本发明涉及生物
技术领域：
，特别是一种通过盐胁迫促进罗汉果悬浮细胞生长及提升甜苷v含量的方法。
背景技术：
：罗汉果甜甙ⅴ，又称罗汉果甜苷，是葫芦科罗汉果属罗汉果的主要甜味成分，其甜度是蔗糖的350倍，目前已鉴定出七种单体成分，其中以罗汉果甜甙ⅴ及赛门苷ⅰ的甜度最强。罗汉果甜甙ⅴ具有清热润肺，利咽开音，润肠通便等药用功效；同时，罗汉果甜甙ⅴ还具有味道新颖、口味纯正等特点，从而使其深受人们的喜爱，是肥胖症、高血压、糖尿病患者等特殊人群最适宜的甜味剂和保健品，具有广泛的应用价值。目前，获取罗汉果甜甙ⅴ的方法主要是以天然罗汉果为原料，并通过加热等方法提取制备而成。但是，天然罗汉果中的固有罗汉果甜甙ⅴ成分极低，现有技术对于罗汉果的利用率以及罗汉果甜甙ⅴ的提取率并不高，造成了极大的原料浪费，同时也不能满足日益增长的市场需求。植物细胞悬浮培养是指植物的一部分组织在离体的条件下，经激素诱导控制形成愈伤组织或其他易于分散的组织，再经其接种到液体培养基中，培养后形成均一液体悬浮培养体系的一种技术。因为细胞的全能性，所以原则上可以采用植物的任何部分外植体，在适当的培养基上进行愈伤组织的诱导进而形成悬浮培养体系，这也是植物悬浮培养体系建立的最主要方式。目前获取罗汉果甜甙ⅴ的方法主要是以天然罗汉果为原料，并通过加热等方法提取制备而成，这些天然产物绝大部分属于植物的次生代谢产物，在植物体内一般含量较低，直接从植物中提取不但占用大片的耕地，而且还可能造成一些珍贵稀有植物种类的灭绝。通过植物细胞培养技术生产目的次级代谢产物，是提高天然植物中目标成分含量的有效手段之一。近年来受到广泛关注，细胞培养正逐步替代这些植物的传统农业种植方式，缓解工业中次生代谢物的生产压力。细胞悬浮培养具有繁殖速度快、培养规模大和提供大量均匀一致植物细胞培养物的特点。盐胁迫通常会对植物造成离子失衡、氧化胁迫与渗透胁迫等伤害，盐浓度过高甚至会导致植物死亡。在适应盐胁迫过程中，植物逐渐进化出离子选择性吸收/外排、na+区室化、利用抗氧化系统解毒，以及积累渗透保护物质等一系列代谢机制和网络调控体系。植物悬浮细胞应对盐胁迫，对na+的选择性吸收/外排和区室化对植物响应盐胁迫具有重要作用。胁迫条件下罗汉果悬浮细胞最明显的生理响应是生物量和罗汉果甜苷v，它们是细胞一系列生理和生化响应变化的最终结果，是由代谢网络的变化所带来的。而引起代谢网络变化的因素很多，可能是由于代谢竞争途径的阻断、代谢途径关键酶活的变化、代谢调控因子的调控、胞内氧化应激状态的变化、或关键基因表达变化等因素造成的。na+是造成植物盐害及产生盐渍生境的主要离子，k+是植物生长发育所必需的大量元素和重要的渗透调节组分。然而由于这两种离子的半径和水合能相似，na+对k+吸收呈现明显的竞争性抑制作用。因此对于钾钠离子选择性吸收程度的高低是影响植物生长能力的一个重要因素。国内外在树木对盐分的生理生化、分子生物学响应机制方面做了大量研究，但目前尚无关于盐胁迫和钾钠比对罗汉果悬浮细胞方面的报告。因此，有必要对罗汉果悬浮细胞在不同比例的钾钠比条件下其生长、罗汉果甜苷合成、金属离子以及有机酸变化情况等进行评价和比较，以期为后续放大培养和产物合成的应用提供参考。技术实现要素：本发明的目的是寻找一种合适的钾钠比浓度，从而促进罗汉果悬浮细胞生长及甜苷v积累。所述方法不仅有效地缩短了细胞的生产培养周期，还提高了罗汉果悬浮细胞的生物量，同时促进罗汉果悬浮细胞中罗汉果甜苷v合成，明显提高生产效益。本发明发明人发现，在以初代罗汉果悬浮细胞体系培养成熟罗汉果悬浮细胞过程中，在初期培养基中保持钾离子含量不变，通过控制培养基中钾钠比，能不同程度地提高罗汉果悬浮细胞的生物量，同时加快罗汉果悬浮细胞中罗汉果甜苷v的合成速率。本发明的内容可以通过以下技术方案来实现：1.一种通过盐胁迫促进罗汉果悬浮细胞生长及提升甜苷v含量的方法，在以初代罗汉果悬浮细胞体系培养成熟罗汉果悬浮细胞过程中控制体系中钾离子浓度为100～2000mg/kg，钾钠离子浓度比为5～20:1。优选的，所述钾离子浓度为1400mg/kg。优选的，所述钾钠离子浓度比为15:1。优选的，第0～8天开始控制所述钾钠离子浓度比。优选的，第1天开始控制所述钾钠离子浓度比。优选的，使用硫酸钠控制所述钾钠离子浓度比。优选的，培养第15～25天收获所述罗汉果悬浮细胞。优选的，培养第21天收获所述罗汉果悬浮细胞。2.一种通过盐胁迫促进罗汉果悬浮细胞生长及提升甜苷v含量的方法，所述初代罗汉果悬浮细胞体系通过以下步骤获得：步骤一：取罗汉果的种胚，在含有蔗糖25～35g/l、6-苄氨基腺嘌呤0.05～0.15mg/l、萘乙酸2～6mg/l、肌醇50～150mg/l、琼脂4～6g/l、ph范围为5.9～6.0的b5固体培养基上继代培养，选取连续继代3～5次的胚性愈伤组织；步骤二：将步骤一得到的胚性愈伤组织以接种量25～75g/l转接到含有蔗糖20～40g/l、6-苄氨基腺嘌呤0.05～0.15mg/l、萘乙酸3～5mg/l、肌醇50～150mg/l、ph范围为5.9～6.0的b5液体培养基中，并在转速为80～150r/min，培养温度为24～26℃、黑暗的摇床中培养，得初代罗汉果悬浮细胞体系。优选的，所述步骤一继代次数为4次。本发明克服了以下难题技术：保持培养基中钾离子含量不变，添加不同含量的硫酸钠来控制培养基中钾钠比，添加后单位时间内罗汉果悬浮细胞干重有所增加，比生长速率有所提高，而且罗汉果甜苷v的合成量有所增加，合成速率也有所提高。与现有技术比较，本发明具有以下优点：1.本发明以罗汉果种胚为培养原料，分化传代能力更强更稳定，有利于培养得到生长力旺盛、状态稳定均有的罗汉果愈伤组织。2.采用本发明方法培养得到的罗汉果细胞培养体系，罗汉果悬浮细胞生物量明显提高，且罗汉果甜苷v产量也明显提高。3.采用本发明方法培养得到的罗汉果细胞悬浮体系，细胞比生长速率高，培养周期时间短，降低了操作维护的难度，能更好地满足市场化生产需求。4.本发明方法以人工方式调节罗汉果悬浮细胞生物量和罗汉果甜苷v的生产过程，有利于产品的质量控制管理。附图说明：图1罗汉果悬浮细胞生长曲线图2不同处理条件对罗汉果悬浮细胞干重、比生长速率的影响图3罗汉果悬浮细胞培养过程中有机酸的变化图4mva途径和mep途径具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用于限制本发明的范围。实施例1步骤一：取罗汉果的成熟种胚，在含有蔗糖25g/l、6-苄氨基腺嘌呤0.05mg/l、萘乙酸2mg/l、肌醇50mg/l、琼脂4g/l、ph为5.9的b5固体培养基上继代培养，选取连续继代3次且生长旺盛、质地疏松、状态稳定均一的新鲜胚性愈伤组织；步骤二：将步骤一得到的新鲜胚性愈伤组织以接种量25g/l转接到含有蔗糖20g/l、6-苄氨基腺嘌呤0.05mg/l、萘乙酸3mg/l、肌醇50mg/l、ph为5.9的b5液体培养基中，并在转速为80r/min，培养温度为24℃、黑暗的摇床中培养，得初代罗汉果悬浮细胞体系。步骤三：以步骤二所得初代罗汉果悬浮细胞体系培养成熟罗汉果悬浮细胞；原培养基中钾钠比为25:1，控制钾离子浓度为720mg/kg，在培养过程中第0天补加硫酸钠，使培养基中钾钠离子浓度比为5:1；步骤四：在第9天、第12天和第15天，抽取罗汉果悬浮细胞，检测罗汉果悬浮细胞干重、培养基中有机酸含量和罗汉果甜苷v含量；步骤五：培养第15天收获罗汉果悬浮细胞。实施例2步骤一：取罗汉果的种胚，在含有蔗糖35g/l、6-苄氨基腺嘌呤0.15mg/l、萘乙酸6mg/l、肌醇150mg/l、琼脂6g/l、ph为6.0的b5固体培养基上继代培养，选取连续继代5次的胚性愈伤组织；步骤二：将步骤一得到的胚性愈伤组织以接种量75g/l转接到含有蔗糖40g/l、6-苄氨基腺嘌呤0.15mg/l、萘乙酸5mg/l、肌醇150mg/l、ph6.0的b5液体培养基中，并在转速为150r/min，培养温度为26℃、黑暗的摇床中培养，得初代罗汉果悬浮细胞体系。步骤三：以步骤二所得初代罗汉果悬浮细胞体系培养成熟罗汉果悬浮细胞；原培养基中钾钠比为25:1，控制钾离子浓度为700mg/kg，在培养过程中第0天补加硝酸钠，使培养基中钾钠离子浓度比为10:1；步骤四：在第9天、第12天和第15天，抽取罗汉果悬浮细胞，检测罗汉果悬浮细胞干重、培养基中有机酸含量和罗汉果甜苷v含量；步骤五：培养第21天收获罗汉果悬浮细胞。实施例3步骤一：取罗汉果的成熟种胚，在含有蔗糖30g/l、6-苄氨基腺嘌呤0.1mg/l、萘乙酸4.0mg/l、肌醇100mg/l、琼脂5.0g/l、ph范围为5.9的b5固体培养基上继代培养，选取连续继代4次且生长旺盛、质地疏松、状态稳定均一的新鲜胚性愈伤组织；步骤二：将步骤一得到的新鲜胚性愈伤组织以接种量50g/l转接到含有蔗糖30g/l、6-苄氨基腺嘌呤0.1mg/l、萘乙酸4.0mg/l、肌醇100mg/l、ph范围为5.9的b5液体培养基中，并在转速为110r/min，培养温度为25℃、黑暗的摇床中培养，得初代罗汉果悬浮细胞体系；步骤三：以步骤二所得初代罗汉果悬浮细胞体系培养成熟罗汉果悬浮细胞；原培养基中钾钠比为25:1，控制钾离子浓度为670mg/kg，在培养过程中第0天补加氯化钠，使培养基中钾钠离子浓度比为15:1；步骤四：在第9天、第12天和第15天，抽取罗汉果悬浮细胞，检测罗汉果悬浮细胞干重、培养基中有机酸含量和罗汉果甜苷v含量；步骤五：培养第25天收获罗汉果悬浮细胞。实施例4步骤一：取罗汉果的成熟种胚，在含有蔗糖30g/l、6-苄氨基腺嘌呤0.1mg/l、萘乙酸4.0mg/l、肌醇100mg/l、琼脂5.0g/l、ph范围为5.9的b5固体培养基上继代培养，选取连续继代4次且生长旺盛、质地疏松、状态稳定均一的新鲜胚性愈伤组织；步骤二：将步骤一得到的新鲜胚性愈伤组织以接种量50g/l转接到含有蔗糖30g/l、6-苄氨基腺嘌呤0.1mg/l、萘乙酸4.0mg/l、肌醇100mg/l、ph范围为5.9的b5液体培养基中，并在转速为110r/min，培养温度为26℃、黑暗的摇床中培养，得初代罗汉果悬浮细胞体系；步骤三：以步骤二所得初代罗汉果悬浮细胞体系培养成熟罗汉果悬浮细胞；原培养基中钾钠比为25:1，控制钾离子浓度为1400mg/kg，在培养过程中第3天补加磷酸钠，使培养基中钾钠离子浓度比为20:1。步骤四：在第9天、第12天和第15天，抽取罗汉果悬浮细胞，检测罗汉果悬浮细胞干重、培养基中有机酸含量和罗汉果甜苷v含量。步骤五：培养第20天收获罗汉果悬浮细胞。实施例5步骤一：取罗汉果的成熟种胚，在含有蔗糖30g/l、6-苄氨基腺嘌呤0.1mg/l、萘乙酸4.0mg/l、肌醇100mg/l、琼脂5.0g/l、ph范围为5.9的b5固体培养基上继代培养，选取连续继代2次且生长旺盛、质地疏松、状态稳定均一的新鲜胚性愈伤组织；步骤二：将步骤一得到的新鲜胚性愈伤组织以接种量50g/l转接到含有蔗糖30g/l、6-苄氨基腺嘌呤0.1mg/l、萘乙酸4.0mg/l、肌醇100mg/l、ph范围为5.9的b5液体培养基中，并在转速为110r/min，培养温度为25℃、黑暗的摇床中培养，得初代罗汉果悬浮细胞体系。步骤三：以步骤二所得初代罗汉果悬浮细胞体系培养成熟罗汉果悬浮细胞；原培养基中钾钠比为25:1，控制钾离子浓度为100mg/kg，在培养过程中第1天补加氯化钠，使培养基中钾钠离子浓度比为15:1；步骤四：在第9天、第12天和第15天，抽取罗汉果悬浮细胞，检测罗汉果悬浮细胞干重、培养基中有机酸含量和罗汉果甜苷v含量。步骤五：培养第30天收获罗汉果悬浮细胞。实施例6步骤一：取罗汉果的成熟种胚，在含有蔗糖30g/l、6-苄氨基腺嘌呤0.1mg/l、萘乙酸4.0mg/l、肌醇100mg/l、琼脂5.0g/l、ph范围为6.1的b5固体培养基上继代培养，选取连续继代5次且生长旺盛、质地疏松、状态稳定均一的新鲜胚性愈伤组织；步骤二：将步骤一得到的新鲜胚性愈伤组织以接种量50g/l转接到含有蔗糖30g/l、6-苄氨基腺嘌呤0.1mg/l、萘乙酸4.0mg/l、肌醇100mg/l、ph范围为6.1的b5液体培养基中，并在转速为110r/min，培养温度为27℃、黑暗的摇床中培养，得初代罗汉果悬浮细胞体系。步骤三：以步骤二所得初代罗汉果悬浮细胞体系培养成熟罗汉果悬浮细胞；原培养基中钾钠比为25:1，钾离子浓度为2000mg/kg，在培养过程中第3天补加醋酸钠，使培养基中钾钠离子浓度比为8:1；步骤四：在第9天、第12天和第15天，抽取罗汉果悬浮细胞，检测罗汉果悬浮细胞干重、培养基中有机酸含量和罗汉果甜苷v含量。步骤五：培养第16天收获罗汉果悬浮细胞。实施例7步骤一：取罗汉果的成熟种胚，在含有蔗糖30g/l、6-苄氨基腺嘌呤0.1mg/l、萘乙酸4.0mg/l、肌醇100mg/l、琼脂5.0g/l、ph范围为5.8的b5固体培养基上继代培养，选取连续继代3次且生长旺盛、质地疏松、状态稳定均一的新鲜胚性愈伤组织；步骤二：将步骤一得到的新鲜胚性愈伤组织以接种量50g/l转接到含有蔗糖30g/l、6-苄氨基腺嘌呤0.1mg/l、萘乙酸4.0mg/l、肌醇100mg/l、ph范围为6.0的b5液体培养基中，并在转速为110r/min，培养温度为24℃、黑暗的摇床中培养，得初代罗汉果悬浮细胞体系。步骤三：以步骤二所得初代罗汉果悬浮细胞体系培养成熟罗汉果悬浮细胞；原培养基中钾钠比为25:1，钾离子浓度为1000mg/kg，在培养过程中第8天补加亚磷酸钠，使培养基中钾钠离子浓度比为18:1；步骤四：在第9天、第12天和第15天，抽取罗汉果悬浮细胞，检测罗汉果悬浮细胞干重、培养基中有机酸含量和罗汉果甜苷v含量。步骤五：培养第19天收获罗汉果悬浮细胞。对比例1本对比例用于评价未控制钾钠离子浓度比培养基，即钾离子浓度为1400mg/kg，钾钠离子浓度比为25：1的技术方案与本发明技术方案取得的技术效果差异，具体步骤如下：1)取罗汉果的成熟种胚，在含有蔗糖30g/l、6-苄氨基腺嘌呤0.1mg/l、萘乙酸4.0mg/l、肌醇100mg/l、琼脂5.0g/l、ph范围为5.9～6.0的b5固体培养基上继代培养，选取连续继代4次且生长旺盛、质地疏松、状态稳定均一的新鲜胚性愈伤组织；2)将步骤1)得到的新鲜胚性愈伤组织以接种量50g/l转接到含有蔗糖30g/l、6-苄氨基腺嘌呤0.1mg/l、萘乙酸4.0mg/l、肌醇100mg/l、ph范围为6.0的b5液体培养基中，并在转速为110r/min，培养温度为26℃、黑暗的摇床中培养，得初代罗汉果悬浮细胞体系。3)以步骤2)所得初代罗汉果悬浮细胞体系培养成熟罗汉果悬浮细胞；在培养过程中第0天不加钠盐为空白对照；4)在第9天、第12天和第15天，抽取罗汉果悬浮细胞，检测罗汉果悬浮细胞干重、培养基中有机酸含量、罗汉果甜苷v含量和有机酸。5)培养第21天收获罗汉果悬浮细胞。表1不同实施例胞外钾钠离子浓度汇总表单位：mg/kg实施例1实施例2实施例3实施例4实施例5实施例6实施例7对比例1k+7207006701400100200010001400na+1447045406.72505632k+：na+5:110：115：120：115：18：118：125：1理化指标1.罗汉果悬浮细胞生长比较1)实验方法将培养液摇匀后倒入布氏漏斗中进行真空抽滤，用超纯水冲洗细胞3次，至滤纸不再滴水为止。收集抽滤后的细胞，称量其鲜重，于60℃烘干，称其干重，计算出细胞比生长速率。2)结果见图1、图2从图1可以看出，罗汉果悬浮细胞培养的生长周期为30天左右。在培养的前3天，细胞生长缓慢，有明显的延滞期，3天后，生物量迅速增加，即为对数生长期，第21天的干重达到最高值，为14.4g/l，为培养初期的7倍左右。21天后，由于营养物质的不足，细胞生长受到限制，干重开始下降。罗汉果甜苷v积累大致和细胞生长是同步的，最大值为0.3986mg/gdcw。从比生长速率来看，前9天罗汉果悬浮细胞的比生长速率一直在升高，但是第九天后其比生长速率急剧下降，故为了保证罗汉果悬浮细胞一直保持在一个较高的比生长速率，只需要考虑在第9天、第12天和第15天是其相对应的干重、比生长速率和罗汉果甜苷v的含量即可。这样的方法大大缩短了培养时间，方便实验的进程。表2不同处理条件对罗汉果悬浮细胞干重的影响单位：g/l由表2可知，生物量的高低是反映植物综合抗盐能力的指标。各条件处理后罗汉果悬浮细胞生长情况列于表2。由表2可知，当初期培养基中k+：na+低于20:1时，罗汉果悬浮细胞生物量都高于对照，且随着比例的增加而增加，当k+：na+为15:1，细胞干重在第15天时达到最大值11.663g/l，是对照的2倍左右。而初期培养基中k+：na+超过20:1时，罗汉果悬浮细胞生长受到抑制，第15天的生物量最低仅为6.020g/l。k+：na+和植物细胞体内水分运输机制有关，有文献提出盐分胁迫对植物的原初直接效应的表现，即认为在盐分胁迫期间，生长是与水分供应相关。在胁迫条件下细胞为了抵御不利的外界条件环境，会消耗额外的蔗糖，用于细胞的维护损伤修复、离子转运以及产物的合成等。表3不同处理条件对罗汉果悬浮细胞比生长速率的影响由表3可知，初期培养基中不同k+：na+的罗汉果悬浮细胞相比较于空白对照来说比生长速率均会保持增长；当k+：na+比小于20:1时，随着初期培养基中k+：na+比的增加，不同条件下的细胞比生长速率逐渐增加；对于同一个k+：na+比条件下，15d的比生长速率均高于12d的比生长速率，而空白对照呈下降趋势。2.罗汉果甜苷v含量比较1)实验方法将悬浮培养细胞用去离子水冲洗3次，放在70℃烘干后，用碾钵将其捣碎后先用1:10甲醇浸提，放于110rpm摇床上振荡3h，之后超声提取40min后，取上清浓缩至1ml，用0.22μm的滤膜过滤后，用高校液相色谱进行检测。高效液相色谱条件：流速1.0ml/min、流动相：水：乙腈＝77:23，柱温30℃、检测波长203nm。2)结果：不同处理条件对罗汉果甜苷v的影响结果见表4。表4不同处理条件对罗汉果甜苷v的影响单位：mg/gdcw由表4可知，与对比例1相比较，实施例1～7的罗汉果甜苷v含量均明显提高，和干重的增加趋势大致一致，这说明通过在罗汉果悬浮细胞培养体系初期改变培养基中钾钠比可以有效提高罗汉果甜苷v的产量。其原因可能是盐胁迫使植物细胞为了适应环境，而做出一系列的应激反应。当k+：na+浓度为15:1时，罗汉果甜苷v产量最高，说明可能合成甜苷v代谢途径过程中某些重要的酶活受到了抑制或伤害，也可能是盐胁迫改变了罗汉果悬浮细胞中能量的分配形式，原本用于细胞生长和产物合成的能量多用于渗透调节，如：液泡中无机离子的积累、其他有机渗透调节物质的合成，因而罗汉果细胞的生长明显表现出受到抑制，且产物合成也受到抑制。而其他比例的钠钾离子也均显著提高罗汉果甜苷的产量。3.盐胁迫对罗汉果悬浮细胞培养中钾钠离子吸收与运输的比较1)实验方法将发酵液离心保留上清备用。置马弗炉中灰化。灰分用弄硝酸溶解，用去离子水定容后，放于50ml三角瓶中，用等离子体发射光谱仪测定胞内和胞外的k+、na+含量，计算k+：na+，和k+、na+吸收选择性系数。s(k，na吸收)＝(k细胞/na细胞)/(k培养基/na培养基)2)结果：不同处理条件对罗汉果悬浮细胞培养基中钾钠镁离子含量及钾钠比的影响结果见表5。表5第12天时不同处理条件对罗汉果悬浮细胞培养基中钾钠镁离子含量及钾钠比的影响单位：mg/kg由表5可知，随着胁迫强度增加，盐胁迫使罗汉果悬浮细胞中na+浓度大幅度上升，而k+浓度先增加后下降；而胞外na+浓度也呈现上升趋势，而k+浓度先下降后增加。盐胁迫还导致胞外k+：na+随着盐浓度的增加呈现下降趋势。高浓度的盐胁迫导致了细胞拒na+、吸k+的能力和选择性运输k+的能力降低，使细胞内的na+含量增多，胞内k+：na+比值升高。说明，盐胁迫会造成离子平衡失调。生物量分配策略是植物在盐胁迫下的适应机制之一，选择性吸收程度的高低可以间接反应植物利用k+的能力，则可以发现，在胞外k+：na+为17时，细胞生物量达到最高，选择性吸收系数s(k，na吸收)最大；而k+：na+>17时，即培养基中na+含量较低时，选择性吸收系数s(k，na吸收)显著降低，反而不利于细胞的生长。na+是造成植物盐害的主要离子，k+是植物生长发育所必需的大量元素和重要渗透调节组分，na+对k+吸收呈现出明显的竞争性抑制作用，而细胞对k+的吸收程度可以间接反应细胞的生长状态。s(k，na吸收)越大，表明细胞拒na+、吸k+的能力越强，越有利于细胞的生长。在盐环境中，较高浓度的na+常常会抑制k+转运蛋白，从而降低细胞对k+吸收，而维持合适的k+:na+比值是细胞适应盐逆境的重要方式之一。4.盐胁迫对罗汉果悬浮细胞培养中有机酸含量的比较1)实验方法将发酵液离心保留上清，上清过0.22um滤膜备用。采用高效液相色谱法测定发酵液中的有机酸含量。氢柱，流动相为5mm硫酸，流速为0.4ml/min，柱温为50℃，紫外检测波长为210nm。标准品α～酮戊二酸、柠檬酸、苹果酸、草酰乙酸、丙酮酸、延胡索酸、乙酸配置浓度分别为5g/l、5g/l、5g/l、1g/l、1g/l、1g/l、1g/l。2)结果：不同处理条件对罗汉果悬浮细胞培养基中有机酸含量的影响结果见表7，罗汉果悬浮细胞生长过程中有机酸的变化见图3，mva途径和mep途径见图4。多种有机酸标品浓度与出峰面积呈良好的线性关系，从罗汉果悬浮细胞上清出峰来看，在11.8左右出峰物质峰面积极高，但是不能与标品出峰时间相匹配，可以判断此物质不是有机酸。而在出峰时间17.6min左右和26.3min左右分别为丙酮酸和乙酸，上清中丙酮酸和乙酸能够明显的检测出来。由图3可知，丙酮酸在细胞生长开始阶段是慢慢积累，在生长至12d左右，胞外的丙酮酸含量达到峰值，之后胞外的丙酮酸浓度显著降低；而乙酸含量在细胞生长初期就急剧降低，在第12d左右达到最低值，之后乙酸含量开始增加，这可能是因为罗汉果悬浮细胞为适应环境的变化而作出的“防御反应”，是细胞能够在培养环境中达到平衡的生长状态。对于罗汉果悬浮细胞来说，罗汉果甜苷v是达玛烷型四环三萜类化合物，它经过emp途径、mva途径和mep途径。如图4所示，罗汉果悬浮细胞利用蔗糖代谢成葡萄糖和果糖，经糖酵解途径生成丙酮酸，丙酮酸一部分分泌至胞外，一部分在有氧气和线粒体存在时进入线粒体，经丙酮酸脱氢酶复合体催化氧化脱羧产生nadh、co2和乙酰辅酶a。乙酰辅酶a一部分进入mva途径，形成甲基戊二酰辅酶ahmg～coa)。所形成的hmg～coa在还原酶的作用下形成甲羟戊酸mva)，后者在各种酶的催化行形成异戊烯焦磷酸。而mep途径又称脱氧木酮糖磷酸途径，它以糖酵解中间代谢物丙酮酸和3～磷酸甘油醛为前体，在合酶的作用下生成dxp，之后通过还原酶和异构酶催化转变成mep。表7不同处理条件钾钠比对罗汉果悬浮细胞培养基中有机酸含量的影响故根据表7可知，实施例1～7的不同钾钠比条件下的丙酸和甲酸含量一般均高于空白，而苹果酸和延胡索酸含量一般均低于空白，说明为了适应培养基中环境的改变，会作出一定的“防御应答”。发酵液中未检测到丙酮酸，说明丙酮酸均倍利用完，没有多于的分泌到胞外。在培养基中钾钠比为15:1时，苹果酸和延胡索酸的值均达到最低值，此时丙酮酸分解进入tca循环减少，而进入次生代谢产物的途径的丙酮酸增加；而丙酸和甲酸的含量增加，变化趋势先降低后增加，在15:1时，达到最低值，也许用于氨基酸代谢的量减少，往产物方面合成的量增加，从而可知甜苷v含量增加，与罗汉果甜苷v含量比较中的结果相一致。结论第一、当初期培养基中k+：na+低于20:1时，罗汉果悬浮细胞生物量都高于对照，且随着比例的增加而增加，当k+：na+为15:1，细胞干重在第15天时达到最大值11.663g/l，是对照的2倍左右。而初期培养基中k+：na+超过20:1时，罗汉果悬浮细胞生长受到抑制，第15天的生物量最低仅为6.020g/l。7初期培养基中不同k+：na+的罗汉果悬浮细胞相比较于空白对照来说比生长速率均会保持增长；当k+：na+比小于20:1时，随着初期培养基中k+：na+比的增加，不同条件下的细胞比生长速率逐渐增加；对于同一个k+：na+比条件下，15d的比生长速率均高于12d的比生长速率，而空白对照呈下降趋势。第二、与对比例1相比较，实施例1～7的罗汉果甜苷v含量均明显提高，和干重的增加趋势大致一致，这说明通过在罗汉果悬浮细胞培养体系初期改变培养基中钾钠比可以有效提高罗汉果甜苷v的产量。其原因可能是盐胁迫使植物细胞为了适应环境，而做出一系列的应激反应。当硫酸钠浓度为15:1时，罗汉果甜苷v产量最高。第三、随着胁迫强度增加，盐胁迫使罗汉果悬浮细胞中na+浓度大幅度上升，而k+浓度先增加后下降；而胞外na+浓度也呈现上升趋势，而k+浓度先下降后增加。盐胁迫还导致胞外k+：na+随着盐浓度的增加呈现下降趋势。在胞外k+：na+为17时，细胞生物量达到最高，选择性吸收系数s(k，na吸收)最大。第四、实施例1～7的不同钾钠比条件下的丙酸和甲酸含量一般均高于空白，而苹果酸和延胡索酸含量一般均低于空白，说明为了适应培养基中环境的改变，会作出一定的“防御应答”。发酵液中未检测到丙酮酸，说明丙酮酸均倍利用完，没有多于的分泌到胞外。在培养基中钾钠比为15:1时，苹果酸和延胡索酸的值均达到最低值，此时丙酮酸分解进入tca循环减少，而进入次生代谢产物的途径的丙酮酸增加；而丙酸和甲酸的含量增加，变化趋势先降低后增加，在15:1时，达到最低值，也许用于氨基酸代谢的量减少，往产物方面合成的量增加，从而可知甜苷v含量增加，与罗汉果甜苷v含量比较中的结果相一致。本发明探究了一种关于盐胁迫对罗汉果悬浮细胞生长及甜苷v积累的影响问题，并且提供了一种可以提高罗汉果悬浮细胞中罗汉果甜苷v和生长量的钾钠离子浓度比。本发明方法以人工方式调节罗汉果细胞和罗汉果甜苷v的生产过程，有利于罗汉果细胞生长量和罗汉果甜苷v的市场化大规模生产以及质量控制管理，具有较好的经济价值和广阔的应用前景。虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页12