对人酪氨酰DNA磷酸二酯酶1有抑制作用的2-乙酰基-6-(2-(2-(4-溴亚苄基)肼基)噻唑-4-基)-3,7,9-三羟基-8,9b-二甲基二苯并[b,d]呋喃-1(9bh)-酮的制作方法

本发明涉及分子生物学、生物化学和生物技术领域，即结构式i的化合物，它是松萝酸的衍生物及其空间异构体：

其具有有效的生物活性，即抑制人酪氨酰dna磷酸二酯酶1(tdp1)作用的能力。

背景技术：

目前，有相当大的兴趣开发tdp1酶抑制剂，对于开发治疗肿瘤和神经退行性疾病的药物这被认为是一个有前景的目标酶[1]。

tdp1是一种磷酸二酯酶，是一类破坏磷酸二酯酶键的酶。tdp1在修复由拓扑异构酶1(top1)抑制剂喜树碱和其它抗肿瘤药物引起的dna损伤中起着重要作用。top1的正常酶循环包括可逆的酯交换反应。酶活性中心的酪氨酸-723残基与dna主干的3’-磷酸形成短暂的共价复合物，形成单链断裂，使断裂的链围绕完整的链旋转，放松dna螺旋的局部张力。然后通过反作用(结扎)恢复dna的完整性。在正常情况下，结扎反应的速度远大于断裂反应，但在某些情况下，过渡配合物保持稳定。特别是，临床上使用的top1抑制剂，如喜树碱及其衍生物，大大减缓了结扎反应[3]。无法恢复dna结构会导致单链断裂，随后会变成毒性更大的双链断裂。除抑制剂外，top1附着部位附近dna的某些损伤也能阻断结扎反应。

tdp1破坏了酪氨酸残基和dna3’-端之间的3’-二酯键，也去除了源自dna的3’-端的其他类型损伤[4,5]。同时，一个磷酸盐留在dna的3’端，而一个羟基残基留在5’端。这种结构是多核苷酸激酶3’-磷酸酶(pnkr)酶的底物，它恢复了传统的3’-oh,5’-磷酸结构，用于碱基切除修复(ber)[6]。因此，tdp1降低了top1抑制剂的疗效，后者在其他方面与抗癌药物相当有效(见文献[7,8])。理论上认为，tdp1与几种癌症的耐药性有关[3,9]。这一理论得到了几项研究的证实：具有tdp1基因敲除的小鼠和具有scan1突变的人类细胞系对喜树碱过敏[10-13]。另一方面，喜树碱和依托泊苷诱导细胞dna损伤较小，tdp1表达水平升高[14,15]。因此，对top1和tdp1起作用的混合药物可以显著提高化疗的疗效。

也已经知道，抑制tdp1活性会使肿瘤细胞对抗癌药物替莫唑胺(嘌呤甲基化)[16]、甲基甲磺酸盐(生成无嘌呤/无嘧啶位点)、博来霉素(单链/双链断裂带3’-磷酸二醇酯)、过氧化氢和电离辐射(链断裂和其他类型的损坏)[17]过敏。这表明tdp1参与了不同的dna修复途径。

因此，tdp1抑制剂可能在治疗上有助于选择性地增强抗肿瘤药物的活性。

文献[18-28]中描述的tdp1抑制剂相对较少。已知化合物的一个主要缺点是它们对tdp1的抑制能力相对较低(ic50的范围为0.2到100μmol)。

最类似于本发明(原型)的化合物是结构式ii的杂环双脒[20]。

这种化合物的一个缺点是它对tdp1的抑制能力低(单链dna的ic50约为100μmol)。

技术实现要素：

本发明的目的是开发一种更有效的基于松萝酸(usnicacid)的tdp1抑制剂。

松萝酸(iii)是一种独特的和可利用的地衣物种的代谢产物。

松萝酸的抗菌、杀菌和抗氧化特性是众所周知的，但也有关于松萝酸及其衍生物对修复酶parp1的活性的最新数据[28]。

所揭示的化合物是一种对tdp1(ic500.026±0.011μmol)具有高抑制效力的结构式(i)的松萝酸肼噻唑衍生物。

技术结果：增加对tdp1的抑制作用，增加这种酶的抑制剂数量。

本发明的化合物可根据图1所示的方案合成。

起始化合物是具有结构式(iii)的松萝酸，通过使用[29]中的方法从地衣混合物中提取出来。制备松萝酸的溴取代衍生物(化合物iv)和缩氨基硫脲v，用于制备目标化合物。用[30]中的方法，在氢溴酸存在下用溴对松萝酸(iii)进行溴化，得到化合物iv。用[31]中的方法，通过氨基硫脲(化合物vi)与对溴苯甲醛vii的相互作用，生成缩氨基硫脲v。将光谱数据与文献中的数据进行比较。最后，用柱层析法将化合物iv与缩氨基硫脲v相互作用，得到具有靶活性的化合物i。

更具体地说，化合物i的制备方法如下。

在第一阶段，松萝酸通过煮沸用氯仿提取风干的原料(地衣混合物)而产生，随后通过从氯仿:乙醇混合物(1:10)中再结晶以黄色晶体形式提取纯松萝酸。在室温下，在黑暗中7天内，在几滴氢溴酸存在下，用溴和二恶烷(2mmol溴溶于14毫升二恶烷中)的复合物对得到的松萝酸(iii)进行溴化。在旋转蒸发器中浓缩反应混合物并进行柱色谱后，得到由溴取代的松萝酸衍生物(iv)。然后将对溴苯甲醛vii的醇溶液缓慢滴加到氨基硫脲(化合物vi)的水溶液中，合成对溴苯甲醛缩氨基硫脲v。所得沉淀用水洗涤、过滤并在空气中干燥，随后不经纯化而使用。化合物i的合成是将化合物iv和对溴苯甲醛缩氨基硫脲v在乙醇中等摩尔量煮沸1小时，经柱层析纯化后得到产物i，收率66％。

通过核磁共振光谱和质谱来证实所得化合物i的结构和纯度。

结构式(i)的化合物是松萝酸的肼噻唑类衍生物。

经过详细的药理研究，该化合物(i)可用于后续开发新的、高效、低毒的抗癌药物。

具体实施方式

下面是本发明的具体实施例。

实施例1化合物i的合成

采用文献[30]中的方法合成松萝酸的溴取代衍生物(iv)。为此，将溴代二恶烷复合物(2mmol(0.10ml)溴溶于14ml二恶烷)和几滴hbr添加到1mmol的松萝酸iii(344mg)中，在室温下放置7天。在旋转蒸发器浓缩反应混合物后，将所得沉淀物利用硅胶(60-200μm)、洗脱液ch2cl2进行色谱分离。产量283mg(67％)。然后使用[32]中的方法合成缩氨基硫脲v。将2mmol(370mg)对溴苯甲醛溶解于5ml乙醇中，在室温下搅拌的同时缓慢滴加2mmol氨基硫脲(vi)水溶液。将所得白色沉淀过滤，用蒸馏水洗涤并在空气中干燥。产量392mg(76％)。

向1mmol(258mg)对溴苯甲醛缩氨基硫脲(v)中添加1mmol(423mg)的松萝酸的溴取代衍生物(iv)，并在10ml乙醇中煮沸1小时。蒸发溶剂，反应混合物利用sio2、洗脱液-二氯甲烷进行色谱分离。

结果得到了黄棕色无定形粉末的肼噻唑衍生物，2-乙酰基-6-(2-(2-(4-溴亚苄基)肼基)噻唑-4-基)-3,7,9-三羟基-8,9b-二甲基二苯并[b,d]呋喃-1(9bh)-酮(i)，产率为66％(437mg)。

¹hnmr(cdcl3):18.80(1h,s,oh-3),12.56(1h,s,oh-7),10.28(1h,s,oh-9),9.02(1h,bs,nh),7.37(1h,d,j8.3,2h),7.30(1h,s,h-17),7.29(2h,d,j8.3,h-19,h-23),7.08(1h,s,h-14),5.82(1h,s,h-4),2.65(3h,s,h-12),2.18(3h,s,h-10),1.63(3h,s,h-15).¹³cnmr(cdcl3):201.3(c-11),198.0(c-1),191.5(c-3),180.2(c-4a),166.1(c-16),156.2(c-5a),151.5(c-7),151.2(c-9),143.5(c-13),141.0(c-17),132.3(c-18),131.7(2c,c-20,c-22),127.9(2c,c-19,c-23),123.8(c-21),108.8(c-8),105.3(c-2),104.8(c-14),103.6(c-9a),97.6(c-6),97.2(c-4),59.2(c-9b),32.1(c-15),27.8(c-12),8.4(c-10).hrms,found:m/z583.0219[m]⁺c26h20n3o6⁸¹br1s1.calculated:581.0251.

实施例2所揭示化合物对tdp1活性作用的评估

重组人酪氨酰dna磷酸二酯酶1(ec号3.1.4)在大肠杆菌系统(英国苏塞克斯大学k.w.caldecott博士提供的质粒pet16b-tdp1)中表达，并按照[2,32]中的描述分离。在tdp1催化下，从寡核苷酸的3’-端去除黑洞淬灭剂1(bhq1)的反应被用作测试化合物抑制性能的测试系统。在寡核苷酸的5’-末端有(5,6)-fam，一种荧光团，其荧光强度在去除淬灭剂后会增加。用北极星光学荧光计(bmglabtech)测量荧光。

反应混合物(体积200μl)含有缓冲液(50mmtrishcl，ph8.0；50mmnacl；7mm巯基乙醇)、50nmol寡核苷酸和不同浓度的抑制剂。通过将tdp1添加到1.3nmol的最终浓度开始反应。每55秒在反应速率与时间(最多8分钟)的线性范围内进行测量。所揭示化合物的作用通过ic50值(将酶活性降低一半的抑制剂浓度)进行评估。使用火星数据分析2.0软件(bmglabtech)计算ic50值。

图2给出了在tdp1催化下抑制剂浓度与反应速率的典型关系曲线。所揭示化合物的ic50为0.026±0.011μmol，比原型化合物低近4000。

实施例3

使用spf状态的雄性cd-1小鼠对所揭示化合物的急性毒性进行评估。试验化合物以62.5mg/kg、125mg/kg、250mg/kg、500mg/kg、1000mg/kg、2000mg/kg和5000mg/kg剂量(每组5只动物)每次口服0.5ml体积，以0.5％羧甲基纤维素水溶液中的悬浮液形式。所有组均无动物死亡率。因此，研究表明，最大耐受剂量不低于5000mg/kg，而ld50超过5000мг/кг(每os，雄性小鼠)。

因此，本申请公开了一种低毒化合物，一种具有有用生物活性的结构式(i)的松萝酸衍生物，即具有抑制人酪氨酰dna磷酸二酯酶1(tdp1)作用的能力。

本发明化合物对人酪氨酰dna磷酸二酯酶1(tdp1)具有特异性抑制作用，是一种有效的抑制剂，可以增加了这种酶的抑制剂数量，可用于开发临床有用的药物。

参考文献

1.cortesledesmaf.,etal.,nature,2009,461,674-678.

2.interthalh.,etal.,proc.natl.acad.sci.u.s.a.2001,98,12009-12014.

3.dexheimerts,etal.,anticanceragentsmedchem.2008,8,381–389.

4.benhassines,etal.,theembojournal,2009,28,632–640.

5.povirklf.isrnmol.biol.,2012,1–16.

6.vancejr,wilsonte.j.biol.chem.,2001,276,15073–15081.

7.pommiery.nat.rev.cancer,2006,6,789–802.

8.pommiery.,etal.chembiol.,2010,17,421–433.

9.berettagl,etal.,curr.med.chem.2010,17,1500-1508.

10.el-khamisysf,etal.,dnarepair(amst).,2009,8760–766.

11.dasbb,etal.,theembojournal.,2009,28,3667–3680.

12.katyals.,etal.,emboj.,2007,26,4720–4731.

13.hiranor.,etal.,emboj.,2007,26,4732–4743.

14.barthelmeshu,etal.,jbiolchem.2004,279,55618–25565.

15.nivensmc,etal.,cancerchemotherpharmacol.,2004,53,107–115.

16.alagozm.,etal.,nucleicacidsres.,2014,42,3089-3103.

17.muraij.,etal.,jbiolchem.2012,287,12848-12857.

18.dexheimer,t.s.,etal.,anticanceragentsmed.chem.2008,8,381-389

19.cortesledesma,f.,etal.,nature2009,461,674-678.

20.antony,s.,etal.,j.med.chem.2012,55,4457-4478.

21.conda-sheridan,m.,etal.,j.med.chem.2013,56,182-200.

22.sirivolu,v.r.,etal.,j.med.chem.2012,55,8671-8684.

23.huang,s.n.,etal.,expertopintherpat.2011,21,1285-1292.

24.davies,d.r.,etal.,j.mol.biol.2003,324,917-932.

25.marchand,c.,etal.,mol.cancerther.2009,8,240–248

26.zakharenko,a.l.,etal.,rus.j.bioorg.chem.2015,41,657-662.

27.zakharenko,a.l.,etal.,bioorg.med.chem.2015,23,2044-2052

28.zakharenkoa.,etal.,med.chem.,2012,8,883-893.

29.салахутдиновн.ф.,идр.,патентрф№2317076с1,оп.20.02.2008.

30.лузинао.а.идр.,химияприродныхсоединений,2012,№3,350-355.

31.aslam,m.a.s.,etal.,europeanjournalofmedicinalchemistry,2011,46,5473-5479.

32.lebedevan.a.,etal.,febslett.,2011,585,683-686.