本发明属于基因工程领域，提供了一种可稳定变大的大肠杆菌bl21底盘菌株的构建及工业化应用。
背景技术：
h-ns是大肠杆菌内富含的一种dna结合蛋白，由两个相同的亚基组成，其功能类似于真核细胞的组蛋白，涉及染色体的折叠包装和基因表达的调节。目前，对于大肠杆菌的h-ns蛋白研究最多的是，其作为一种通用转录沉默子的反式作用因子，能和大肠杆菌启动子上游常见的弯曲dna序列选择性结合从而抑制基因转录。
工业生产应用中，常常利用大肠杆菌bl21作为底盘细胞，依靠其强大的外源蛋白表达能力，按照人们的需求进行相应有价值的外源蛋白生产，该系统下，蛋白产量高，副产物少。比如现有技术cn102618552a。同时，人们为了进一步的提高蛋白表达的产量，也不断的对大肠杆菌bl21底盘细胞进行遗传改造、高产菌株的筛选等提高产量方面的优化及技术改造，比如现有技术cn105255806a，但是现有技术的方案中，随着细胞体积变大而生长速度减慢，同时产量也随之受影响。
本发明目的是改造大肠杆菌底盘细胞，在不影响其生长速度的条件下，使其体积变大，提高胞内产能，以便获得更大的空间进一步的提高蛋白产量。
技术实现要素：
针对目前存在的问题，本发明提供了一种可稳定变大的大肠杆菌bl21底盘菌株的构建及工业化应用。
本发明所获得的该细胞比正常的大肠杆菌bl21细胞体积增大1.5-2倍，单位细胞质量提高1.2-1.5倍，且该底盘细胞能够稳定遗传。
本发明获得前述优选细胞主要是利用crispr/cas9基因编辑工具对大肠杆菌bl21基因组的内源基因hns进行组成型表达的调控，用强启动子及rbs提高内源基因hns的表达量，经基因工程重组后的hns组成型表达菌株命名为b。在有益效果方面，该菌株相对于未改造的大肠杆菌bl21，第一，形态发生改变，包内产能提高；第二，具有相同生长速率；第三，能够稳定遗传，重现性好。
本发明通过以下技术方案来实现：
本发明的首要目的在于提供了一种可稳定变大的大肠杆菌bl21底盘菌株，其特征在于，所述菌株命名为菌株b，序列为seqno.8。
本发明的另一目的在于提供前述一种可稳定变大的大肠杆菌bl21底盘菌株的制备方法，包括以下步骤：
1)、将能表达cas9蛋白和red重组系统的质粒1电转化到大肠杆菌bl21原始细胞中；
优选方法为：将在lb培养基中过夜培养的bl21原始细胞进行转接，至od600达到0.5-1.0时，将其制成感受态细胞，并将50-100ng的dna质粒1电转化到大肠杆菌bl21感受态细胞中；以50µg/ml工作浓度的kan抗性平板，37℃进行筛选。
2)、设计引物合成强启动子及rbs，优选的为ptet启动子+rbs（bba_0034）；
所述设计引物合成强启动子及rbs可以根据现有技术已知的方法进行。
3)、pcr扩增大肠杆菌bl21内源基因hns的上、下游同源臂各300bp长度，其中上游同源臂为hns自身启动子前面的300bp，下游同源臂是从hns起始密码开始往后的300bp；
所述pcr扩增可以根据现有技术已知的方法进行。
4)、通过overlappcr将上述片段按顺序连接，即上游同源臂+ptet+rbs+下游同源臂，并将该长片段构建到如图所示的质粒2当中；
5)、设计并合成大肠杆菌bl21内源基因hns原有启动子的n20序列，n20序列hns原有启动子内部的20bp片段，要求基因组上其序列后面3个碱基为ngg，即为n20+ngg的序列格式，并且基因组上没有重复的序列，并将该n20序列连接到含有sgrna序列的质粒2上；
6)、挑取含有质粒1大肠杆菌划线分离纯化的阳性克隆子，制备电转感受态细胞，诱导表达red重组酶的表达。
优选方法为：挑取含有质粒1大肠杆菌划线分离纯化的阳性克隆子在kan抗性的lb培养基中进行培养，待od600达到0.2-0.4时，制备电转感受态细胞，在制作感受态的过程中，冰水浴上放置前1h于培养液中加入10mm的阿拉伯糖，诱导表达red重组酶的表达。
7)、将质粒2电转到含有质粒1的大肠杆菌bl21中，诱导质粒2转录后的guiderna能够定位到需要做遗传修饰的内源hns基因位点，同时诱导表达质粒1上的cas9蛋白及red重组系统的表达，其能够对该n20的位点进行特异的剪切，同时再通过重组相关酶系的作用发生同源重组，将新的ptet启动子替换内源的启动子，并通过测序进行检测是否重组成功，验证得到高效表达hns的菌株；
优选方法为：37℃复苏1h，以50µg/ml工作浓度的kan抗性及100µg/ml工作浓度的spc抗性平板筛选，37℃过夜培养后对克隆子进行验证，同源重组后新的启动子替换内源的启动子，通过测序进行检测是否重组成功，验证得到高效表达hns的菌株。
8)、消除改造后大肠杆菌bl21中的质粒1和质粒2。
优选方法为：阳性克隆子接lb液体（kan抗性），加入10mm鼠李糖，诱导导向质粒2的sgrna转录，培养过夜，划线分单菌落，验正质粒2的消除；37℃液体lb（含5g/l的葡萄糖）培养过夜，稀释102-104后，涂布于5g/l葡萄糖与10g/l蔗糖的lb板，挑取单克隆进行kan抗性验证，验证质粒1的消除。最终获得不含质粒1和质粒2的底盘细胞菌株。
本发明的另一目的在于提供所述的一种可稳定变大的大肠杆菌bl21底盘菌株作为制备蛋白的底盘细胞的应用。
本发明相对于现有技术的有益效果包括：
首先，本发明通过大量实验，发现大肠杆菌中的h-ns蛋白水平能够影响大肠杆菌细胞的大小，h-ns蛋白的表达量越大，细胞体积也变的越大，内容物产量也越高，但是，生长速率却不受影响，因此单位时间内细胞产能明显提高。
另外，大肠杆菌bl21适合大量表达生产异源蛋白，经常作为模式菌株常被用于工业化生产当中，因此，通过提高大肠杆菌bl21的h-ns的表达水平，构建生物合成底盘菌株，菌株稳定可遗传，对下游不同需求的生物合成都具有普遍适用的特点，能大大的提高产能。
附图说明
图1本发明可稳定变大的大肠杆菌bl21底盘菌株的构建示意图；
图2本发明实施例1步骤（2）中分步骤1）的构建示意图；
图3本发明实施例1步骤（2）中分步骤5）的构建示意图；
图4本发明实施例1步骤（2）中分步骤6）的构建示意图；
图5大肠杆菌bl21改造前（2a）和本发明大肠杆菌bl21改造后（2b）显微镜检测示意图；
图6本发明实施方案胞内产能增加检测结果示意图；
图7本发明实施方案细胞生长速度示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施例和附图，对本发明进行进一步说明，但本发明不局限于此。
实施例1
（1）、底盘微生物的选择：大肠杆菌bl21
强启动子选择：ptet启动子（序列seqno.1）：
tccctatcagtgatagagattgacatccctatcagtgatagagatactgagcacatatgcagcaggacgcactgacc。
rbs选择：bba_0034（序列seqno.2）：aaagaggagaaa。
（2）制备流程
参照图1的流程所示，制备步骤如下：
1)、将能表达cas9蛋白和red重组系统的质粒1电转化到大肠杆菌bl21原始细胞中：将在lb培养基中过夜培养的bl21原始细胞进行转接，至od600达到0.5-1.0时，将其制成感受态细胞，并将50-100ng的dna质粒1电转化到大肠杆菌bl21感受态细胞中。以50µg/ml工作浓度的kan抗性平板，37℃进行筛选。该步骤的制备过程参照图2所示。
2)、设计并合成序列ptet启动子+rbs（bba_0034）
（序列seqno.3）：
tccctatcagtgatagagattgacatccctatcagtgatagagatactgagcacatatgcagcaggacgcactgacctctagagaaagaggagaaatactag
3)、以大肠杆菌bl21基因组为模板，通过pcr扩增内源基因hns的上、下游同源臂，各300bp长度。
（上游序列seqno.4）：
ttgcgcaagtaatagccctctgttgacctccaggagatagtgcaatactaagtccctgctcttattgcgactgttctacttttcatcattcgcttaatagggaattctcgtaaacacgactaatacagaagactgaaaggtcgtcagcctacgataatctccccataaaatgtgacatgaatcaggaagttttaacctcacgagctgcgaaatcatcggtacaaatagggctatatgccgcgtcttttctggctaattttatgaaaagatatttattggcggcacaaaataaagaacaat；
（下游序列seqno.5）：
atgagcgaagcacttaaaattctgaacaacatccgtactcttcgtgcgcaggcaagagaatgtacacttgaaacgctggaagaaatgctggaaaaattagaagttgttgttaacgaacgtcgcgaagaagaaagcgcggctgctgctgaagttgaagagcgcactcgtaaactgcagcaatatcgcgaaatgctgatcgctgacggtattgacccgaacgaactgctgaatagccttgctgccgttaaatctggcaccaaagctaaacgtgctcagcgtccggcaaaatatagctacgtt。
4)、利用overlappcr试剂盒将上述片段按顺序连接，即上游同源臂+ptet+rbs+下游同源臂（序列seqno.6）：
ttgcgcaagtaatagccctctgttgacctccaggagatagtgcaatactaagtccctgctcttattgcgactgttctacttttcatcattcgcttaatagggaattctcgtaaacacgactaatacagaagactgaaaggtcgtcagcctacgataatctccccataaaatgtgacatgaatcaggaagttttaacctcacgagctgcgaaatcatcggtacaaatagggctatatgccgcgtcttttctggctaattttatgaaaagatatttattggcggcacaaaataaagaacaattccctatcagtgatagagattgacatccctatcagtgatagagatactgagcacatatgcagcaggacgcactgacctctagagaaagaggagaaatactagatgagcgaagcacttaaaattctgaacaacatccgtactcttcgtgcgcaggcaagagaatgtacacttgaaacgctggaagaaatgctggaaaaattagaagttgttgttaacgaacgtcgcgaagaagaaagcgcggctgctgctgaagttgaagagcgcactcgtaaactgcagcaatatcgcgaaatgctgatcgctgacggtattgacccgaacgaactgctgaatagccttgctgccgttaaatctggcaccaaagctaaacgtgctcagcgtccggcaaaatatagctacgtt，
并将该长片段构建到质粒2当中sgrna的下游。
5)、设计并合成大肠杆菌bl21内源基因hns原有启动子的n20序列（序列seqno.7）：aattcagttgtgcaatagcc，包括：n20序列hns原有启动子内部的20bp片段，要求基因组上其序列后面3个碱基为ngg，即为n20+ngg的序列格式，并且基因组上没有重复的序列，并将该n20序列连接到含有sgrna序列的质粒2上。参照图3所示，该n20序列连接到图中质粒2当中pj23119的后面得到质粒。
6)、挑取含有质粒1大肠杆菌划线分离纯化的阳性克隆子在kan抗性的lb培养基中进行培养，待od600达到0.2-0.4时，制备电转感受态细胞，在制作感受态的过程中，冰水浴上放置前1h于培养液中加入10mm的阿拉伯糖，诱导表达red重组酶的表达；该步骤的制备过程参照图4所示。
7)、将重组后的质粒2（100-200ng）电转到第6步中已诱导表达red的大肠杆菌bl21中：37℃复苏1h，以50µg/ml工作浓度的kan抗性及100µg/ml工作浓度的spc抗性平板筛选，37℃过夜培养后对克隆子进行验证，同源重组后新的启动子替换内源的启动子，通过测序进行检测是否重组成功，验证得到高效表达hns的菌株。
8)、消除改造后大肠杆菌bl21中的质粒1和质粒2：阳性克隆子接lb液体（kan抗性），加入10mm鼠李糖，诱导导向质粒2的sgrna转录，培养过夜，划线分单菌落，验正质粒2的消除；37℃液体lb（含5g/l的葡萄糖）培养过夜，稀释102-104后，涂布于5g/l葡萄糖与10g/l蔗糖的lb板，挑取单克隆进行kan抗性验证，验证质粒1的消除；最终获得不含质粒1和质粒2的底盘细胞菌株，序列如下seqno.8：
tccctatcagtgatagagattgacatccctatcagtgatagagatactgagcacatatgcagcaggacgcactgacctctagagaaagaggagaaatactagatgagcgaagcacttaaaattctgaacaacatccgtactcttcgtgcgcaggcaagagaatgtacacttgaaacgctggaagaaatgctggaaaaattagaagttgttgttaacgaacgtcgcgaagaagaaagcgcggctgctgctgaagttgaagagcgcactcgtaaactgcagcaatatcgcgaaatgctgatcgctgacggtattgacccgaacgaactgctgaatagccttgctgccgttaaatctggcaccaaagctaaacgtgctcagcgtccggcaaaatatagctacgttgacgaaaacggcgaaactaaaacctggactggccagggccgtactccagctgtaatcaaaaaagcaatggatgagcaaggtaaatccctcgacgatttcctgatcaagcaataa。
实施例2效果测试
采用实施例1获得菌株b作为底盘细胞在lb培养基中，37℃进行培养，od600≈0.2时取样在显微镜下进行观察，形态发生改变如图5所示，细胞体积有明显的增大；胞内产能增加如图6所示，胞内产能提高；然而，从1h至2h的生长速率检测结果发现，生长速率不变，参照图7所示。
充分说明本发明菌株培养细胞具有以下优势：细胞体积也变的越大，内容物产量也越高，但是，生长速率却不受影响，单位时间内细胞产能明显提高。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
<110>深圳市启未生物科技有限公司
<120>一种可稳定变大的大肠杆菌bl21底盘菌株的构建及工业化应用
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