嵌合抗原受体和表达其的自然杀伤细胞的制作方法

文档序号：18412956发布日期：2019-08-13 18:59阅读：301来源：国知局

本发明涉及一种嵌合抗原受体和表达其的自然杀伤细胞。

背景技术：

人自然杀伤细胞(naturalkillercells,nk细胞)在针对恶性淋巴瘤细胞的先天免疫防御中起着重要作用，并且因此可用于过继免疫治疗(即过继细胞免疫治疗，adoptiveimmunetherapy,adoptivecellularimmunotherapy)。然而，由于离体细胞扩增的困难和nk细胞的活性在个体患者中的差异，难以使用nk细胞。

在使用t细胞的免疫细胞疗法的领域，即t细胞治疗领域，已开发用于自身免疫细胞治疗的嵌合抗原受体。已知嵌合抗原受体通过重新编程t细胞来帮助t细胞激活，以改善对特定癌症的治疗效果或克服对t细胞治疗的抗性。

ox40配体(cd252)是一种属于tnfr超家族的蛋白，并且公知在抗原呈递细胞(apc)、部分nk细胞和部分b细胞中表达，还已知其在这些细胞激活后数小时至数天内表达。

作为ox40配体(cd252)的受体，ox40(cd134)已知在t细胞中表达，并且还已知其在通过抗原和cd28激活t细胞后在24小时内表达。已知cd134的表达可通过cd28激活进一步增强t细胞的应答，从而增加t细胞的增殖以及细胞因子的分泌和存活。

然而，尚不清楚ox40配体在增强nk细胞的抗癌活性中的作用，并且尚未报道试图将ox40配体用于嵌合抗原受体的尝试。

为了研究cd252在nk细胞的抗肿瘤应答中的作用，本发明人构建了两种不同的含有car的nk受体。首先，对已知在信号传导结构域中增加nk细胞的细胞毒性的多种刺激辅助因子进行遗传工程化来产生编码高亲和力重组fcrg3av158变体(cd16v)的慢病毒。将包括不同的细胞间信号分子的cd16v受体在nk细胞中进行转导，接着检测其表达。此外，在对cd20分子特异的利妥昔单抗的存在下，在体外使用淋巴瘤细胞系研究了转导的nk细胞的抗肿瘤应答。

作为第二种方法，试验了cd252在nkg2d介导的抗肿瘤活性中的功能作用。作为nk细胞激活的关键受体的nkg2d可识别mhc1类链相关a(mica)、micb以及其它不同的ul16结合蛋白(ulbp)，它们在遗传毒性应激、感染和/或细胞毒性后优先表达。

将多种含有不同信号分子的nkg2d嵌合抗原受体遗传工程化、转导和表达于nk92mi细胞中。此后，对转导的细胞进行体外抗肿瘤效果的评价。

本发明人发现，作为克服当前的免疫细胞治疗如nk细胞的限制的一种方法，与已知的其它信号传导结构域相比，含有ox40配体的嵌合抗原受体具有显著改进的nk细胞抗癌活性，从而完成了本发明。

技术实现要素：

发明要解决的问题

因此，本发明的目的是提供一种嵌合抗原受体，其能够使用自然杀伤(nk)细胞来提高抗癌免疫细胞治疗效率。

用于解决问题的方案

1.一种嵌合抗原受体，其包括：包含ox40配体(cd252)的全部或一部分的细胞内信号传导结构域。

2.根据上述1所述的嵌合抗原受体，其进一步包括：与细胞内信号传导结构域(intracellularsignalingdomain)连接的跨膜结构域(transmembranedomain)；与跨膜结构域连接的间隔区结构域(spacerdomain)；和与间隔区连接的胞外结构域(extracellulardomain)。

3.根据上述2所述的嵌合抗原受体，其进一步包括与胞外结构域连接的信号序列。

4.根据上述3所述的嵌合抗原受体，其中所述信号序列包括cd16的全部或一部分。

5.根据上述2所述的嵌合抗原受体，其中所述胞外结构域包括选自由抗体的抗原结合片段、fc受体、自然细胞毒性受体、nkg2d、2b4和dnam-1组成的组的任一种的全部或一部分。

6.根据上述5所述的嵌合抗原受体，其中抗原结合片段为fab片段、f(ab')片段、f(ab')2片段或fv片段。

7.根据上述6所述的嵌合抗原受体，其中fv片段是单链可变片段(single-chainvariablefragment,scfv)。

8.根据上述5所述的嵌合抗原受体，其中fc受体选自由cd16、cd32、cd64、cd23、cd89及其变体组成的组。

9.根据上述8所述的嵌合抗原受体，其中fc受体为cd16或其变体。

10.根据上述5所述的嵌合抗原受体，其中自然细胞毒性受体选自由nkp46、nkp30、nkp44、nkp80和nkp65受体组成的组。

11.根据上述2所述的嵌合抗原受体，其中间隔区结构域包括选自由cd8α和cd28组成的组的任一种的全部或一部分。

12.根据上述2所述的嵌合抗原受体，其中跨膜结构域包括选自由cd8α和cd28组成的组的任一种的全部或一部分。

13.根据上述1所述的嵌合抗原受体，其中细胞内信号传导结构域进一步包括cd3-zeta的全部或一部分。

14.根据上述13所述的嵌合抗原受体，其中cd3-zeta和ox40配体从细胞膜向细胞的内部顺序排列。

15.一种嵌合抗原受体，其包括细胞内信号传导结构域，所述细胞内信号传导结构域包括：包含选自由cd28和4-1bb组成的组的任一种的全部或一部分的第一细胞内信号传导结构域；包含选自由ox40配体、ox40和4-1bb组成的组的任一种的全部或一部分的第二细胞内信号传导结构域；和包含cd3-zeta的全部或一部分的第三细胞内信号传导结构域，其中第一、第二和第三细胞内信号传导结构域从细胞膜向细胞的内部顺序排列。

16.根据上述15所述的嵌合抗原受体，其进一步包括：与细胞内信号传导结构域连接的跨膜结构域；与跨膜结构域连接的间隔区结构域；和与间隔区结构域连接的胞外结构域。

17.根据上述16所述的嵌合抗原受体，其进一步包括与胞外结构域连接的信号序列。

18.根据上述17所述的嵌合抗原受体，其中信号序列包括cd16的全部或一部分。

19.根据上述16所述的嵌合抗原受体，其中胞外结构域包括选自由抗体的抗原结合片段、fc受体、自然细胞毒性受体、nkg2d、2b4和dnam-1组成的组的任一种的全部或一部分。

20.根据上述16所述的嵌合抗原受体，其中间隔区结构域包括选自由cd8α和cd28组成的组的任一种的全部或一部分。

21.根据上述16所述的嵌合抗原受体，其中跨膜结构域包括选自由cd8α和cd28组成的组的任一种的全部或一部分。

22.根据上述15所述的嵌合抗原受体，其中第一细胞内信号传导结构域包括cd28的全部或一部分；第二细胞内信号传导结构域包括ox40配体的全部或一部分；并且第三细胞内信号传导结构域包括cd3-zeta的全部或一部分。

23.一种免疫细胞，其表达根据上述1至22中任一项所述的嵌合抗原受体。

24.根据上述23所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是自然杀伤细胞(nk细胞)。

25.一种用于治疗肿瘤的药物组合物，其包括根据上述23所述的免疫细胞作为活性成分。

26.根据上述25所述的药物组合物，当胞外结构域为fc受体时，所述药物组合物进一步包含抗体作为活性成分。

27.一种核酸序列，其编码根据上述1至22中任一项所述的嵌合抗原受体。

28.根据上述27所述的核酸序列，其中所述核酸序列编码选自由seqidno：33、41、43、45、47、49、51、53、55、69、71、77、81、83、85、87、89、91和93组成的组的一个或多个氨基酸序列，或其具有80％以上的序列同一性的变体。

29.根据上述28所述的核酸序列，其中所述核酸序列包括选自由seqidno：32、40、42、44、46、48、50、52、54、68、70、76、80、82、84、86、88、90和92组成的组的一个或多个核酸序列，或其具有80％以上的序列同一性的变体。

30.一种治疗肿瘤的方法，其包括向受试者施用根据上述23所述的免疫细胞。

发明的效果

根据本发明的嵌合抗原受体的nk细胞激活效率优异。

取决于待靶向的癌症的类型，根据本发明的嵌合抗原受体可与各种癌症靶抗体一起使用。

根据本发明的嵌合抗原受体通过应用不同的抗原识别位点适用于不同的癌症类型。

表达根据本发明的嵌合抗原受体的nk细胞对癌细胞的细胞毒性优异。

表达根据本发明的嵌合抗原受体的nk细胞可有效用于免疫细胞治疗。

附图说明

图1a示出根据本发明的一个实施方案，分别用cd16v-zcar(第1代)、cd16v-28zcar(第2代)、cd16v-bbzcar(第2代)、cd16v-ox40zcar(第2代)或cd16v-28ox40lzcar(第3代)转导的nk92mi细胞的car表达水平。

图1b示出通过对k562细胞的细胞毒性评估获得的分别用cd16v-zcar(第1代)、cd16v-28zcar(第2代)、cd16v-bbzcar(第2代)、cd16v-ox40zcar(第2代)或cd16v-28ox40lzcar(第3代)转导的nk92mi细胞的内在细胞杀伤能力(即，‘细胞毒性’)。

图1c示出当与针对ramos细胞的抗体组合时，根据本发明的一个实施方案，分别用cd16v-zcar(第1代)、cd16v-28zcar(第2代)、cd16v-bbzcar(第2代)、cd16v-ox40zcar(第2代)或cd16v-28ox40lzcar(第3代)转导的nk92mi细胞的nk细胞介导的细胞毒性的评估。

图1d示出根据本发明的一个实施方案，分别用cd16v-zcar(第1代)和cd16v-ox40lzcar(第2代)转导的nk92mi细胞的car表达水平。

图1e示出当与针对ramos细胞的抗体组合时，根据本发明的一个实施方案，分别用cd16v-zcar(第1代)和cd16v-ox40lzcar(第2代)转导的nk92mi细胞的nk细胞介导的细胞毒性的评估。

图1f示出根据本发明的一个实施方案，分别用cd16v-zcar(第1代)和cd16v-zox40lcar(第2代)转导的nk92mi细胞的car表达水平。

图1g示出当与针对ramos细胞的抗体组合时，根据本发明的一个实施方案，分别用cd16v-zcar(第1代)或cd16v-zox40lcar(第2代)转导的nk92mi细胞的nk细胞介导的细胞毒性的评估。

图2a示出根据本发明的一个实施方案，分别用cd16v-zcar(第1代)、cd16v-bbzcar(第2代)或cd16v-bbox40lzcar(第3代)转导的nk92mi细胞的car表达水平。

图2b示出当与针对ramos细胞的抗体组合时，根据本发明的一个实施方案，分别表达cd16v-zcar(第1代)、cd16v-bbzcar(第2代)或cd16v-bbox40lzcar(第3代)的nk92mi细胞的nk细胞介导的细胞毒性的评估。

图3a示出根据本发明的一个实施方案，分别用cd16v-28ox40lzcar、cd16v-28ox40zcar或cd16v-28bbzcar转导的nk92mi细胞的car表达水平，其中全部为第3代car。

图3b示出当与针对ramos细胞的抗体组合时，根据本发明的一个实施方案，分别表达cd16v-28ox40lzcar、cd16v-28ox40zcar或cd16v-28bbzcar的nk92mi细胞的nk细胞介导的细胞毒性的评估，其中全部为第3代car。

图4a示出根据本发明的一个实施方案，分别用cd16v-28(h)bbzcar、cd16v-28(h)ox40zcar或cd16v-28(h)ox40lzcar转导的nk92mi细胞的car表达水平，其中全部为各自在铰链包含cd28的第3代car。

图4b示出当与针对ramos细胞的抗体组合时，根据本发明的实施方案，分别表达cd16v-28(h)bbzcar、cd16v-28(h)ox40zcar或cd16v-28(h)ox40lzcar的nk92mi细胞的nk细胞介导的细胞毒性的评估，其中全部为各自在铰链包含cd28的第3代car。

图5a示出根据本发明的一个实施方案，分别用nkg2d-zcar(第1代)、nkg2d-28zcar(第2代)、nkg2d-bbzcar(第2代)或nkg2d-ox40zcar(第2代)转导的nk92mi细胞的car表达水平。

图5b示出根据本发明的一个实施方案，分别用nkg2d-zcar(第1代)、nkg2d-28zcar(第2代)、nkg2d-bbzcar(第2代)或nkg2d-ox40zcar(第2代)转导的nk92mi细胞对人乳腺癌细胞系mcf-7的nk细胞介导的细胞毒性的评估。

图6a示出根据本发明，分别用nkg2d-zcar(第1代)、包括cd28信号传导结构域的nkg2d-28bbzcar(第3代)、或nkg2d-28ox40zcar(第3代)转导的nk92mi细胞的car表达水平。

图6b示出根据本发明的一个实施方案，分别用nkg2d-zcar(第1代)、nkg2d-28bbzcar(第3代)或nkg2d-28ox40zcar(第3代)转导的nk92mi细胞对人乳腺癌细胞系mcf-7的nk细胞介导的细胞毒性的评估。

图7a示出根据本发明的一个实施方案，分别用nkg2d-zcar(第1代)、nkg2d-28zcar(第2代)、nkg2d-28(h)ox40lzcar(第3代)或包括nkg2d胞外结构域和cd28铰链之间的aaa序列的nkg2d-aaa-28(h)ox40lzcar(第3代)转导的nk92mi细胞的car表达水平。

图7b示出根据本发明的一个实施方案，分别用nkg2d-zcar(第1代)、nkg2d-28zcar(第2代)、nkg2d-28(h)ox40lzcar(第3代)或包括nkg2d胞外结构域和cd28铰链之间的aaa序列的nkg2d-aaa-28(h)ox40lzcar(第3代)转导的nk92mi细胞对人乳腺癌细胞系mcf-7的nk细胞介导的细胞毒性的评估。

图8a示出根据本发明的一个实施方案，分别用nkg2d-zcar(第1代)或包括nkg2d胞外结构域和cd28铰链之间的aaa序列的nkg2d-aaa-28(h)ox40lzcar(第3代)转导的nk92mi细胞的car表达水平。

图8b示出根据本发明的一个实施方案，人肺癌细胞系h1299和h1944中不同nkg2d配体的表达水平。

图8c示出根据本发明的一个实施方案，分别用nkg2d-zcar(第1代)或包括nkg2d胞外结构域和cd28铰链之间的aaa序列的nkg2d-aaa-28(h)ox40lzcar(第3代)转导的nk92mi细胞对人肺癌细胞系h1299和h1944的nk介导的细胞毒性的评估。

具体实施方式

本发明公开了嵌合抗原受体和表达其的nk细胞，更具体地，公开了通过包括含有ox40配体(cd252)的全部或一部分的细胞内信号传导结构域而具有优异的免疫细胞的抗癌活性的增加效果的嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor,car)、以及表达其的免疫细胞。

在下文中，将详细描述本发明。

本发明的嵌合抗原受体可包括含有ox40配体(cd252)的全部或一部分的细胞内信号传导结构域。

根据本发明的一个实施方案，嵌合抗原受体可以为进一步包括与细胞内信号传导结构域连接的跨膜结构域；与跨膜结构域连接的间隔区结构域；和与间隔区结构域连接的胞外结构域的嵌合抗原受体。另外，根据本发明的一个实施方案，嵌合抗原受体可以为进一步包括与胞外结构域的、未与间隔区结构域连接的末端相连接的信号序列的嵌合抗原受体。根据本发明的一个实施方案，上述结构域可以彼此直接连接，或者可通过接头连接。

根据本发明的一个实施方案，当表达嵌合抗原受体时，信号序列可允许胞外结构域位于免疫细胞(例如，nk细胞)的细胞膜外。例如，信号序列可以包括cd16的全部或一部分。

根据本发明的一个实施方案，胞外结构域是与抗体特异性连接或特异性识别抗原的结构域，并且可以包括，例如fc受体、例如单链可变区(scfv)等抗体中的抗原结合片段、自然细胞毒性受体、nkg2d、2b4或dnam-1。因此，在本公开中，术语“胞外结构域”以与“抗原识别位点”、“抗原结合片段”和/或“抗体结合位点”相同的含义使用。

根据本发明的一个实施方案的嵌合抗原受体可包括作为胞外结构域的fc受体，因此与根据待治疗的癌症细胞类型而不同的抗体相关联。根据一个实施方案，fc受体可为选自由cd16、cd32、cd64、cd23和cd89组成的组的任一种。根据一个更具体的实施方案，fc受体可以是包括cd16v158变体(cd16v)的全部或一部分的fc受体。

根据另一个实施方案，本发明的嵌合抗原受体还可进一步包括作为胞外结构域的抗体的抗原结合片段，其可在不与抗体共同施用的情况下直接识别抗原。根据一个实施方案，抗原结合片段可以是fab片段、f(ab')片段、f(ab')2片段或fv片段。根据本发明的一个实施方案，抗体可以是能够特异性结合抗原的、简言之为具有抗原特异性结合能力的各种类型的抗体中的任一种。例如，抗体可以是其中一条轻链和一条重链彼此键合的抗体，或者其中两条轻链和两条重链彼此键合的抗体。例如，当两条轻链和两条重链彼此键合时，抗体可以是其中包括彼此键合的第一轻链和第一重链的第一单元和包括彼此键合的第二轻链和第二重链的第二单元彼此组合的抗体。在此，所成的键可以是二硫键，但不限于此。根据本发明的实施方案，上述的两个单元可以彼此相同或不同。例如，包括第一轻链和第一重链的第一单元和包括第二轻链和第二重链的第二单元可以彼此相同或不同。因此，所制备的分别通过第一单元和第二单元识别两种不同抗原的抗体通常被称为“双特异性抗体”。另外，例如，抗体可以是其中三个以上的上述单元彼此组合的抗体。本发明的抗原结合片段可衍生于如上所述各种类型的抗体，但不限于此。

根据本发明的另一实施方案，此处使用的胞外结构域可以是自然杀伤受体(也称为“自然细胞毒性受体”)。根据一个具体的实施方案，nk受体可包括nkp46、nkp30、nkp44、nkp80和nkp65受体，但不限于此。

根据本发明的一个实施方案，跨膜结构域穿透细胞膜，并且只要该结构域可在不干扰胞外结构域和细胞内信号传导结构域功能的情况下穿透细胞膜，其可以是任何一种而没有限制。例如，跨膜结构域可包括选自由cd8α和cd28组成的组的任一种的全部或一部分。

根据本发明的一个实施方案，胞外结构域和跨膜结构域可以通过间隔区结构域彼此连接。例如，该间隔区结构域可以是铰链结构域。根据一个具体的实施方案，间隔区结构域可以包括选自由cd8α和cd28组成的组的任一种的全部或一部分。

根据本发明的一个实施方案，细胞内信号传导结构域为位于nk细胞的细胞膜内侧、即位于其细胞质中的一部分，并且可以包括当与胞外结构域连接的抗体与靶抗原相结合时，可以传递信号来激活nk细胞的序列。

根据本发明的一个实施方案，嵌合抗原受体可包括一个以上的细胞内信号传导结构域。当包括两个以上的细胞内信号传导结构域时，细胞内结构域可以彼此串联连接。例如，当包括三个细胞内信号传导结构域时，第一细胞内信号传导结构域的末端可与跨膜结构域的、未与间隔区结构域连接的末端相连接，第二细胞内信号传导结构域的末端可与第一细胞内信号传导结构域的、未与跨膜结构域连接的末端相连接，并且第三细胞内信号传导结构域的末端可与第二细胞内信号传导结构域的、未与第一胞内信号传导结构域连接的末端相连接。即，第一、第二和第三细胞内信号传导结构域可以从细胞膜向细胞的内部的顺序排列。此外，即使当包括两个、四个或更多个细胞内信号传导结构域时，这些结构域可以以如上所述相同的方式彼此连接。根据本发明的一个实施方案，这些相应的结构域可以彼此直接连接，或者可以通过接头连接。

根据本发明的一个实施方案，嵌合抗原受体可包括两个细胞内信号传导结构域。例如，嵌合抗原受体可包括与跨膜结构域连接的第一细胞内信号传导结构域，和与第一细胞内信号传导结构域的、未与跨膜结构域连接的末端相连接的第二细胞内信号传导结构域。根据一个更具体的实施方案，第一细胞内信号传导结构域可包括选自由ox40(cd134)、ox40配体(ox40l、cd252)、4-1bb(cd137)、cd28、dap10、cd3-zeta(cd3ζ)和dap12组成的组的任一种的的全部或一部分，并且第二细胞内信号传导结构域可包括选自由ox40配体、cd3-zeta和dap12组成的组的任一种的全部或一部分。在这种情况下，第一细胞内信号传导结构域和第二细胞内信号传导结构域中的至少一个包括ox40配体的全部或一部分。例如，嵌合抗原受体可包括含有ox40配体的全部或一部分的第一细胞内信号传导结构域和含有选自cd3-zeta和dap12的任一种的全部或一部分的第二细胞内信号传导结构域。此外，例如，嵌合抗原受体可包括含有选自由cd3-zeta和dap12组成的组的任一种的全部或一部分的第一细胞内信号传导结构域和含有ox40配体的全部或一部分的第二细胞内信号传导结构域。

根据本发明的另一个实施方案，嵌合抗原受体可包括三个细胞内信号传导结构域。例如，嵌合抗原受体可以包括：与跨膜结构域连接的第一细胞内信号传导结构域；与第一细胞内信号传导结构域的、未与跨膜结构域连接的末端相连接的第二细胞内信号传导结构域；和与第二细胞内信号传导结构域的、未与第一细胞内信号传导结构域连接的末端相连接的第三细胞内信号传导结构域。根据一个更具体的实施方案，第一细胞内信号传导结构域可包括选自由4-1bb、ox40、ox40配体、cd28和dap10组成的组的任一种的全部或一部分，第二细胞内信号传导结构域可包括选自由ox40配体、ox40和4-1bb组成的组的任一种的全部或一部分，并且第三细胞内信号传导结构域可包括选自由ox40配体、cd3-zeta和dap12组成的组的任一种的全部或一部分。在这种情况下，第一细胞内信号传导结构域、第二细胞内信号传导结构域和第三细胞内信号传导结构域中的至少一个可包括ox40配体的全部或一部分。

另一方面，本发明可提供嵌合抗原受体，其包括：包含选自由cd28和4-1bb组成的组的任一种的全部或一部分的第一细胞内信号传导结构域；包含选自由ox40配体、ox40和4-1bb组成的组的任一种的的全部或一部分的第二细胞内信号传导结构域；和包含cd3-zeta的全部或一部分的第三细胞内信号传导结构域，其中第一、第二和第三细胞内信号传导结构域从细胞膜向细胞的内部顺序排列。根据本发明的一个实施方案，上述各个结构域可以彼此直接连接，或者可以通过接头连接。

根据本发明的一个实施方案，嵌合抗原受体可以进一步包括：与第一细胞内信号传导结构域连接的跨膜结构域；与跨膜结构域连接的间隔区结构域；和与间隔区结构域连接的胞外结构域。另外，嵌合抗原受体还可进一步包括与胞外结构域连接的信号序列。根据本发明的一个实施方案，上述各个结构域可以彼此直接连接，或者可以通过接头连接。

根据本发明的一个实施方案，胞外结构域是用于与抗体特异性结合或特异性识别抗原的结构域，例如，fc受体、例如单链可变片段(scfv)等的抗体的抗原结合片段、nk受体(自然细胞毒性受体)、nkg2d、2b4或dnam-1等。因此，在本公开中，术语“胞外结构域”以与“抗原识别位点”、“抗原结合片段”和/或“抗体结合位点”相同的含义使用。

根据本发明实施方案所述的嵌合抗原受体可包括作为胞外结构域的fc受体，并且因此，可取决于待治疗的癌症细胞类型与各种抗体一起使用。根据一个实施方案，fc受体可包括选自由cd16、cd32、cd64、cd23和cd89及其变体组成的组的任一种。根据一个更具体的实施方案，fc受体可包括cd16或其变体，并且最具体地，可包括cd16v158变体(cd16v)的全部或一部分。

根据另一个实施方案，本发明的嵌合抗原受体可包括作为胞外结构域的抗体的抗原结合片段，其在不与抗体共同施用的情况下直接识别抗原。根据一个实施方案，抗原结合片段可以是fab片段、f(ab')片段、f(ab')2片段或fv片段。根据本发明的一个实施方案，抗体可以是能够特异性结合抗原的各种类型的抗体中的任一种。例如，抗体可以是其中一条轻链和一条重链彼此键合的抗体，或者其中两条轻链和两条重链彼此键合的抗体。例如，当两条轻链和两条重链彼此键合时，抗体可以是其中包括彼此键合的第一轻链和第一重链的第一单元和包括彼此键合的第二轻链和第二重链的第二单元彼此组合的抗体。所成的键可以是二硫键，但不限于此。根据本发明的一个实施方案，上述两个单元可以彼此相同或不同。例如，包括第一轻链和第一重链的第一单元和包括第二轻链和第二重链的第二单元可以彼此相同或不同。因此，在相关技术领域中，所制备的分别通过第一单元和第二单元识别两种不同抗原的抗体通常被称为“双特异性抗体”。另外，例如，抗体可以是其中三个以上的上述单元相互组合的抗体。本发明的抗原结合片段可衍生自如上所述的各种抗体，但不限于此。

根据本发明的另一个实施方案，本文使用的胞外结构域可以是nk受体(自然细胞毒性受体)。根据一个具体实施方案，nk受体可包括nkp46、nkp30、nkp44、nkp80和nkp65受体，但不限于此。

根据一个实施方案，信号序列可以包括cd16的全部或一部分。根据另一个实施方案，胞外结构域可包括cd16v158变体(cd16v)的全部或一部分。根据另一个实施方案，间隔区结构域可包括选自由cd8α(cd8-alpha)和cd28组成的组的任一种的全部或一部分。根据另一个实施方案，跨膜结构域可包括选自由cd8α和cd28组成的组的任一种的全部或一部分。

根据一个具体实施方案，嵌合抗原受体可包括选自由seqidno：33、41、43、45、47、49、51、53、55、69、71、77、81、83、85、87、89、91和93组成的组的一个或多个的氨基酸序列，或其具有80％以上的序列同一性的变体。

根据另一方面，本发明提供免疫细胞(例如，nk细胞)来表达根据本发明的上述嵌合抗原受体。

本发明的免疫细胞可对肿瘤细胞表现出毒性。已确定根据本发明的嵌合抗原受体对哪些类型的肿瘤细胞表现出特异性毒性，取决于哪些类型的抗体与胞外结构域结合。因此，表达根据本发明的嵌合抗原受体的免疫细胞可以对其表现出特定毒性的肿瘤细胞的类型并不特别限定。根据一个实施方案，当本发明的免疫细胞(例如，nk细胞)与利妥昔单抗一起使用时，细胞可对恶性淋巴瘤细胞表现出毒性。例如，恶性淋巴瘤细胞可表达cd20。此外，例如，恶性淋巴瘤可以是b细胞淋巴瘤。

根据另一方面，本发明进一步提供了一种用于预防或治疗肿瘤或肿瘤转移的药物组合物，其包括表达上述根据本发明的嵌合抗原受体的免疫细胞(例如，nk细胞)，其数量为待治疗的受试者(“治疗靶”)中的肿瘤细胞(例如恶性淋巴瘤细胞)的数量的2至7.5倍。

根据本发明的一个实施方案，在本发明的药物组合物中包括的单次剂量的免疫细胞(例如，nk细胞)的数量的范围可为治疗靶中肿瘤细胞(例如，恶性淋巴瘤细胞)的数量的0.75至10倍。例如，单次剂量的免疫细胞(例如，nk细胞)的数量的范围可为治疗靶中肿瘤细胞(例如，恶性淋巴瘤细胞)数量的2至7.5倍。

根据另一方面，本发明进一步提供编码上述根据本发明的嵌合抗原受体的核酸序列。

根据本发明的一个实施方案，核酸序列可包括选自由seqidno：32、40、42、44、46、48、50、52、54、68、70、76、80、82、84、86、88、90和92组成的组的一个或多个核苷酸序列，或其具有80％或更多序列同一性的变体。

根据另一方面，本发明进一步提供了包括上述根据本发明的核酸序列的载体。

根据另一方面，本发明进一步提供一种治疗肿瘤的方法，其包括向受试者施用上述的免疫细胞。

根据另一方面，本发明进一步提供一种预防肿瘤转移的方法，其包括向受试者施用上述免疫细胞。

受试者可以是具有肿瘤的哺乳动物，具体地，是人类，但并不限于此。

给药可以通过如下方式进行：表达根据本发明的嵌合抗原受体的免疫细胞(例如，nk细胞)的数量的范围可以是治疗靶中肿瘤细胞(例如，恶性淋巴瘤细胞)的数量的2至7.5倍。

给药方法没有特别限制，例如，可以包括通过口服或胃肠外途径给药。

肿瘤没有特别限制，但可以包括恶性淋巴瘤、白血病、乳腺癌、肺癌等，并且更具体地是b细胞淋巴瘤。

在下文中，将通过以下实施例更详细地描述本发明。这些实施例仅用于详细描述本发明，并且本发明的范围不限于实施例中所示的内容。

实施例1：方法和试剂

细胞系

人b系细胞系ramos、人红白血病细胞系k562、人乳腺癌细胞系mcf-7、人肺癌细胞系h1299和h1944、以及nk-92mi由美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection)(atcc，manassas，va，usa)提供。k562在含有10％fbs的rpmi-1640(gibco，grandisland，ny，usa)中维持。ramos在含有10％fbs(胎牛血清；gibco，grandisland，ny，usa)的rpmi-1640(atcc)(manassas，va)中维持。mcf-7在emem(atcc)+10％fbs(gibco)培养基中维持，同时h1299和h1944在rpmi-1640(atcc)+10％fbs(gibco)培养基中维持。另外，nk-92mi和转导的nk-92mi细胞在含1％人血浆的无血清培养基中维持。人胚肾成纤维细胞，即293t细胞系由atcc提供。该细胞系在含有10％fbs(gibco，grandisland，ny，usa)的dmem中维持。

质粒

分别人工合成fcrg3av158突变体(cd16v)的信号序列和胞外结构域，nkg2d的胞外结构域；cd8α的信号序列，cd8α的铰链和跨膜结构域；cd28的铰链和跨膜结构域；以及4-1bb、ox40、ox40配体(ox40l)和cd3ζ的细胞内信号传导结构域。上述材料通过pcr重叠延伸剪接(splicingbyoverlappingextensionbypcr,‘soe-pcr’)以各种组合进行组装。通过直接测序确认pcr产物。将每个pcr产物以nhe1和ecor1切割，然后分别插入(即，连接至)例如mscv-ef1α-gfp载体或ef1a-mcs载体等第3代自失活慢病毒表达载体的nhe1和ecori位点。

已在下表1中总结根据本发明实施方案的嵌合抗原受体(car)。根据本发明实施方案的所有car的结构域已彼此串联(级联)并且框内(inframe)连接。

[表1]

cd16v-zcar(第1代)是通过连接以下产生的：cd16的信号序列结构域(核苷酸34-84，genbank登录号no.x52645)；cd16v(fcrg3av158)的胞外结构域(核苷酸85-651，在genbank登录号no.x52645中第559位核苷酸g突变)；人cd8α衍生的铰链和跨膜结构域(核苷酸1292-1507，genbanknm001768.6)；cd3ζ衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸299-634，genbanknm000734.3)；以及终止密码子tga。

cd16v-bbzcar(第2代)是通过连接以下产生的：cd16的信号序列结构域(核苷酸34-84，genbank登录号no.x52645)；cd16v(fcrg3av158)的胞外结构域(核苷酸85-651，genbank登录号no.x52645中第559位核苷酸g突变)；人cd8α衍生的铰链和跨膜结构域(核苷酸1292-1507，genbanknm001768.6)；cd137衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸901-1026，genbanknm001561.5)；cd3ζ衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸299-634，genbanknm000734.3)；以及终止密码子tga。

cd16v-ox40zcar(第2代)是通过连接以下产生的：cd16的信号序列结构域(核苷酸34-84，genbank登录号no.x52645)；cd16v(fcrg3av158)的胞外结构域(核苷酸85-651，genbank登录号no.x52645中第559位核苷酸g突变)；人cd8α衍生的铰链和跨膜结构域(核苷酸1292-1507，genbanknm001768.6)；cd134衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸733-840，genbankab590584.1)；cd3ζ衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸299-634，genbanknm000734.3)；以及终止密码子tga。

cd16v-ox40lzcar(第2代)是通过连接以下提供的：cd16的信号序列结构域(核苷酸34-84，genbank登录号no.x52645)；cd16v(fcrg3av158)的胞外结构域(核苷酸85-651，genbank登录号no.x52645中第559位核苷酸g突变)；人cd8α衍生的铰链和跨膜结构域(核苷酸1292-1507，genbanknm001768.6)；cd252衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸141-206，genbanknm003326.4)；cd3ζ衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸299-634，genbanknm000734.3)；以及终止密码子tga。

cd16v-zox40lcar(第2代)是通过连接以下产生的：cd16的信号序列结构域(核苷酸34-84，genbank登录号no.x52645)；cd16v(fcrg3av158)的胞外结构域(核苷酸85-651，genbank登录号no.x52645中第559位核苷酸g突变)；人cd8α衍生的铰链和跨膜结构域(核苷酸1292-1507，genbanknm001768.6)；cd3ζ衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸299-634，genbanknm000734.3)；cd252衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸141-206，genbanknm003326.4)；以及终止密码子tga。cd16v-28zcar(第2代)是通过连接以下产生的：cd16的信号序列结构域(34-84核苷酸，genbank登录号no.x52645)；cd16v(fcrg3av158)的胞外结构域(核苷酸85-651，genbank登录号no.x52645中第559位核苷酸g突变)；人cd8α衍生的铰链结构域(核苷酸1292-1435，genbanknm001768.6)；cd28衍生的跨膜和细胞内信号传导结构域(核苷酸679-882，genbanknm006139.3)；cd3ζ衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸299-634，genbanknm000734.3)；以及终止密码子tga。

cd16v-28(h)zcar(第2代)是通过连接以下产生的：cd16的信号序列结构域(核苷酸34-84，genbank登录号no.x52645)；cd16v(fcrg3av158)的胞外结构域(核苷酸85-651，genbank登录号no.x52645中第559位核苷酸g突变)；cd28衍生的铰链、跨膜和细胞内信号传导结构域(核苷酸562-882，genbanknm006139.3)；cd3ζ衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸299-634，genbanknm000734.3)；以及终止密码子tga。

cd16v-bbox40zcar(第3代)是通过连接以下产生的：cd16的信号序列结构域(核苷酸34-84，genbank登录号no.x52645)；cd16v(fcrg3av158)的胞外结构域(核苷酸85-651，genbank登录号no.x52645中第559位核苷酸g突变)；人cd8α衍生的铰链和跨膜结构域(核苷酸1292-1507，genbanknm001768.6)；cd137衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸901-1026，genbanknm001561.5)；cd134衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸733-840，genbankab590584.1)；cd3ζ衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸299-634，genbanknm000734.3)；以及终止密码子tga。

cd16v-ox40bbzcar(第3代)是通过连接以下产生的：cd16的信号序列结构域(核苷酸34-84，genbank登录号no.x52645)；cd16v(fcrg3av158)的胞外结构域(核苷酸85-651，genbank登录号no.x52645中第559位核苷酸g突变)；人cd8α衍生的铰链和跨膜结构域(核苷酸1292-1507，genbanknm001768.6)；cd134衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸733-840，genbankab590584.1)；cd137衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸901-1026，genbanknm001561.5)；cd3ζ衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸299-634，genbanknm000734.3)；以及终止密码子tga。

cd16v-28bbzcar(第3代)是通过连接以下产生的：cd16的信号序列结构域(核苷酸34-84，genbank登录号no.x52645)；cd16v(fcrg3av158)的胞外结构域(核苷酸85-651，genbank登录号no.x52645中第559位核苷酸g突变)；cd8α衍生的铰链(核苷酸1292-1435，genbanknm001768.6)；cd28衍生的跨膜和细胞内信号传导结构域(核苷酸679-882，genbanknm006139.3)；cd137衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸901-1026，genbanknm001561.5)；cd3ζ衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸299-634，genbanknm000734.3)；以及终止密码子tga。

cd16v-28ox40zcar(第3代)是通过连接以下产生的：cd16的信号序列结构域(核苷酸34-84，genbank登录号no.x52645)；cd16v(fcrg3av158)的胞外结构域(核苷酸85-651，genbank登录号no.x52645中第559位核苷酸g突变)；cd8α衍生的铰链结构域(核苷酸1292-1435，genbanknm001768.6)；cd28衍生的跨膜和细胞内信号传导结构域(核苷酸679-882，genbanknm006139.3)；cd134衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸733-840，genbankab590584.1)；cd3ζ衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸299-634，genbanknm000734.3)；以及终止密码子tga。

cd16v-28ox40lzcar(第3代)是通过连接以下产生的：cd16的信号序列结构域(核苷酸34-84，genbank登录号no.x52645)；cd16v(fcrg3av158)的胞外结构域(核苷酸85-651，genbank登录号no.x52645中第559位核苷酸g突变)；cd8α衍生的铰链结构域(核苷酸1292-1435，genbanknm001768.6)；cd28衍生的跨膜和细胞内信号传导结构域(核苷酸679-882，genbanknm006139.3)；cd252衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸141-206，genbanknm003326.4)；cd3ζ衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸299-634，genbanknm000734.3)；以及终止密码子tga。

cd16v-28(h)bbzcar(第3代)是通过连接以下产生的：cd16的信号序列结构域(核苷酸34-84，genbank登录号no.x52645)；cd16v(fcrg3av158)的胞外结构域(核苷酸85-651，genbank登录号no.x52645中第559位核苷酸g突变)；cd28衍生的铰链、跨膜和细胞内信号传导结构域(核苷酸562-882，genbanknm006139.3)；cd137衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸901-1026，genbanknm001561.5)；cd3ζ衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸299-634，genbanknm000734.3)；以及终止密码子tga。

cd16v-28(h)ox40zcar(第3代)是通过连接以下产生的：cd16的信号序列结构域(核苷酸34-84，genbank登录号no.x52645)；cd16v(fcrg3av158)的胞外结构域(核苷酸85-651，genbank登录号no.x52645中第559位核苷酸g突变)；cd28衍生的铰链、跨膜和细胞内信号传导结构域(核苷酸562-882，genbanknm006139.3)；cd134衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸733-840，genbankab590584.1)；cd3ζ衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸299-634，genbanknm000734.3)；以及终止密码子tga。

cd16v-28(h)ox40lzcar(第3代)是通过连接以下产生的：cd16的信号序列结构域(核苷酸34-84，genbank登录号no.x52645)；cd16v(fcrg3av158)的胞外结构域(核苷酸85-651，genbank登录号no.x52645中第559位核苷酸g突变)；cd28衍生的铰链、跨膜和细胞内信号传导结构域(核苷酸562-882，genbanknm006139.3)；cd252衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸141-206，genbanknm003326.4)；和cd3ζ衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸299-634，genbanknm000734.3)以及终止密码子tga。

cd16v-bbox40lzcar(第3代)是通过连接以下产生的：cd16的信号序列结构域(核苷酸34-84，genbank登录号no.x52645)；cd16v(fcrg3av158)的胞外结构域(核苷酸85-651，genbank登录号no.x52645中第559位核苷酸g突变)；人cd8α衍生的铰链和跨膜结构域(核苷酸1292-1507，genbanknm001768.6)；cd137衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸901-1026，genbanknm001561.5)；cd252衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸141-206，genbanknm003326.4)；cd3ζ衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸299-634，genbanknm000734.3)；以及终止密码子tga。

用于根据本发明实施方案的嵌合抗原受体(car)及其制备方法的结构域的序列表总结于下表2。

[表2]

另外，根据本发明实施方案的嵌合抗原受体(car)总结于下表3。根据本发明实施方案的全部car中各个car的结构域与另一个car串联(级联)并且也框内连接。

[表3]

nkg2d-zcar(第1代)是通过连接以下产生的：cd8α的信号序列结构域(核苷酸890-952，genbanknm001768.6)；nkg2d的胞外结构域(核苷酸788-1192，genbankid:af461811.1)；人cd8α衍生的铰链和跨膜结构域(核苷酸1292-1507，genbanknm001768.6)；cd3ζ衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸299-634，genbanknm000734.3)；以及终止密码子tga。

nkg2d-bbzcar(第2代)是通过连接以下产生的：cd8α的信号序列结构域(核苷酸890-952，genbanknm001768.6)；nkg2d的胞外结构域(核苷酸788-1192，genbankid:af461811.1)；人cd8α衍生的铰链和跨膜结构域(核苷酸1292-1507，genbanknm001768.6)；cd137衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸901-1026，genbanknm001561.5)；cd3ζ衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸299-634，genbanknm000734.3)；以及终止密码子tga。

nkg2d-ox40zcar(第2代)是通过连接以下产生的：cd8α的信号序列结构域(核苷酸890-952，genbanknm001768.6)；nkg2d的胞外结构域(核苷酸788-1192，genbankid:af461811.1)；人cd8α衍生的铰链和跨膜结构域(核苷酸1292-1507，genbanknm001768.6)；cd134衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸733-840，genbankab590584.1)；cd3ζ衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸299-634，genbanknm000734.3)；以及终止密码子tga。

nkg2d-zox40lcar(第2代)是通过连接以下产生的：cd8α的信号序列结构域(核苷酸890-952，genbanknm001768.6)；nkg2d的胞外结构域(核苷酸788-1192，genbankid:af461811.1)；人cd8α衍生的铰链和跨膜结构域(核苷酸1292-1507，genbanknm001768.6)；cd3ζ衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸299-634，genbanknm000734.3)；cd252衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸141-206，genbanknm003326.4)；以及cd3ζ终止密码子tga。

nkg2d-28zcar(第2代)是通过连接以下产生的：cd8α的信号序列结构域(核苷酸890-952，genbanknm001768.6)；nkg2d的胞外结构域(核苷酸788-1192，genbankid:af461811.1)；人cd8α衍生的铰链结构域(核苷酸1292-1435，genbanknm001768.6)；cd28衍生的跨膜和细胞内信号传导结构域(核苷酸679-882，genbanknm006139.3)；cd3ζ衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸299-634，genbanknm000734.3)；以及终止密码子tga。

nkg2d-28(h)zcar(第2代)是通过连接以下产生的：cd8α的信号序列结构域(核苷酸890-952，genbanknm001768.6)；nkg2d的胞外结构域(核苷酸788-1192，genbankid:af461811.1)；cd28衍生的铰链、跨膜和细胞内信号传导结构域(核苷酸562-882，genbanknm006139.3)；cd3ζ衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸299-634，genbanknm000734.3)；以及终止密码子tga。

nkg2d-bbox40zcar(第3代)是通过连接以下产生的：cd8α的信号序列结构域(核苷酸890-952，genbanknm001768.6)；nkg2d的胞外结构域(核苷酸788-1192，genbankid:af461811.1)；人cd8α衍生的铰链和跨膜结构域(核苷酸1292-1507，genbanknm001768.6)；cd137衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸901-1026，genbanknm001561.5)；cd134衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸733-840，genbankab590584.1)；cd3ζ衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸299-634，genbanknm000734.3)；以及终止密码子tga。

nkg2d-bbox40lzcar(第3代)是通过连接以下产生的：cd8α的信号序列结构域(核苷酸890-952，genbanknm001768.6)；nkg2d的胞外结构域(核苷酸788-1192，genbankid:af461811.1)；人cd8α衍生的铰链和跨膜结构域(核苷酸1292-1507，genbanknm001768.6)；cd137衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸901-1026，genbanknm001561.5)；cd252衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸141-206，genbanknm003326.4)；cd3ζ衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸299-634，genbanknm000734.3)；以及终止密码子tga。

nkg2d-ox40bbzcar(第3代)是通过连接以下产生的：cd8α的信号序列结构域(核苷酸890-952，genbanknm001768.6)；nkg2d的胞外结构域(核苷酸788-1192，genbankid:af461811.1)；人cd8α衍生的铰链和跨膜结构域(核苷酸1292-1507，genbanknm001768.6)；cd134衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸733-840，genbankab590584.1)；cd137衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸901-1026，genbanknm001561.5)；cd3ζ衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸299-634，genbanknm000734.3)；以及终止密码子tga。

nkg2d-28bbzcar(第3代)是通过连接以下产生的：cd8α的信号序列结构域(核苷酸890-952，genbanknm001768.6)；nkg2d的胞外结构域(核苷酸788-1192，genbankid:af461811.1)；cd8α衍生的铰链结构域(核苷酸1292-1435，genbanknm001768.6)；cd28衍生的跨膜和细胞内信号传导结构域(核苷酸679-882，genbanknm006139.3)；cd137衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸901-1026，genbanknm001561.5)；cd3ζ衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸299-634，genbanknm000734.3)；以及终止密码子tga。

nkg2d-28ox40zcar(第3代)是通过连接以下产生的：cd8α的信号序列结构域(核苷酸890-952，genbanknm001768.6)；nkg2d的胞外结构域(核苷酸788-1192，genbankid:af461811.1)；cd8α衍生的铰链结构域(核苷酸1292-1435，genbanknm001768.6)；cd28衍生的跨膜和细胞内信号传导结构域(核苷酸679-882，genbanknm006139.3)；cd134衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸733-840，genbankab590584.1)；cd3ζ衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸299-634，genbanknm000734.3)；以及终止密码子tga。

nkg2d-28ox40lzcar(第3代)是通过连接以下产生的：cd8α的信号序列结构域(核苷酸890-952，genbanknm001768.6)；nkg2d的胞外结构域(核苷酸788-1192，genbankid:af461811.1)；cd8α衍生的铰链结构域(核苷酸1292-1435，genbanknm001768.6)；cd28衍生的跨膜和细胞内信号传导结构域(核苷酸679-882，genbanknm006139.3)；cd252衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸141-206，genbanknm003326.4)；cd3ζ衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸299-634，genbanknm000734.3)；以及终止密码子tga。

nkg2d-28(h)bbzcar(第3代)是通过连接以下产生的：cd8α的信号序列结构域(核苷酸890-952，genbanknm001768.6)；nkg2d的胞外结构域(核苷酸788-1192，genbankid:af461811.1)；cd28衍生的铰链、跨膜和细胞内信号传导结构域(核苷酸562-882，genbanknm006139.3)；cd137衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸901-1026，genbanknm001561.5)；cd3ζ衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸299-634，genbanknm000734.3)；以及终止密码子tga。

nkg2d-28(h)ox40zcar(第3代)是通过连接以下产生的：cd8α的信号序列结构域(核苷酸890-952，genbanknm001768.6)；nkg2d的胞外结构域(核苷酸788-1192，genbankid:af461811.1)；cd28衍生的铰链、跨膜和细胞内信号传导结构域(核苷酸562-882，genbanknm006139.3)；cd134衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸733-840，genbankab590584.1)；cd3ζ衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸299-634，genbanknm000734.3)；以及终止密码子tga。

nkg2d-28(h)ox40lzcar(第3代)是通过连接以下产生的：cd8α的信号序列结构域(核苷酸890-952，genbanknm001768.6)；nkg2d的胞外结构域(核苷酸788-1192，genbankid:af461811.1)；cd28衍生的铰链、跨膜和细胞内信号传导结构域(核苷酸562-882，genbanknm006139.3)；cd252衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸141-206，genbanknm003326.4)；cd3ζ衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸299-634，genbanknm000734.3)；以及终止密码子tga。

nkg2d-aaa-28(h)ox40lzcar(第3代)是通过连接以下产生的：cd8α的信号序列结构域(核苷酸890-952，genbanknm001768.6)；nkg2d的胞外结构域(核苷酸788-1192，genbankid:af461811.1)；aaa(三丙氨酸)；cd28衍生的铰链、跨膜和细胞内信号传导结构域(核苷酸562-882，genbanknm006139.3)；cd252衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸141-206，genbanknm003326.4)；cd3ζ衍生的细胞内信号传导结构域(核苷酸299-634，genbanknm000734.3)；以及终止密码子tga。

用于根据本发明实施方案的嵌合抗原受体(car)及其制备方法的结构域的序列表总结于下表4。

[表4]

病毒的产生和基因转移

为了制备vsvg假型慢病毒，在dmem培养基中培养的293t细胞与例如pcdh1-mscv-cd16-构建体-ef1-copgfp载体、ef1a-nkg2d构建体载体、pcdh1-mscv-ef1-copgfp对照载体、或ef1a-gfp对照载体(用于使用空载体制备mock感染病毒)等各种类型的载体；以及基于hiv的ppackh1慢病毒包装试剂盒(systembiosciences)共转染。为此，使用了lipofectamine2000试剂(invitrogen，carlsbad，ca)。各种类型的cd16v构建体如下：cd16v-zcar,cd16v-bbzcar,cd16v-ox40zcar,cd16v-ox40lzcar,cd16v-zox40l,cd16v-28zcar,cd16v-28(h)zcar,cd16v-bbox40zcar,cd16v-bbox40lzcar,cd16v-ox40bbzcar,cd16v-28bbzcar,cd16v-28ox40zcar,cd16v-28ox40lzcar,cd16v-28(h)bbzcar,cd16v-28(h)ox40zcar,cd16v-28(h)ox40lzcar。此外，各种类型的nkg2d构建体如下：nkg2d-zcar,nkg2d-bbzcar,nkg2d-ox40zcar,nkg2d-zox40lcar,nkg2d-28zcar,nkg2d-28(h)zcar,nkg2d-bbox40zcar,nkg2d-bbox40lzcar,nkg2d-ox40bbzcar,nkg2d-28bbzcar,nkg2d-28ox40zcar,nkg2d-28ox40lzcar,nkg2d-28(h)bbzcar,nkg2d-28(h)ox40zcar,nkg2d-28(h)ox40lzcar,nkg2d-aaa-28(h)ox40lz。通过在烧瓶中用以下转染80％致密的hek293t细胞来制备各个慢病毒：与ppackh1慢病毒包装质粒一起的各种类型的cd16v构建体表达载体、各种类型的nkg2d构建体表达载体或对照质粒。6小时后，培养基用含10％fbs的dmem培养基替换。在转染48小时后，收集含有慢病毒的条件培养基，接着用0.45μm的过滤单元(milliopore，billerica，ma，usa)过滤来去除细胞碎片。通过使用amiconfilter(millipore)在4℃下以3000rpm离心20分钟以将含有病毒的病毒上清液浓缩约50倍。将浓缩的病毒储存于-80℃。

对于慢病毒感染，使用含1％人血浆的cellgro(cellgenix)将指数生长期的nk92mi细胞调节至1x10⁶个细胞/ml的浓度，然后在8μg/ml聚凝胺(polybrene)的存在下添加50至100moi的慢病毒上清液，接着以1800g离心90分钟。离心后，将细胞置于37℃、5％co2条件下的加湿培养箱中48小时。其后，用rpmi-1640清洗细胞两次，然后置于含10％fbs的rpmi-1640中供将来使用。对照细胞仅用载体转导。

含有cd16v或nkg2d的受体的表达的检测

用facs缓冲液清洗两次cd16vcar转导的nk92mi细胞、nkg2dcar转导的nk92mi细胞、对照载体转导的nk92mi(nk92mi-mock)或nk-92mi亲本细胞，使用7-aad(beckmancoulter)、抗cd3、抗cd56和抗cd16(bdbiosciences)mab染色清洗过的细胞。使用bdlsrfortessa测定染色细胞的表达比率和平均荧光强度(mfi)。

使用nkg2d构建体的转导效率通过流式细胞术分析cd3-cd56+细胞中表达nkg2d的细胞来确定。首先，将nk92mi细胞以单线态进行门控，然后以7aad-和cd3-cd56+进行门控。cd16构建体的转化效率通过流式细胞术分析cd3-cd56+细胞中表达gfp和cd16的细胞来确定。

钙黄绿素释放细胞毒性试验

在37℃下用3μm钙黄绿素-乙酰氧基甲酯(calcein-am；分子探针)标记靶细胞1小时。清洗后，将标记的靶细胞以1x10⁴细胞每孔分配至96孔板中。收集nk92mi细胞、洗涤，然后在具有或不具有不同浓度的利妥昔单抗的条件下，添加不同e/t(效应物对靶)比的nk92mi细胞。作为独立于利妥昔单抗的对照组，使用抗人抗体(sigmaaldrich)。2小时后，以2000rpm离心板3分钟，并且收集100μl上清液，使用荧光酶标仪(fluorescencemicroplatereader)(victor3，perkinelmer)在485nm激发波长和535nm发射波长下进行钙调绿素释放的测定。通过下式计算具体的钙黄绿素释放量：特异性裂解百分比＝(试验释放-自发释放)x100/(最大释放-自发释放)。对于最大裂解，使用1％tritonx-100。

实施例2：表达含有ox40配体(cd252)的嵌合抗原受体(car)的nk92mi细胞对cd20阳性淋巴瘤细胞的细胞毒性的评估

含有与共刺激基序相关的cd16v的嵌合抗原受体的转导与表达

fcrg3a(cd16)的v158变体(多态性)是一种高亲和力的免疫球蛋白fc受体并且认为在抗体治疗中具有良好的效果。本发明人制备了fcrg3a(cd16)的v158变体，并将制备的变体与cd8α的铰链和跨膜结构域；t细胞刺激分子，即cd3ζ；以及例如cd28、4-1bb、ox-40和ox-40配体等不同的辅助刺激分子的细胞内结构域以其各种组合进行结合(表1)。将所制备的含有cd16v的嵌合抗原受体(例如，cd16v-zcar(第1代)、cd16v-28zcar(第2代)、cd16v-bbzcar(第2代)、cd16v-ox40zcar(第2代)或cd16v-28ox40lzcar(第3代)通过包含mscv启动子的慢病毒载体在nk92mi细胞中表达。我们通过使用单克隆小鼠抗人抗体检测人cd16确认了各个car在nk92mi细胞表面上的表达。通过涉及流式细胞术分析的重复实验，已证实car以超过90％的效率在nk92mi细胞中转导(图1a)。本文使用的慢病毒的量等于50以上的感染复数(moi)。

表达与cd252(ox40配体)相结合的cd16v受体的nk92mi细胞对cd20阳性淋巴瘤的肿瘤杀伤的效果增加

为了确定根据本发明的遗传修饰是否会诱导癌细胞死亡的增加，通过钙黄绿素-am释放试验评价用空载体转导的nk92mi细胞和表达含有cd16受体的nk92mi细胞对cd20阳性淋巴瘤细胞(ramos细胞)的细胞毒性。

在淋巴瘤细胞试验之前，将k562人红白血病细胞系用作标准对照来评价转导的nk92mi细胞的内在细胞杀伤能力(即细胞毒性)。通过使用具有50以上的感染复数(moi)的慢病毒转导，根据本发明的各个car(cd16v-zcar(第1代)、cd16v-28zcar(第2代)、cd16v-bbzcar(第2代)、cd16v-ox40zcar(第2代)或cd16v-28ox40lzcar(第3代)在90％以上的nk92mi细胞中高水平表达(图1a)。

已证明，表达根据本发明的car的nk92mi细胞对k562的细胞毒性与用空载体转导的对照组(mock)的细胞毒性相似。这意味着nk92mi细胞对靶的固有细胞毒性不通过遗传修饰本身引起的副作用而增加(图1b)。在图1b中，作为效应细胞(effectorcell)的nk92mi细胞的数量与作为靶细胞(targetcell)的k562细胞的数量之比表示为5:1、2.5:1、1:1和0.5:1。

为了评估各种辅助刺激分子如何在体外影响表达含有cd16v受体的nk92mi细胞的抗原特异性抗肿瘤活性，对转导的nk92mi细胞和癌细胞(b细胞淋巴瘤细胞系，即ramos)进行共培养，然后根据钙黄绿素-am释放试验评估癌细胞的裂解(图1c)。在图1c中，nk92mi细胞(效应细胞)的数量与ramos细胞(靶细胞)的数量之比表示为5:1、2.5:1、1:1和0.5:1。已示出由于nk92mi不表达cd16，利妥昔单抗并不显著增加nk-92mi介导的细胞毒性。

如图1c所示，我们发现，在没有利妥昔单抗的情况下，相比于由对照(mock)(即用仅含gfp的载体转导的nk-92mi细胞)诱导的细胞毒性，根据本发明的各种car的表达并不显著增加nk-92mi介导的细胞毒性。

cd16v-zcar(第1代)，其先前显示在各种car应用中增强细胞毒性，用作阳性对照。为了增加含有cd16v的受体的细胞毒性，本发明人将cd28、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)或cd252(ox40配体)引入cd16v-z-car中。在2小时体外细胞毒性检测中，表达cd16v-zcar(第1代)、cd16v-28zcar(第2代)、cd16v-bbzcar(第2代)、cd16v-ox40zcar(第2代)或cd16v-28ox40lzcar(第3代)的nk-92mi细胞在利妥昔单抗的存在下表现出高细胞毒性，并且效应细胞与靶细胞比为5:1和2.5:1。其中，特别是包括ox40配体的第3代car，即cd16v-28ox40lzcar，相比于其他car，表现最高的细胞毒性(图1c)。

为了探讨含有ox40配体的第2代car是否可增强nk92mi细胞的抗癌活性，制备cd16v-ox40lzcar并且对其进行细胞毒性的评价。当使用慢病毒载体用cd16-ox40lz转导nk92mi细胞时，cd16v-ox40lzcar未表达(图1d)。即使在利妥昔单抗的存在下，也未表现由cd16v-ox40lzcar介导的对ramos细胞的细胞毒性(图1e)。因此，本发明人注意到ox40配体是ii型蛋白、而与ox40配体连接的cd3ζ是i型蛋白的事实，并且通过改变上述两个结构域的顺序来制备具有在n-末端的cd3ζ和在c末端的ox40配体cd16v-zox40lcar。当使用具有mscv启动子的慢病毒载体用cd16v-zox40l转导nk92mi细胞时，与cd16v-ox40lz相比，nk92mi细胞有效表达cd16v-ox40lzcar(图1f)。此外，作为具有其中引入cd16v-zox40l的第2代car的抗癌活性的评估结果，在利妥昔单抗的存在下，在效应细胞与靶细胞之比为10:1、5:1和2.5:1时，显示出对ramos细胞的高细胞毒性(图1g)。已确认，除含有ox40配体的cd16v-28ox40lzcar(第3代)外，cd16-zox40lcar(第2代)也具有优于用作阳性对照的cd16v-zcar的抗癌活性。

cd16v-bbox40lzcar的效力的评估

通过将ox40配体引入基于cd137(41bb)信号传导结构域的car中，对nk92mi细胞进行表达和细胞毒性的评估。cd16v-bbzcar(第2代)和cd16v-bbox40lzcar(第3代)都在nk92mi细胞中高水平表达(图2a)。当利妥昔单抗不存在于体外细胞毒性试验中时，cd16v-z、cd16v-bbz和cd16v-bbox40lz都对ramos细胞表现出低细胞毒性。另一方面，在利妥昔单抗的存在下，与ox40配体组合的cd16v-bbox40lz在效应细胞与靶细胞的甚至任何比例中都表现出最高细胞毒性(图2b)。

cd16v-28ox40lzcar与其他car之间的效力的比较

接下来，本发明人比较了表达cd16v-28ox40lzcar的nk92mi细胞的细胞毒性和表达具有其他细胞内信号传导结构域的第3代car的nk92mi细胞的细胞毒性。本实验中使用的第3代car(cd16v-28ox40lzcar、cd16v-28ox40zcar和cd16v-28bbzcar)都已证明在nk92mi细胞中高水平表达(图3a)。

在比较了根据本发明的各种第3代car(即第3代嵌合抗原受体)的nk细胞激活效力后，在图3b中总结了其结果。如图3b所示，当不存在利妥昔单抗时，这些car全都对ramos细胞表现出低细胞毒性，并且细胞毒性程度全部相似。另一方面，在利妥昔单抗的存在下，cd16v-28ox40lzcar、cd16v-28ox40zcar和carcd16v-28bbz都显示出对ramos细胞的高细胞毒性。其中，特别是含有ox40配体的cd16v-28ox40lzcar表现出最优异的细胞毒性(图3b)。

含有在铰链具有cd28的ox40配体的第3代car的效力的评估

为了使表达nk细胞的car在最优化的条件下识别癌细胞抗原，不仅癌细胞抗原识别受体本身是重要的，而且抗原特异性受体和细胞膜之间的铰链序列和组成的识别也是重要的。取决于靶分子，可需要不同地设计铰链序列和组成。

在上述实验中使用的car使用cd8α的片段作为间隔区结构域(“铰链”)。与此相比，评估了当在铰链处使用cd28片段时car的细胞毒性的变化并且在图4中总结了其结果。本发明人已生产了包括cd16v的胞外结构域(胞外域)和cd28的铰链的慢病毒载体。在含有cd28片段作为间隔区的第3代car中，将cd28衍生的铰链、跨膜和细胞内信号传导结构域与cd134(ox40)、cd137(4-1bb)或ox40配体(cd252)的信号传导模块(signalingmodule)连接。使用慢病毒载体在nk92mi细胞上表达如此生产的第3代car。已证明，转导的nk92mi细胞可以高水平分别表达上述第3代car，即cd16v-28(h)bbzcar、cd16v-28(h)ox40zcar或cd16v-28(h)ox40lzcar(图4a)。

如图4b所示，当利妥昔单抗不存在时，cd16v-28(h)bbzcar、cd16v-28(h)ox40zcar和cd16v-28(h)ox40lzcar都不表现细胞毒性。另一方面，在利妥昔单抗的存在下，cd16v-28(h)bbzcar、cd16v-28(h)ox40zcar和cd16v-28(h)ox40lzcar都表现出高细胞毒性。其中，特别是包含ox40配体的cd16v-28(h)ox40lzcar具有最高的细胞毒性。

上述实验结果表明，当由本发明人发现的、特别包含ox40配体作为细胞内信号传导结构域的新car在自然杀伤细胞中表达时，可以获得优异的抗肿瘤效果。

实施例3：表达含有ox40配体(cd252)的nkg2d嵌合抗原受体(nkg2d-car)的nk92mi细胞对人乳腺癌细胞和肺癌细胞的细胞毒性的评估

包含与共刺激基序相关联的nkg2d的嵌合抗原受体的转导与表达

本发明人合成了人nkg2d基因，并且以各种组合将其与cd8α的铰链和跨膜结构域；以及t细胞刺激分子cd3ζ的胞内结构域和包括cd28、4-1bb、ox-40和ox-40配体的辅因子相结合来显著提高t细胞或nk细胞的活性(表3)。使用慢病毒载体在nk92mi细胞中表达这样的nkg2dcar构建体。本发明人通过使用单克隆小鼠抗人抗体检测人nkg2d的方法来鉴定nk92mi细胞中各个nkg2dcar的表面表达。通过涉及流式细胞术的重复实验，已证明car以70％以上的效率在nk92mi细胞中转导。

表达含有多种辅助刺激信号传导结构域的nkg2d受体的nk92mi细胞对mcf7乳腺癌细胞系的肿瘤杀伤的效果增加

为了研究遗传修饰导致的杀伤活性的变化，通过钙黄绿素-am释放试验比较了表达nkg2dcar的nk-92mi细胞对mcf7乳腺癌细胞的细胞毒性。

为了评价各种辅助刺激信号传导结构域对表达nkg2dcar的nk-92mi细胞的抗原特异性抗肿瘤效果的体外效果，将转导的nk-92mi细胞和癌细胞共培养，接着通过钙黄绿素-am释放测定肿瘤细胞的裂解。根据以前的研究，已知将辅助刺激信号传导结构域添加至嵌合受体可增加t淋巴细胞和nk淋巴细胞的细胞毒性。为了提高nkg2dcar的细胞毒性，本发明人将最公知的三个辅因子即cd28、cd134(ox-40)和cd137(4-1bb)的信号传导结构域引入nkg2dcar中。含有引入的nkg2d-zcar(第1代)、nkg2d-28zcar、nkg2d-bbzcar、nkg2d-ox40zcar(第2代)的nk92mi细胞显示出nkg2d的有效表达(图5a)。进行2小时体外细胞毒性分析，其证明表达nkg2d-zcar(第1代)、nkg2d-28zcar、nkg2d-bbzcar和nkg2d-ox40zcar(第2代)的nk-92mi细胞对mcf7乳腺癌细胞表现出细胞毒性。然而，添加cd134(ox-40)或cd137(4-1bb)信号传导结构域至nkg2d-z第1代car的主链中未表现出比nkg2d-zcar(第1代)更高的细胞毒性。通过包括nkg2d-28zcar(第2代)的nk-92mi细胞的癌细胞杀伤优于阳性对照--表达nkg2d-zcar(第1代)的nk-92mi细胞(图5b)。

表达含有cd28胞内结构域的nkg2d受体的nk92mi细胞对mcf7乳腺癌细胞系的肿瘤杀伤的效果增加

已知第3代car增加抗肿瘤活性。在生理学的t细胞应答中，最佳的淋巴细胞激活需要一个或多个与例如cd28等辅助刺激分子相结合的辅因子受体。在辅因子受体中，最重要的受体为cd137(4-1bb)和ox40(cd134)，其为肿瘤坏死因子(tnfr)的成员。

为了研究表达nkg2dcar(第3代)的nk-92mi细胞中不同辅因子的效果，本发明人生产了nkg2d-28ox40zcar(第3代)和nkg2d-28bbzcar(第3代)。使用慢病毒载体在nk92mi细胞中表达nkg2dcar(第3代)构建体。转导的nk92mi细胞高效表达含有第3代car的各种nkg2d受体(图6a)。与用对照载体转导的nk92mi细胞相比，表达各种nkg2dcar(第3代)的nk92mi细胞在体外有效杀伤mcf7细胞。然而，第3代nkg2d-28ox40zcar和nkg2d-28bbzcar，其各自在nkg2d-28zcar(第2代)主链中包含有cd134或cd137辅助刺激信号传导结构域，未表现出比nkg2d-zcar(第1代)更高的细胞毒性(图6b)。

nkg2d-aaa-28(h)ox40lzcar(第3代)与其它受体的比较

为了评价cd252(ox40配体)辅助刺激信号传导结构域的效果，将ox40配体的信号传导结构域融合至nkg2d-28zcar(第2代)的主链，从而构建nkg2d-28(h)ox40lzcar(第3代)。在肿瘤杀伤试验中，通过nkg2d-28(h)ox40lzcar(第3代)诱导的对mcf7细胞的肿瘤特异性细胞毒性与nkg2d-zcar(第1代)相比大幅增强，然而，其实质上与nkg2d-28zcar(第2代)相似(图7b)。

为了最佳的cart细胞识别，不仅肿瘤抗原识别受体本身是重要的，而且抗原特异性受体和细胞膜之间的铰链和接头序列也是重要的。本实验中，分析了间隔区对nkg2d-28(h)ox40lzcar(第3代)的功能的附加影响。本发明人已在nkg2d胞外结构域和cd28铰链之间引入了aaa(三丙氨酸)接头。使用慢病毒载体在nk92mi细胞中表达包含在此引入的aaa接头的nkg2d-aaa-28(h)ox40lzcar(第3代)(图7a)。本实验中，将通过表达nkg2d-aaa-28(h)ox40lzcar(第3代)的nk-92mi细胞的mcf7细胞杀伤与通过表达nkg2d-zcar(第1代)、nkg2d-28zcar(第2代)或nkg2d-28(h)ox40lzcar(第3代)的nk-92mi细胞的mcf7细胞杀伤相比较。特别地，在nkg2d胞外结构域和nkg2d-28(h)ox40lzcar(第3代)的cd28铰链之间引入aaa接头的引入，导致比无aaa的亲本nkg2d-28(h)ox40lzcar(第3代)、nkg2d-zcar(第1代)和/或nkg2d-28zcar(第2代)更好的靶细胞杀伤(图7b)。

表达nkg2d-aaa-28(h)ox40lzcar(第3代)的nk92mi细胞对肺癌细胞系的肿瘤杀伤效果的增加

为了评价用nkg2d-aaa-28(h)ox40lzcar(第3代)转导的nk92mi细胞是否可识别肺癌细胞中的nkg2d配体，使用nkg2d配体阳性肿瘤细胞(h1299和h1944)作为包含nkg2d-aaa-28(h)ox40lcar(第3代)的nk92mi细胞的靶。转导的nk92mi细胞有效表达nkg2d-zcar(第1代)或nkg2d-aaa-28(h)ox40lcar(第3代)(图8a)。接着，评价h1299和h1944细胞中nkg2d配体的表达。本发明人通过流式细胞术分析鉴定了h1299和h1944细胞中检测到的nkg2d配体的表达(图8b)。如图8c所示，包含nkg2d-aaa-28(h)ox40lcar(第3代)的nk92mi细胞能够比作为对照组的nk92mi细胞和表达nkg2d-zcar(第1代)的nk92mi细胞更有效地在体外杀伤表达nkg2d配体的靶细胞。此外，由于h1299和h1944细胞不被通过对照空载体转导的nkg2d非表达的nk92mi细胞所杀伤，因此明显确证了靶细胞杀伤的特异性。

<110>株式会社绿十字细胞治疗

<120>嵌合抗原受体和表达其的自然杀伤细胞

<130>16p10085

<150>kr10-2016-0181119

<151>2016-12-28

<160>93

<170>kopatentin3.0

<210>1

<211>618

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>cd16核苷酸

<400>1

atgtggcagctgctcctcccaactgctctgctacttctagtttcagctggcatgcggact60

gaagatctcccaaaggctgtggtgttcctggagcctcaatggtacagggtgctcgagaag120

gacagtgtgactctgaagtgccagggagcctactcccctgaggacaattccacacagtgg180

tttcacaatgagagcctcatctcaagccaggcctcgagctacttcattgacgctgccaca240

gtcgacgacagtggagagtacaggtgccagacaaacctctccaccctcagtgacccggtg300

cagctagaagtccatatcggctggctgttgctccaggcccctcggtgggtgttcaaggag360

gaagaccctattcacctgaggtgtcacagctggaagaacactgctctgcataaggtcaca420

tatttacagaatggcaaaggcaggaagtattttcatcataattctgacttctacattcca480

aaagccacactcaaagacagcggctcctacttctgcagggggctttttgggagtaaaaat540

gtgtcttcagagactgtgaacatcaccatcactcaaggtttggcagtgtcaaccatctca600

tcattctttccacctggg618

<210>2

<211>206

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cd16氨基酸

<400>2

mettrpglnleuleuleuprothralaleuleuleuleuvalserala

151015

glymetargthrgluaspleuprolysalavalvalpheleuglupro

202530

glntrptyrargvalleuglulysaspservalthrleulyscysgln

354045

glyalatyrserprogluaspasnserthrglntrpphehisasnglu

505560

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65707580

valaspaspserglyglutyrargcysglnthrasnleuserthrleu

859095

seraspprovalglnleugluvalhisileglytrpleuleuleugln

100105110

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115120125

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130135140

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145150155160

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165170175

glyserlysasnvalsersergluthrvalasnilethrilethrgln

180185190

glyleualavalserthrileserserphepheproprogly

195200205

<210>3

<211>618

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>cd16v核苷酸

<400>3