一种基于温敏型生物凝胶三维培养体系建立结直肠癌患者来源的异种移植瘤模型的方法与流程

文档序号:14657830发布日期:2018-06-12 07:33阅读:来源:国知局
技术特征:

1.一种用于建立结直肠癌异种移植瘤模型的试剂组合,其特征在于,所述的试剂组合包含:温敏型生物凝胶、分离和培养肿瘤细胞需要的消化液、基础培养基、人肠道干细胞培养基。

2.根据权利要求1所述的试剂组合,其特征在于,所述的温敏型生物凝胶为Matrigel胶。

3.根据权利要求1所述的试剂组合,其特征在于,所述的消化液通过如下方法制得:将0.8mg透明质酸酶,60mg胶原酶II于40ml PBS缓冲液混匀,即得消化液。

4.根据权利要求1所述的试剂组合,其特征在于,所述的基础培养基通过如下方法制得:将5ml 1M 4-羟乙基哌嗪乙磺酸,25ml 200mM谷胺酰胺溶液,5ml 100×青霉素/链霉素溶液于465ml,即得基础培养基。

5.根据权利要求1所述的试剂组合,其特征在于,所述的人肠道干细胞培养基通过如下方法制得:将5ug人R-spondin 1,5ug人Noggin,5ug人EGF,2ml 50×B27,20.4mg N-乙酰半胱氨酸,1221mg尼克酰胺,21g人胃泌素I,0.5ul 100mMA83-01溶液,1ul 300mM SB202190,0.1ul 10mM前列环素E2,0.2ml Primocin加入至100ml基础培养基即得。

6.根据权利要求1-5任一所述的试剂组合在建立结直肠癌异种移植瘤模型中的应用。

7.一种利用权利要求1-5任一所述的试剂组合建立三维培养体系的方法,其特征在于,所述的方法包括以下步骤:

(a)取结直肠癌患者的肿瘤,保存至DMEM中;

(b)在冰上将肿瘤组织置于培养皿中,用PBS清洗至清洁后,将组织切成碎片,置于离心管中离心,吸除上清液,获得组织碎片沉淀;

(c)加入消化液,重悬沉淀,剧烈震荡后,37℃、5%CO2温箱中孵育;

(d)再次剧烈震荡后,加入胎牛血清,混匀,静置,吸出上清液;

(e)上清液经筛网过滤至离心管中,得到过滤液,富集腺体碎片;

(f)将过滤液离心,弃上清,加入基础培养基使沉淀重新悬浮;

(g)重悬液移至EP管中;

(h)离心,弃上清,置冰上;

(i)EP管加入Matrigel胶,4℃液态,预冷枪头吹吸Matrigel胶,避免产生气泡;

(j)培养板在37℃预热,细胞凝胶混合液滴加至预热培养板上,使凝胶迅速转化为果冻状;

(k)37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育,加入人肠道干细胞培养基;

(l)连续培养形成克隆环。

8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述的方法包括以下步骤:

(a)取结直肠癌患者体积400-500mm3的肿瘤,保存至20ml含200U/ml青霉素/链霉素的DMEM中,不超过24小时;

(b)在冰上将肿瘤组织置于培养皿中,用PBS清洗至清洁后,将组织切成2-4mm3大小的碎片,置于含10ml冰PBS的15ml离心管中,以1500rpm离心3分钟,吸除上清液,获得组织碎片沉淀;

(c)加入5ml消化液,重悬沉淀,剧烈震荡后,37℃、5%CO2温箱中孵育30分钟;

(d)再次剧烈震荡后,加入5ml胎牛血清混匀,静置2分钟,吸出上清液;

(e)上清液经100-μm筛网过滤至50ml离心管,得到过滤液,富集腺体碎片;

(f)将过滤液离心:5分钟,180g;弃上清,加入5ml基础培养基使沉淀重新悬浮,重复3次;

(g)重悬液取20ul进行细胞计数,腺体总数等于显微镜下腺体数目的500倍,取出所需要的体积,移至5ml EP管中;

(h)离心:5分钟,180g,弃上清,置冰上1分钟;

(i)EP管加入Matrigel胶,4℃液态,预冷200ul枪头吹吸Matrigel胶数十次,避免产生气泡;

(j)24孔培养板在37℃预热30分钟,细胞凝胶混合液50μL/孔滴加至预热培养板上,使凝胶迅速转化为果冻状;

(k)37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育30分钟,加入人肠道干细胞培养基700ul;

(l)连续培养5-7天形成克隆环。

9.根据权利要求7或8所述的方法获得的三维培养体系。

10.一种利用权利要求9所述的三维培养体系建立结直肠癌异种移植瘤模型的方法,其特征在于,所述的方法包括以下步骤:在培养7天后,去除凝胶上方人肠道干细胞培养基,将24孔培养板置冰上15分钟,待Matrigel胶成液态后置于冰上5ml EP管中,用预冷的1ml无菌注射器将液态Matrigel胶注射于非肥胖型糖尿病重症联合免疫缺陷小鼠皮下,SPF环境下饲养7周,建成结直肠癌异种移植瘤模型。

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