-75％、20-80％、20-85％、20-90％、20-95％、25-35％、25-40％、25-45％、25-50％、25-55％、25-60％、25-65％、25-70％、25-75％、25-80％、25-85％、25-90％、25-95％、30-40％、30-45％、30-50％、30-55％、30-60％、30-65％、30-70％、30-75％、30-80％、30-85％、30-90％、30-95％、35-45％、35-50％、35-55％、35-60％、35-65％、35-70％、35-75％、35-80％、35-85％、35-90％、35-95％、40-50％、40-55％、40-60％、40-65％、40-70％、40-75％、40-80％、40-85％、40-90％、40-95％、45-55％、45-60％、45-65％、45-70％、45-75％、45-80％、45-85％、45-90％、45-95％、50-60％、50-65％、50-70％、50-75％、50-80％、50-85％、50-90％、50-95％、55-65％、55-70％、55-75％、55-80％、55-85％、55-90％、55-95％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、75-85％、75-90％、75-95％、80-90％、80-95％或90-95％。作为非限制性实例，受试者可以具有50％的htt蛋白降低。作为非限制性实例，受试者可以具有70％的htt蛋白降低和10％的野生型htt蛋白降低。作为非限制性实例，壳的中型多棘神经元中htt的降低可为约40％。作为非限制性实例，壳和皮质中htt的降低可为约40％。作为非限制性实例，壳中htt的降低为约30％，皮质中为约15％。作为非限制性实例，壳和皮质中htt的降低可为约40％。作为非限制性实例，壳的中型多棘神经元中htt的降低可在40％-70％之间。作为非限制性实例，壳和皮质中htt的降低可在40％-70％之间。

在一个实施方案中，载体(例如aav载体)可用于降低受试者中的野生型htt蛋白。可以独立地降低5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或超过95％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、5-35％、5-40％、5-45％、5-50％、5-55％、5-60％、5-65％、5-70％、5-75％、5-80％、5-85％、5-90％、5-95％、10-20％、10-25％、10-30％、10-35％、10-40％、10-45％、10-50％、10-55％、10-60％、10-65％、10-70％、10-75％、10-80％、10-85％、10-90％、10-95％、15-25％、15-30％、15-35％、15-40％、15-45％、15-50％、15-55％、15-60％、15-65％、15-70％、15-75％、15-80％、15-85％、15-90％、15-95％、20-30％、20-35％、20-40％、20-45％、20-50％、20-55％、20-60％、20-65％、20-70％、20-75％、20-80％、20-85％、20-90％、20-95％、25-35％、25-40％、25-45％、25-50％、25-55％、25-60％、25-65％、25-70％、25-75％、25-80％、25-85％、25-90％、25-95％、30-40％、30-45％、30-50％、30-55％、30-60％、30-65％、30-70％、30-75％、30-80％、30-85％、30-90％、30-95％、35-45％、35-50％、35-55％、35-60％、35-65％、35-70％、35-75％、35-80％、35-85％、35-90％、35-95％、40-50％、40-55％、40-60％、40-65％、40-70％、40-75％、40-80％、40-85％、40-90％、40-95％、45-55％、45-60％、45-65％、45-70％、45-75％、45-80％、45-85％、45-90％、45-95％、50-60％、50-65％、50-70％、50-75％、50-80％、50-85％、50-90％、50-95％、55-65％、55-70％、55-75％、55-80％、55-85％、55-90％、55-95％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、75-85％、75-90％、75-95％、80-90％、80-95％或90-95％。作为非限制性实例，受试者可以具有50％的野生型htt蛋白降低。作为非限制性实例，壳的中型多棘神经元中野生型htt的降低可为约40％。作为非限制性实例，壳的中型多棘神经元中野生型htt的降低可为约30％。作为非限制性实例，壳的中型多棘神经元中野生型htt的降低可为约20％。作为非限制性实例，壳的中型多棘神经元中野生型htt的降低可为约15％。作为非限制性实例，壳和皮质中野生型htt的降低可为约40％。作为非限制性实例，壳和皮质中野生型htt的降低可为约30％。作为非限制性实例，壳和皮质中野生型htt的降低可为约20％。作为非限制性实例，壳和皮质中野生型htt的降低可为约15％。作为非限制性实例，壳的中型多棘神经元中野生型htt的降低可在40％-70％之间。作为非限制性实例，壳的中型多棘神经元中野生型htt的降低可在30％-70％之间。作为非限制性实例，壳的中型多棘神经元中野生型htt的降低可在20％-70％之间。作为非限制性实例，壳的中型多棘神经元中野生型htt的降低可在15％-70％之间。作为非限制性实例，壳和皮质中野生型htt的降低可在40％-70％之间。作为非限制性实例，壳的中型多棘神经元中野生型htt的降低可在30％-70％之间。作为非限制性实例，壳的中型多棘神经元中野生型htt的降低可在20％-70％之间。作为非限制性实例，壳的中型多棘神经元中野生型htt的降低可在15％-70％之间。

在一个实施方案中，载体(例如aav载体)可用于降低受试者中的突变体htt蛋白。可以独立地降低5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或超过95％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、5-35％、5-40％、5-45％、5-50％、5-55％、5-60％、5-65％、5-70％、5-75％、5-80％、5-85％、5-90％、5-95％、10-20％、10-25％、10-30％、10-35％、10-40％、10-45％、10-50％、10-55％、10-60％、10-65％、10-70％、10-75％、10-80％、10-85％、10-90％、10-95％、15-25％、15-30％、15-35％、15-40％、15-45％、15-50％、15-55％、15-60％、15-65％、15-70％、15-75％、15-80％、15-85％、15-90％、15-95％、20-30％、20-35％、20-40％、20-45％、20-50％、20-55％、20-60％、20-65％、20-70％、20-75％、20-80％、20-85％、20-90％、20-95％、25-35％、25-40％、25-45％、25-50％、25-55％、25-60％、25-65％、25-70％、25-75％、25-80％、25-85％、25-90％、25-95％、30-40％、30-45％、30-50％、30-55％、30-60％、30-65％、30-70％、30-75％、30-80％、30-85％、30-90％、30-95％、35-45％、35-50％、35-55％、35-60％、35-65％、35-70％、35-75％、35-80％、35-85％、35-90％、35-95％、40-50％、40-55％、40-60％、40-65％、40-70％、40-75％、40-80％、40-85％、40-90％、40-95％、45-55％、45-60％、45-65％、45-70％、45-75％、45-80％、45-85％、45-90％、45-95％、50-60％、50-65％、50-70％、50-75％、50-80％、50-85％、50-90％、50-95％、55-65％、55-70％、55-75％、55-80％、55-85％、55-90％、55-95％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、75-85％、75-90％、75-95％、80-90％、80-95％或90-95％。作为非限制性实例，受试者可以具有50％的突变体htt蛋白降低。作为非限制性实例，壳的中型多棘神经元中突变体htt的降低可为约40％。作为非限制性实例，壳的中型多棘神经元中突变体htt的降低可为约30％。作为非限制性实例，壳的中型多棘神经元中突变体htt的降低可为约20％。作为非限制性实例，壳的中型多棘神经元中突变体htt的降低可为约15％。作为非限制性实例，壳和皮质中突变体htt的降低可为约40％。作为非限制性实例，壳和皮质中突变体htt的降低可为约30％。作为非限制性实例，壳和皮质中突变体htt的降低可为约20％。作为非限制性实例，壳和皮质中突变体htt的降低可为约15％。作为非限制性实例，壳的中型多棘神经元中突变体htt的降低可在40％-70％之间。作为非限制性实例，壳的中型多棘神经元中突变体htt的降低可在30％-70％之间。作为非限制性实例，壳的中型多棘神经元中突变体htt的降低可在20％-70％之间。作为非限制性实例，壳的中型多棘神经元中突变体htt的降低可在15％-70％之间。作为非限制性实例，壳和皮质中突变体htt的降低可在40％-70％之间。作为非限制性实例，壳的中型多棘神经元中突变体htt的降低可在30％-70％之间。作为非限制性实例，壳的中型多棘神经元中突变体htt的降低可在20％-70％之间。作为非限制性实例，壳的中型多棘神经元中突变体htt的降低可在15％-70％之间。

本发明的aav载体可在有治疗需求的受试者中用作治疗亨廷顿氏舞蹈病的方法。本领域已知的用于定义有治疗需求的受试者的任何方法均可用于鉴定所述受试者。受试者可能有亨廷顿氏舞蹈病的临床诊断或可能是症状前的。可以使用任何已知的用于诊断hd的方法，包括但不限于认知评价和/或神经学或神经精神病学检查、运动测试、感觉测试、精神病学评价、脑成像、家族史和/或基因测试。

在一个实施方案中，使用亨廷顿氏舞蹈病的预后指数或其衍生物来确定hd受试者的选择(longjd等人，movementdisorders，2017，32(2)，256-263，其内容通过引用整体并入本文)。该预后指数使用四种组分来预测运动诊断的概率：(1)来自统一亨廷顿氏舞蹈病评定量表(uhdrs)的总运动评分(tms)，(2)符号数字模式测试(sdmt)，(3)基线年龄和(4)胞嘧啶-腺嘌呤-鸟嘌呤(cag)扩增。

在一个实施方案中，用以下公式计算亨廷顿氏舞蹈病的预后指数：pihd＝51×tms+(-34)×sdmt+7×年龄×(cag-34)，其中pihd值越大表示诊断或症状发作的风险越大。

在另一个实施方案中，用以下归一化公式计算亨廷顿氏舞蹈病的预后指数，该公式给出了在50％的10年生存背景下待解释的标准偏差单位：pinhd＝(pihd-883)/1044，其中pinhd＜0表示10年生存大于50％，而pinhd＞0表示10年生存低于50％。

在一个实施方案中，预后指数可用于鉴定将在几年内发展出hd症状但尚未具有临床可诊断症状的受试者。此外，可以在无症状期间使用本发明的aav载体和组合物选择这些无症状患者并接受治疗。

v.定义

除非另有说明，否则下列术语和短语具有下述含义。定义本质上不是限制性的，并且用于提供对本发明某些方面的更清楚的理解。

如本文所用，术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”是指由多脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-d-核糖)或多核糖核苷酸(含有d-核糖)或任何其它类型的多核苷酸组成的任何核酸聚合物，其中所述其它类型的多核苷酸是嘌呤或嘧啶碱基或修饰的嘌呤或嘧啶碱基的n糖苷。术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”之间在长度上没有预期的区别，并且这些术语可互换使用。这些术语仅指分子的一级结构。因此，这些术语包括双链和单链dna，以及双链和单链rna。

如本文所用，术语“rna”或“rna分子”或“核糖核酸分子”是指核糖核苷酸的聚合物；术语“dna”或“dna分子”或“脱氧核糖核酸分子”是指脱氧核糖核苷酸的聚合物。可以例如分别通过dna复制和dna转录自然合成；或者化学合成dna和rna。dna和rna可以是单链的(即，分别是ssrna或ssdna)或多链的(例如双链，即分别是dsrna和dsdna)。如本文所用，术语“mrna”或“信使rna”是指编码一个或多个多肽链的氨基酸序列的单链rna。

如本文所用，术语“rna干扰”或“rnai”是指由rna分子介导的序列特异性调节机制，其导致相应蛋白编码基因的表达的抑制或干扰或“沉默”。已经在许多类型的生物中观察到rnai，包括植物、动物和真菌。rnai天然存在于细胞中以除去外源rna(例如，病毒rna)。通过从游离dsrna切割的片段进行天然rnai，所述游离dsrna将降解机制引导至其它类似的rna序列。rnai由rna诱导的沉默复合物(risc)所控制，并由细胞质中的短/小dsrna分子启动，其中它们与催化性risc成分argonaute相互作用。可以将dsrna分子外源导入细胞中。外源dsrna通过激活核糖核酸酶蛋白dicer启动rnai，dicer结合并切割dsrna以产生21-25个碱基对的双链片段，每个末端具有少数未配对突出碱基。这些短的双链片段称为小干扰rna(sirna)。

如本文所用，术语“短干扰rna”、“小干扰rna”或“sirna”是指包含约5-60个核苷酸(或核苷酸类似物)的rna分子(或rna类似物)，其能够指导或介导rnai。优选地，sirna分子包含约15-30个核苷酸或核苷酸类似物，例如约16-25个核苷酸(或核苷酸类似物)、约18-23个核苷酸(或核苷酸类似物)、约19-22个核苷酸(或核苷酸类似物)(例如，19、20、21或22个核苷酸或核苷酸类似物)、约19-25个核苷酸(或核苷酸类似物)、以及约19-24个核苷酸(或核苷酸类似物)。术语“短”sirna是指包含5-23个核苷酸的sirna，优选地21个核苷酸(或核苷酸类似物)，例如19、20、21或22个核苷酸。术语“长”sirna是指包含24-60个核苷酸的sirna，优选约24-25个核苷酸，例如23、24、25或26个核苷酸。在一些情况下，短sirna可包含少于19个核苷酸，例如16、17或18个核苷酸、或少至5个核苷酸，只要较短的sirna保留介导rnai的能力。同样地，在某些情况下，长sirna可包含超过26个核苷酸，例如27、28、29、30、35、40、45、50、55或甚至60个核苷酸，只要较长的sirna保留介导rna或缺失进一步加工(例如，酶促加工)成短sirnai的翻译抑制的能力。sirna可以是单链rna分子(ss-sirna)或包含正义链和反义链的双链rna分子(ds-sirna)，正义链和反义链杂交形成称为sirna双链体的双链体结构。

如本文所用，术语sirna分子的“反义链”或“第一链”或“引导链”是指与靶向沉默的基因mrna中约10-50个核苷酸的区段基本上互补的链，例如约15-30、16-25、18-23或19-22个核苷酸。反义链或第一链具有与所需靶标mrna序列充分互补的序列以指导靶标特异性沉默，例如互补性足以通过rnai机制或过程而触发所需靶标mrna的破坏。

如本文所用，术语sirna分子的“正义链”或“第二链”或“过客链”是指与反义链或第一链互补的链。sirna分子的反义和正义链杂交形成双链体结构。如本文所用，“sirna双链体”包括与靶向沉默的基因mrna中约10-50个核苷酸的区段具有足够互补性的sirna链，以及具有足够互补性以与另一条sirna链形成双链体的sirna链。

如本文所用，术语“互补”是指多核苷酸彼此形成碱基对的能力。通常由反平行多核苷酸链中核苷酸单元之间的氢键形成碱基对。互补多核苷酸链可以按照watson-crick方式(例如，a至t、a至u、c至g)、或以允许形成双链体的任何其它方式形成碱基对。如本领域技术人员所知，当使用rna而不是dna时，认为尿嘧啶而非胸腺嘧啶是与腺苷互补的碱基。然而，当在本发明的上下文中表示u时，除非另有说明，否则暗示了替代t的能力。完全互补性或100％互补性是指其中一条多核苷酸链的每个核苷酸单元均可与第二多核苷酸链的核苷酸单元形成氢键的情况。不完美的互补性是指其中两条链中一些但非全部核苷酸单元可以彼此形成氢键的情况。例如，对于两个20-mcr，如果每条链上只有两个碱基对可以彼此形成氢键，则多核苷酸链表现出10％的互补性。在相同的实例中，如果每条链上的18个碱基对可以彼此形成氢键，则多核苷酸链表现出90％的互补性。

如本文所用，术语“基本上互补”是指sirna具有足以结合所需靶标mrna的序列(例如反义链)，并触发靶标mrna的rna沉默。

如本文所用，“靶向”是指设计和选择核酸序列的过程，所述核酸序列将与靶标核酸杂交并诱导所需效果。

术语“基因表达”是指核酸序列经历成功转录并且在大多数情况下翻译以产生蛋白或肽的过程。为清楚起见，当提及“基因表达”的测量时，这应理解为意指测量可以是转录的核酸产物(例如rna或mrna)或翻译的氨基酸产物(例如多肽或肽)。测量rna、mrna、多肽和肽的量或水平的方法是本领域熟知的。

如本文所用，术语“突变”是指产生可以传递给后代的变体(也称为“突变体”)形式的任何基因结构改变。基因突变可能是由dna中单碱基的取代或基因或染色体较大部分的缺失、插入或重排引起的。

如本文所用，术语“载体”意指运输、转导或以其它方式充当异源分子(例如本发明的sirna分子)的运载体的任何分子或部分。“病毒载体”是指这样的载体，其包含编码或包含兴趣分子(例如，转基因、编码多肽或多-多肽或调节性核酸(例如小干扰rna(sirna))的多核苷酸)的一个或多个多核苷酸区。病毒载体通常用于将遗传物质递送到细胞中。病毒载体经常针对特定应用进行修饰。病毒载体的类型包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。

本文所用的术语“腺相关病毒”或“aav”或“aav载体”是指包含或源自腺相关载体组分并且适于感染哺乳动物细胞(优选人细胞)的任何载体。术语aav载体通常表示包含编码sirna双链体的核酸分子的aav型病毒颗粒或病毒粒子。aav载体可以源自各种血清型，包括血清型的组合(即“假型”aav)或来自各种基因组(例如，单链或自身互补)。另外，aav载体可以是复制缺陷和/或靶向的。

如本文所用，短语“抑制基因表达”意指引起基因表达产物量的降低。表达产物可以是从基因转录的rna分子(例如mrna)或从转录自基因的mrna翻译而得的多肽。通常，mrna水平的降低导致从其翻译的多肽水平降低。可以使用用于测量mrna或蛋白的标准技术来确定表达水平。

如本文所用，术语“体外”是指在人造环境中发生的事件，例如在试管或反应容器中、在细胞培养物中、在培养皿中等，而不是在生物体(例如，动物、植物或微生物)内。

如本文所用，术语“体内”是指在生物体(例如，动物、植物或微生物或细胞或其组织)内发生的事件。

如本文所用，术语“修饰的”是指本发明分子的状态或结构改变。可以以许多方式修饰分子，包括化学的、结构的和功能的。

如本文所用，术语“合成”是指由人工产生、制备和/或制造。多核苷酸或多肽或本发明其它分子的合成可以是化学的或酶促的。

如本文所用，术语“转染”是指将外源核酸引入细胞的方法。转染方法包括但不限于化学方法、物理处理和阳离子脂质或混合物。可以转染到细胞中的试剂列表很大，包括但不限于sirna、正义和/或反义序列、编码一个或多个基因并组织成表达质粒的dna、蛋白、蛋白片段等。

如本文所用，“脱靶”是指对任何一种或多种靶标、基因或细胞转录物的任何非预期效果。

如本文所用，短语“药学上可接受的”在本文中用于指，在合理医学判断范围内适用于接触人和动物组织而没有过多毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症的那些化合物、材料、组合物和/或剂型，与合理的利益/风险比相称。

如本文所用，术语剂的“有效量”是足以实现有益或期望结果，例如临床结果的量，并且因此“有效量”取决于其所处的应用背景。例如，在施用hd治疗剂的情况下，例如与不施用该治疗剂所得的反应相比，剂的有效量是足以实现本文所定义的hd治疗的量。

如本文所用，术语“治疗有效量”是指当施用于患有或易患感染、疾病、病症和/或病况的受试者时，足以治疗、改善症状，诊断、预防和/或延迟感染、疾病、病症和/或病况发作的待递送的剂(例如，核酸、药物、治疗剂、诊断剂、预防剂等)的量。

如本文所用，术语“受试者”或“患者”是指可以施用根据本发明的组合物的任何生物，例如用于实验、诊断、预防和/或治疗目的。典型的受试者包括动物(例如，哺乳动物例如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物(例如黑猩猩和其它猿和猴子物种)和人)和/或植物。

如本文所用，术语“预防”是指延迟或阻止病况或疾病的发作、发展或进展一段时间，包括周、月或年。

如本文所用，术语“治疗”是指应用一种或多种用于治愈或改善疾病的特定程序。在某些实施方案中，具体程序是一种或多种药剂的施用。在本发明的上下文中，具体程序是一种或多种sirna分子的施用。

如本文所用，术语“改善”是指减轻病症或疾病至少一种指标的严重程度。例如，在神经退化疾病的背景下，改善包括降低神经元损失。

如本文所用，术语“施用”是指向受试者提供药剂或组合物。

如本文所用，术语“神经退化”是指导致神经细胞死亡的病理状态。大量神经系统疾病与神经退化具有共同的病理状态。例如，阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿氏舞蹈病和肌萎缩侧索硬化症(als)都会引起慢性神经退化，其特点是在几年内的缓慢进行性神经细胞死亡，而急性神经退化的特点是由于缺血(例如中风或创伤，例如创伤性脑损伤)引起的、或由于脱髓鞘或由创伤所致轴突横断(例如由脊髓损伤或多发性硬化)引起的神经细胞死亡突然发作。在一些神经系统病症中，主要地，一类神经细胞是退行性的，例如早期hd中的中型多棘神经元退化。

vi.等同形式和范围

本领域技术人员不使用超过常规实验就将认识到或能够确定本文所述发明具体实施方案的许多等同形式。本发明的范围不旨在限于以上描述，而是如所附权利要求中所述。

在权利要求中，除非与上下文相反或另有明确说明，否则例如“一”、“一个”和“该”的冠词可以表示一个或超过一个。除非与上下文相反或另有明确说明，否则当一个、超过一个、或所有组成员存在于、参与、或关于给定产品或过程时，在一个或多个组成员之间包括“或”的权利要求或描述被认为是满足要求的。本发明包括这样的实施方案，其中恰好一个组成员存在于、参与、或关于给定的产品或过程。本发明包括这样的实施方案，其中超过一个或所有组成员存在于、参与、或关于给定产品或过程。

还应注意，术语“包含”旨在是开放的并且允许但不要求包括额外的元件或步骤。因此，当在本文中使用术语“包含”时，也包含和公开了术语“由...组成”。

在给出范围的情况下，包括端点。此外，应理解，除非另有说明或根据本领域普通技术人员的背景和理解所显而易见的，除非上下文另有明确规定，否则以范围形式所表示的值在本发明不同实施方案中可以指代所述范围内的任何特定值或子范围，至范围下限的1/10单位。

另外，应理解落入现有技术内的本发明的任何特定实施方案可以明确地从任何一个或多个权利要求中排除。由于这些实施方案被认为是本领域普通技术人员已知的，因此即使在此未明确阐述排除，也可排除它们。出于任何原因，无论是否和现有技术的存在有关，本发明组合物的任何具体实施方案(如任何抗生素、治疗或活性成分；任何生产方法；任何使用方法等)可以从任何一个或多个权利要求中排除。

应当理解，已经使用的词语是描述性词语，而不是限制性词语，并且可以在所附权利要求的范围内进行改变，而不脱离本发明更广泛方面的真实范围和精神。

尽管已经结合若干所述实施方案以一定的范围和某些特定性对本发明进行了描述，但是并不意图将本发明限制于任何这样的细节或实施方案或任何特定实施方案，而是应当将其解释为参考所附权利要求，以便根据现有技术提供对这些权利要求尽可能广泛的解释，并因此有效地包含本发明的预期范围。

vii.实施例

实施例1.构建体在hek293t和hela细胞中的活性

a.转染

aav-mirna表达载体转染至hek293t和hela细胞中。还评价mcherry处理的细胞和未处理的细胞。48小时后，确定相对httmrna表达。通过将httmrna水平对看家基因mrna水平进行归一化，获得相对httmrna表达；然后，如通过qrt-pcr确定的，这种归一化的httmrna水平是在mcherry处理的细胞和/或未处理的细胞中相对于归一化httmrna水平所表示的。结果显示于表12-14中。

表12.转染后在hek293t和hela细胞中的httmrna抑制，第i组

表13.转染后在hek293t和hela细胞中的httmrna抑制，第ii组

表14.转染后在hek293t和hela细胞中的httmrna抑制，第iii组

b.感染

将aav-mirna表达载体包装在aav2(称为aav2-mirna表达载体)中或将mcherry载体包装在aav2中，用于感染hek293t和hela细胞。也评价未处理的细胞。aav2颗粒用于以1e4或1e5vg/细胞的moi感染hek293t细胞，以1e5vg/细胞的moi感染hela细胞。

在aav-mirna表达载体感染后24小时，确定hela细胞中htt的相对表达。通过将httmrna水平归一化至看家基因mrna水平获得相对httmrna表达；然后如通过qrt-pcr确定的，这种归一化的httmrna水平是在mcherry-处理的细胞和/或未处理的细胞中相对于归一化httmrna水平所表示的。结果显示于表15-18中。以1e5vg/细胞的moi(表15-17)或1e4vg/细胞的moi(表18)感染hela细胞。

在aav-mirna表达载体感染后24小时，确定hek293t细胞中htt的相对表达。通过将httmrna水平归一化至看家基因mrna水平获得相对httmrna表达；然后如通过qrt-pcr确定的，这种归一化的httmrna水平是在mcherry-处理的细胞和/或未处理的细胞中相对于归一化httmrna水平所表示的。结果显示于表15、17和18中。以1e5vg/细胞的moi(表15和17)或1e4vg/细胞的moi(表18)感染hek293t细胞。

表15.aav2-mirna表达载体以1e5/细胞的moi感染后，hek293t和hela细胞中的httmrna抑制

表16.aav2-mirna表达载体以1e5/细胞的moi感染后，hela细胞中的httmrna抑制

表17.aav2-mirna表达载体以1e5/细胞的moi感染后，hek293t和hela细胞中的httmrna抑制

表18.aav2-mirna表达载体以1e4/细胞的moi感染后，hek293t和hela细胞中的httmrna抑制

在hek293t细胞中，以1e4vg/细胞的moi感染后24小时，voyhtmir-127.016提供0.3-0.4的相对httmrna水平；voyhtmir-127.218、voyhtmir-102.016、voyhtmir-109.016、voyhtmir-127.372以及voyhtmir-127.257提供0.41-0.5的相对httmrna水平；voyhtmir-104.016、voyhtmir-127.425、voyhtmir-104.425、voyhtmir-114.016以及voyhtmir-127.907提供0.51-0.6的相对httmrna水平；voyhtmir-116.016、voyhtmir-102.425、voyhtmir-102.907、voyhtmir-102.257、voyhtmir-104.907和voyhtmir-109.425提供0.61-0.7的相对httmrna水平；voyhtmir-104.218、voyhtmir-104.372和voyhtmir-109.218提供0.71-0.8的相对httmrna水平；voyhtmir-102.218、voyhtmir-114.372、voyhtmir-104.257、voyhtmir-109.907、voyhtmir-109.257和voyhtmir-102.372提供0.81-0.9的相对httmrna水平；voyhtmir-109.372和voyhtmir-116.218提供0.91的相对httmrna水平。

在hek293t细胞中，以1e5vg/细胞的moi感染后24小时，voyhtmir-127.579、voyhtmir-104.579.10、voyhtmir-104.579.3、voyhtmir-104.579.7、voyhtmir-104.579.9、voyhtmir-104.579.1和voyhtmir-104.579提供0.3-0.4的相对httmrna水平；voyhtmir-114.579、voyhtmir-102.579、voyhtmir-116.579和voyhtmir-127.894提供0.41-0.5的相对httmrna水平；voyhtmir-109.579、voyhtmir-109.894和voyhtmir-114.894提供0.51-0.6的相对httmrna水平；voyhtmir-102.894和voyhtmir-104.579.5提供0.61-0.7的相对httmrna水平；voyhtmir-114.219、voyhtmir-116.894、voyhtmir-109.219.n、voyhtmir-102.219.n和voyhtmir-104.894提供0.71-0.8的相对httmrna水平；voyhtmir-104.219.n提供0.81-0.9的相对httmrna水平；voyhtmir-127.219.n和voyhtmir-116.219.n提供0.91-0.95的相对httmrna水平。

在hela细胞中，以1e4vg/细胞的moi感染后24小时，voyhtmir-127.016提供0.3-0.4的相对httmrna水平；voyhtmir-127.218、voyhtmir-127.257和voyhtmir-127.372提供0.41-0.5的相对httmrna水平；voyhtmir-102.016、voyhtmir-127.425、voyhtmir-104.016、voyhtmir-127.907、voyhtmir-116.016和voyhtmir-109.016提供0.51-0.6的相对httmrna水平；voyhtmir-104.425、voyhtmir-114.016和voyhtmir-104.907提供0.61-0.7的相对httmrna水平；voyhtmir-102.907、voyhtmir-109.425、voyhtmir-104.257、voyhtmir-102.425、voyhtmir-102.257、voyhtmir-104.218、voyhtmir-104.372和voyhtmir-109.907提供0.71-0.8的相对httmrna水平；voyhtmir-109.218、voyhtmir-116.218、voyhtmir-114.372、voyhtmir-109.372、voyhtmir-102.218、voyhtmir-102.372和voyhtmir-102.214提供0.81-0.9的相对httmrna水平；voyhtmir-109.257、voyhtmir-114.214和voyhtmir-127.214提供0.91-1的相对httmrna水平。

在hela细胞中，以1e5vg/细胞的moi感染后24小时，voyhtmir-127.016、voyhtmir-104.579.3、voyhtmir-104.579.10、voyhtmir-127.218和voyhtmir-127.579提供0.3-0.4的相对httmrna水平；voyhtmir-127.257、voyhtmir-104.579.7、voyhtmir-127.372、voyhtmir-104.579、voyhtmir-104.579.9和voyhtmir-127.425提供0.41-0.5的相对httmrna水平；voyhtmir-104.579.1、voyhtmir-102.016、voyhtmir-127.907、voyhtmir-104.016、voyhtmir-116.016、voyhtmir-109.016和voyhtmir-127.894提供0.51-0.6的相对httmrna水平；voyhtmir-109.579、voyhtmir-114.579、voyhtmir-104.425、voyhtmir-114.016、voyhtmir-102.579和voyhtmir-116.579提供0.61-0.7的相对httmrna水平；voyhtmir-104.907、voyhtmir-102.894、voyhtmir-104.894、voyhtmir-109.894、voyhtmir-104.257、voyhtmir-102.907、voyhtmir-109.425、voyhtmir-116.894、voyhtmir-114.894、voyhtmir-104.579.5、voyhtmir-102.257、voyhtmir-104.218、voyhtmir-104.372、voyhtmir-102.219.n、voyhtmir-102.425、voyhtmir-109.907和voyhtmir-109.219.n提供0.71-0.8的相对httmrna水平；voyhtmir-116.218、voyhtmir-104.219.n、voyhtmir-116.219.n、voyhtmir-114.219、voyhtmir-109.218、voyhtmir-109.372、voyhtmir-114.372、voyhtmir-102.218、voyhtmir-102.372、voyhtmir-102.214、voyhtmir-109.257和voyhtmir-127.219.n提供0.81-0.9的相对httmrna水平；voyhtmir-114.214和voyhtmir-127.214提供0.91-1的相对httmrna水平。

实施例2.构建体在人正常原代星形胶质细胞、u251mg细胞、神经分化的sh-sy5y细胞和人hd成纤维细胞中的活性

将aav-mirna表达载体包装在aav2中，并感染人正常原代星形胶质细胞nha(lonza)(在agm^tm星形胶质细胞生长培养基中培养，lonzacat#cc-3186)、人星形胶质细胞系u251mg(sigmacat#09063001-1vl)(在含有2mmgluamax^tm补充物、1×mem非必需氨基酸溶液、10mmhepes和10％fbs、2ng/ml人fgf-2和5ug/ml人胰岛素的dmem/f-12中培养，所有试剂来自lifetechnologies)、神经分化的sh-sy5y细胞(sigmacat#94030304)(在含有2mmgluamax^tm补充剂、1×mem非必需氨基酸溶液、10mmhepes和10％fbs、2ng/ml人fgf-2和5ug/ml人胰岛素的dmem/f-12中培养，所有试剂来自lifetechnologies)和/或人hd原代成纤维细胞(coriellinstitutecat#gm21756)(在含有2mmgluamax^tm补充剂、1×mem非必需氨基酸溶液、10mmhepes和10％fbs、2ng/ml人fgf-2和5ug/ml人胰岛素的dmem/f-12中培养，所有试剂来自lifetechnologies)。还评价对照mcherry。对于nha，将成纤维细胞和u251mg细胞接种到96孔板(1-2e4细胞/孔，200ul细胞培养介质)中，并用包装在aav2中的aav-mirna表达载体或对照mcherry载体一式三份感染。将sh-sy5y细胞接种到96孔板(1e4细胞/孔，200ul细胞培养介质)中，所述板用0.1μg/ml聚-d-赖氨酸和15μg/ml层粘连蛋白双重包被，在分化介质中诱导神经元分化持续4天，然后用aav2-mirna表达载体进行一式三份感染。以1e5或1e6vg/细胞的moi用aav2-mirna表达载体进行感染。感染后24-48小时，收获细胞用于立即细胞裂解和qrt-pcr。

a.以1e5vg/细胞的moi感染后24小时的htt抑制

对于正常人原代星形胶质细胞、人星形胶质细胞系u251mg、sh-sy5y分化的神经元和人hd原代成纤维细胞，通过qrt-pcr确定，以1e5vg/细胞的moi感染后24小时httmrna的相对表达。如通过qrt-pcr确定的，通过将httmrna水平对看家基因mrna水平进行归一化，获得相对httmrna表达；然后，这种归一化的httmrna水平是在mcherry-处理的细胞中相对于归一化httmrna水平所表示的。结果显示于表19中。

表19.aav2-mirna表达载体以1e5vg/细胞的moi感染后24小时，正常人星形胶质细胞、u251mg细胞、神经分化的sh-sy5y细胞和人hd成纤维细胞中的httmrna抑制

在正常人原代星形胶质细胞中，以1e5vg/细胞的moi感染后24小时，voyhtmir-102.016和voyhtmir-127.016引起httmrna约30-40％的沉默。

在人星形胶质细胞系u251mg中，以1e5vg/细胞的moi感染后24小时，voyhtmir-127.579、voyhtmir-102.907、voyhtmir-102.257、voyhtmir-109.016、voyhtmir-109.218、voyhtmir-114.016、voyhtmir-127.425和voyhtmir-127.257引起约30-40％的沉默；voyhtmir-102.016、voyhtmir-127.372、voyhtmir-116.016和voyhtmir-127.907引起41-50％的沉默；voyhtmir-127.218引起51-60％的沉默；以及voyhtmir-127.016引起httmrna61-70％的沉默。

在sh-sy5y分化的神经元中，以1e5vg/细胞的moi感染后24小时，voyhtmir-109.579、voyhtmir-114.579、voyhtmir-127.894、voyhtmir-102.257、voyhtmir-104.016、voyhtmir-109.016、voyhtmir-109.218、voyhtmir-109.372、voyhtmir-109.425、voyhtmir-114.016、voyhtmir-127.372、voyhtmir-127.425和voyhtmir-127.907引起约30-40％的沉默；voyhtmir-127.579、voyhtmir-102.016、voyhtmir-116.016和voyhtmir-127.257引起约41-50％的沉默；以及voyhtmir-127.016和voyhtmir-127.218引起httmrna约51-60％的沉默。

在人hd成纤维细胞中，以1e5vg/细胞的moi感染后24小时，voyhtmir-116.894、voyht-mir-127.579、voyhtmir-127.016、voyhtmir-127.214、voyhtmir-127.218、voyhtmir-127.907和voyhtmir-127.257引起httmrna约30-40％的沉默。

b.以1e6vg/细胞的moi感染后24小时的htt抑制

以1e6的moi感染后24小时，对于人星形胶质细胞系u251mg和神经分化的sh-sy5y细胞，通过qrt-pcr确定httmrna的相对表达。如通过qrt-pcr确定的，通过将httmrna水平对看家基因mrna水平进行归一化，获得相对httmrna表达；然后，这种归一化的httmrna水平是在mcherry-处理的细胞中相对于归一化httmrna水平所表示的。结果显示于表20中。

表20.以1e6vg/细胞的moi感染后24小时，u251mg细胞和神经分化的sh-sy5y细胞中的httmrna抑制

在人星形胶质细胞系u251mg中，以1e6vg/细胞的moi感染后24小时，voyhtmir-104.579、voyhtmir-109.579、voyhtmir-114.579、voyhtmir-127.894、voyhtmir-102.425、voyhtmir-102.257、voyhtmir-104.218、voyhtmir-104.425、voyhtmir-104.907、voyhtmir-104.257、voyhtmir-109.218、voyhtmir-109.425、voyhtmir-109.907、voyhtmir-114.016和voyhtmir-114.372引起约30-40％的沉默；voyhtmir-102.907、voyhtmir-104.016、voyhtmir-127.425引起约41-50％的沉默；voyhtmir-127.579、voyhtmir-102.016、voyhtmir-109.016、voyhtmir-116.016、voyhtmir-127.372和voyhtmir-127.907引起约51-60％的沉默；以及voyhtmir-127.016、voyhtmir-127.218和voyhtmir-127.257引起httmrna约61-70％的沉默。

在神经分化的sh-sy5y细胞中，以1e6vg/细胞的moi感染后24小时，voyhtmir-102.219.n、voyhtmir-104.894、voyhtmir-109.219.n、voyhtmir-116.219.n、voyhtmir-116.894、voyhtmir-116.579、voyhtmir-114.219、voyhtmir-102.257、voyhtmir-104.218、voyhtmir-104.907、voyhtmir-109.218、voyhtmir-109.907、voyhtmir-109.257、voyhtmir-116.218引起约30-40％的沉默；voyhtmir-102.894、voyhtmir-102.579、voyhtmir-109.894、voyhtmir-109.579、voyhtmir-114.894、voyhtmir-104.425、voyhtmir-104.257、voyhtmir-109.016、voyhtmir-109.372、voyhtmir-109.425、voyhtmir-114.372、voyhtmir-127.425引起约41-50％的沉默；voyhtmir-104.579、voyhtmir-114.579、voyhtmir-127.894、voyhtmir-127.579、voyhtmir-102.016、voyhtmir-104.016、voyhtmir-114.016、voyhtmir-116.016、voyhtmir-127.372、voyhtmir-127.907引起约51-60％的沉默；以及voyhtmir-127.016、voyhtmir-127.218和voyhtmir-127.257引起httmrna约61-75％的沉默。

c.以1e5vg/细胞的moi感染后36小时的htt抑制

以1e5vg/细胞的moi感染后36小时，对于人星形胶质细胞系u251mg和神经分化的sh-sy5y细胞，通过qrt-pcr确定httmrna的相对表达。通过将httmrna对看家基因mrna进行归一化，确定相对httmrna表达，并进一步归一化至mcherry-处理的细胞；结果显示于表21中。

表21.以1e5vg/细胞的moi感染后36小时，u251mg细胞和神经分化的sh-sy5y细胞中的httmrna抑制

在人星形胶质细胞系u251mg中，以1e5vg/细胞的moi感染后36小时，voyhtmir-104.579.2引起约30-40％的沉默；voyhtmir-104.579.1和voyhtmir-104.579.9引起约51-60％的沉默；voyhtmir-104.579和voyhtmir-104.579.7引起约61-70％的沉默；以及voyhtmir-104.579.3和voyhtmir-104.579.10引起httmrna约71-80％的沉默。

在神经分化的sh-sy5y中，以1e5vg/细胞的moi感染后36小时，voyhtmir-104.579.5和voyhtmir-104.579.9引起约30-40％的沉默；voyhtmir-104.579.1和voyhtmir-104.579引起约41-50％的沉默；以及voyhtmir-104.579、voyhtmir-104.579.3和voyhtmir-104.579.10引起httmrna约51-65％的沉默。

d.以1e6vg/细胞的moi感染后36小时的htt抑制

以1e6vg/细胞的moi感染后36小时，对于神经分化的sh-sy5y细胞，通过qrt-pcr确定httmrna的相对表达。通过将httmrna对看家基因mrna进行归一化，确定相对httmrna表达，并进一步归一化至mcherry-处理的细胞；结果显示于表22中。

表22.以1e6的moi感染后36小时，神经分化的sh-sy5y细胞中的httmrna抑制

在神经分化的sh-sy5y细胞中，以1e6vg/细胞的moi感染后36小时，voyhtmir-104.579.5、voyhtmir-104.579.2、voyhtmir-104.579.9、voyhtmir-104.579引起约30-40％的沉默；voyhtmir-104.579.1引起约41-50％的沉默；以及voyhtmir-104.579.7、voyhtmir-104.579.3和voyhtmir-104.579.10引起httmrna约51-65％的沉默。

e.以1e6的moi感染后40小时的htt抑制

以1e6vg/细胞的moi感染后40小时，对于人星形胶质细胞系u251mg和神经分化的sh-sy5y细胞，通过qrt-pcr确定httmrna的相对表达。通过将httmrna对看家基因mrna进行归一化，确定相对httmrna表达，并进一步归一化至mcherry-处理的细胞；结果显示于表23中。

表23.以1e6vg/细胞的moi感染后40小时，u251mg细胞和神经分化的sh-sy5y细胞中的httmrna抑制

在人星形胶质细胞系u251mg中，以1e6vg/细胞的moi感染后40小时，voyhtmir-102.214、voyhtmir-104.016、voyhtmir-114.016、voyhtmir-127.372、voyhtmir-127.425和voyhtmir-127.257引起约30-40％的沉默；以及voyhtmir-127.016和voyhtmir-127.218引起httmrna约41-50％的沉默。

在神经分化的sh-sy5y细胞中，以1e6vg/细胞的moi感染后40小时，voyhtmir-104.579、voyhtmir-109.579、voyhtmir-114.579、voyhtmir-127.894、voyhtmir-102.214、voyhtmir-104.016、voyhtmir-104.907、voyhtmir-104.257、voyhtmir-114.016、voyhtmir-116.016、voyhtmir-127.218、voyhtmir-127.372、voyhtmir-127.425、voyhtmir-127.907和voyhtmir-127.257引起约30-40％的沉默；voyhtmir-127.579引起约41-50％的沉默；以及voyhtmir-127.016引起httmrna约51-60％的沉默。

实施例3.htt抑制的体内yac128小鼠研究，用哺乳动物细胞产生的aav-mirna载体处理后引导相对于过客的比率以及5′末端加工的精密度

基于用质粒转染和用aav包装的aav-mirna表达载体感染的htt体外抑制，将选择的aav-mirna表达载体包装在aav1中并在yac128小鼠中体内评价，以量化httmrna抑制，并通过深度测序评价引导相对于过客的比率以及5′末端加工的精密度。将aav-mirna转基因基因组包装在具有cba启动子的aav1(aav1.cba.ihtt)中，然后通过hek293或hek293t细胞的三重转染来生产载体，纯化并配制在含有0.001％f-68的磷酸盐缓冲盐水(pbs)中。在5μl中以约1e10至3e10vg的剂量，每个半球10分钟内，通过双侧纹状体内输注，将载体施用至7-12周龄的yac128小鼠中。对照组用载体(含0.001％f-68的pbs)处理。每组包括4只雌性和4只雄性。在测试物品施用后大约28天，收集纹状体组织打孔物(punches)并快速冷冻用于后续分析。

然后将纹状体组织样品匀浆化并纯化总rna。通过qrt-pcr确定htt的相对表达。用于归一化的看家基因包括小鼠xpnpep1(x-脯氨酰氨肽酶1)和小鼠hprt(次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶)。将httmrna归一化至看家基因的表达，然后进一步归一化至载体组。结果显示在表24和25中。

表24.纹状体内输注后，yac128小鼠纹状体中的httmrna抑制

表25.纹状体内输注后，yac128小鼠纹状体中的httmrna抑制

在yac128小鼠纹状体中，在纹状体内输注每纹状体1e10至3e10vg后约28天，voyhtmir-127.016、voyhtmir-127.257、voyhtmir-127.579、voyhtmir-104.579.3、voyhtmir-104.579.10、voyhtmir-104.016和voyhtmir-109.016引起httmrna约20-40％的沉默。

也通过深度测序评价纹状体组织样品的pri-mirna加工，以评价引导：过客比率、引导和过客链相对于mirna总内源池的丰度、以及引导链5′端的加工精密度。结果显示在表26中。

表26.在纹状体内输注后yac128小鼠纹状体样品的深度测序

实施例4.htt序列

如表3中所述，合成htt衍生寡核苷酸并形成双链体。然后，测试sirna双链体对内源htt基因表达的体外抑制活性。

实施例5.体外评价含有靶向htt的引导链和过客链的aav-mirna表达载体

基于预测的反义链对人htt基因的选择性，将表3中列出的httsirna双链体的一些引导链和过客链工程化为aav-mirna表达载体并转染到中枢神经系统、神经元细胞系或非神经元细胞系的细胞中。尽管在sirna敲低研究中使用的突出端是针对sirna的经典dtdt，但构建体中的突出端可包含任何二核苷酸突出端。

使用的细胞可以是原代细胞、细胞系或源自诱导多能干细胞(ips细胞)的细胞。

然后测量htt敲低并进行深度测序以定量从表达载体中施用的每个构建体处理所得的确切过客链和引导链。

计算引导相对于过客链的比率。

对引导链的5′-末端进行测序以确定切割的精密度，并确定由精确切割产生的预期引导链的百分比。

将aav-mirna表达载体包装在aav2中，然后用于感染中枢神经系统、神经元细胞系或非神经元细胞系的细胞，以分析htt的体外敲低。mcherry构建体或载体组用作阴性对照。

再次进行深度测序。

实施例6.含有靶向htt的引导序列和过客序列的pri-mirna盒

根据本发明，设计了包含pri-mirna盒和httsirna的构建体，并在表27中给出。过客和引导链在表格中描述，以及5′和3′侧翼区和环区(也称为接头区)。在表27中，序列名称的“mir”组成不一定对应于mirna基因的序列编号(例如，voyhtmir-102是序列的名称，并不一定意味着mir-102是序列的一部分)。

表27.含有过客和引导序列(5′-3′)的pri-mirna盒

实施例7.aav-mirna表达载体

将包含靶向htt的引导链和过客链的pri-mirna盒的构建体工程化为aav-mirna表达载体(ss或sc)。aav-mirna表达载体构建体从itr到itr(按5′至3′描述)包含突变体或野生型itr、启动子(cmv(其包括sv40内含子)、u6、h1、cba(包括cmvie增强子、cb启动子和sv40内含子))、含有靶向htt的引导序列和过客序列的pri-mirna盒(来自表3)、兔珠蛋白polya和野生型itr。进行体外和体内研究以评价aav-mirna表达载体的药理学活性。

实施例8.aav-mirna表达载体的体内研究

a.功效的体内研究

基于yac128小鼠中的htt抑制，引导相对于过客的比率和5′末端加工的精密度，将选择的aav-mirna表达载体包装在具有cba启动子的aav1(ss或sc)中(aav1.cba.ihtt)，在含有0.001％f-68的磷酸盐缓冲盐水(pbs)中配制，并施用至yac128小鼠以评价功效。通过每个半球持续10分钟，双侧纹状体内输注将aav1载体施用至7-12周龄的yac128小鼠，剂量为5ul中约1e10至3e10vg。对照组用载体(含0.001％f-68的pbs)处理。在测试品施用之后，以预定的时间间隔进行行为测试以评价功效，包括旋转法和porsolt游泳测试。在给药后的预定日，对动物实施安乐死，收集纹状体组织打孔物并快速冷冻。将组织样品匀浆化并纯化总rna。通过qrt-pcr确定htt的相对表达。用于归一化的看家基因包括小鼠xpnpep1。将htt相对于看家基因表达进行归一化，然后进一步归一化至载体组。样品也用于量化htt蛋白。

b.nhp中htt抑制、引导相对于过客的比率、以及5′末端加工的精密度的体内研究

基于yac128小鼠中的htt抑制，引导相对于过客的比率和5′末端加工的精密度，将选择的aav-mirna表达载体包装在具有cba启动子的aav1中(aav1.cba.ihtt)，在含有0.001％f-68的磷酸盐缓冲盐水(pbs)中配制，并通过脑实质内输注施用至非人灵长类动物。对照组用载体(含0.001％f-68的pbs)处理。在给药后的预定时间，在各种组织样品中确定httmrna的相对表达、引导相对于过客的比率和5′末端加工的精密度。

尽管已经结合若干所述实施方案以一定的范围和某些特定性，对本发明进行了描述，但是并不意图将本发明限制于任何这样的细节或实施方案或任何特定实施方案，而是应当将其解释为参考所附权利要求，以便根据现有技术提供对这些权利要求尽可能广泛的解释，并因此有效地包含本发明的预期范围。

本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都通过引用整体并入本文。如果发生冲突，以本说明书(包括定义)为准。另外，章节标题、材料、方法和实施例仅是说明性的，而非意图限制。