本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，是一种基于温敏型生物凝胶三维培养体系建立结直肠癌患者来源的异种移植瘤模型的方法。
背景技术：
结直肠癌(colorecal cancer,CRC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，其发病率居恶性肿瘤发病率第三位，死亡率第三位。约25％的结直肠癌患者在首诊时即发现有同时性肝转移，25％～50％的患者会发生异时性肝转移，无法切除的肝转移患者的中位生存时间仅为4.2～21.3个月。结肠癌肝转移手术切除后的5年生存率接近40％。结合我们前期的临床研究发现，通过对肠癌肝转移患者进行化疗、靶向治疗后，可将10％～25％的初始不可切除的病人转化为可切除，经手术治疗后获得长期生存的机会。因此，选择敏感的化疗和靶向治疗方案对于转化治疗成功尤为重要。
移植瘤动物模型是进行肿瘤生物学特征鉴定和药物筛选研究的重要平台。以往移植瘤动物模型多采用肿瘤细胞系建模的方法，其优势：易获得和实验重复性好等优点。但是利用细胞系建立的肿瘤模型存在诸多缺陷：肿瘤细胞在体外建系的过程脱离了自然的肿瘤微环境，导致其基因发生突变；体外培养过程中选择性压力以及经过消化酶处理，破坏了肿瘤组织结构、细胞的异质性；一株细胞系所建立的动物模型仅能反映一个癌症病人。最终导致肿瘤生物学行为和自然属性不可逆性改变，严重阻碍了对肿瘤机制及治疗应答的研究，已然影响结直肠癌疗效改善的瓶颈，亟待解决。
结直肠癌患者来源异种移植瘤(Patient-derived xenografts，PDX)小鼠模型直接将手术切除结直肠癌组织种植在免疫缺陷小鼠体内，最大程度地模拟了人体内环境，保留肿瘤的特异基因、分子及其组织学一致性，可广泛应用于结直肠癌病因、发病机制，发病过程及治疗。与传统人癌细胞系建立的肿瘤细胞模型相比，患者来源移植瘤动物模型减少了体外处理步骤，可以更好地保持临床肿瘤组织的原始生物学特征和组织学特征；并且来自于不同的患者，能够较好模拟患者的遗传多样性。因此，患者源性移植瘤模型将更为准确地预测药物的临床实验结果，为肿瘤个体化治疗提供更加合理的治疗方案设计，是一种较为理想的移植瘤动物模型。美国著名的杰克逊实验室以每只上千美元价格出售 PDX小鼠模型。法国工业部对此模型计划资助金额高达540万欧元。抗肿瘤药物的临床前试验应用相应肿瘤PDX模型进行验证疗效。因此，肿瘤患者来源异种移植瘤模型已形成了一个巨大的市场。
目前的结直肠癌PDX模型技术因生长周期长、成瘤率较低等局限性，依然无法满足目前基础研究和临床诊断的需要。Annette等2017年于《Nature Review》杂志报道构建结直肠癌患者来源异种移植瘤小鼠模型皮下种植方法成功率为52–75％，构建常用方法为：将结直肠癌组织分割成2*2*2mm3小块后直接移植在小鼠的肩胛下方，成瘤开始时间4周-12周。目前结直肠癌PDX模型存在的短板是成长周期较长，不能满足临床应用要求、且工时成本较高，转移率低。因此，为了适应临床和科研需要，亟需一种新的结直肠癌患者来源异种移植瘤小鼠模型构建方法，该方法可大幅缩短成瘤时间，所构建模型可适用于药物筛选及实验研究，同时还具有操作所致死亡率低、成功率高、易于推广的特点。
中国专利文献CN103239479A公开了一种人原发性皮肤鳞状上皮细胞癌肿瘤干细胞的动物模型建立方法：首先人性化裸鼠皮下致瘤部位的微环境：在裸鼠皮下埋入可溶性泡沫凝胶,并在可溶性泡沫凝胶中注射基质胶(Matrigel)。同时加入1×106人原代成纤维细胞和1×106人原代内皮细胞，闭合创口饲养两周，以形成利于移植人皮肤原发性SCC细胞的微环境。但是关于本发明的一种基于温敏型生物凝胶三维培养体系建立结直肠癌患者来源的异种移植瘤模型的方法目前还未见报道。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种用于建立结直肠癌异种移植瘤模型的试剂组合。
本发明的第二个目的是，提供一种试剂组合的应用。
本发明的第三个目的是，提供一种建立三维培养体系的方法。
本发明的第四个目的是，提供一种基于温敏型生物凝胶三维培养体系。
本发明的第五个目的是，提供一种建立结直肠癌患者来源的异种移植瘤模型的方法
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种用于建立结直肠癌异种移植瘤模型的试剂组合，所述的试剂组合包含：温敏型生物凝胶、分离和培养肿瘤细胞需要的消化液、基础培养基、人肠道干细胞培养基。
进一步地，所述的温敏型生物凝胶为Matrigel胶。
进一步地，所述的消化液通过如下方法制得：将0.8mg透明质酸酶，60mg 胶原酶II于40ml PBS缓冲液混匀，即得消化液。
进一步地，所述的基础培养基通过如下方法制得：将5ml 1M 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，25ml 200mM谷胺酰胺溶液，5ml 100×青霉素/链霉素溶液于465ml，即得基础培养基。
进一步地，所述的人肠道干细胞培养基通过如下方法制得：将5ug人 R-spondin 1，5ug人Noggin，5ug人EGF，2ml 50×B27，20.4mg N-乙酰半胱氨酸，1221mg尼克酰胺，21g人胃泌素I，0.5ul 100mMA83-01溶液，1ul 300mM SB202190，0.1ul 10mM前列环素E2，0.2ml Primocin加入至100ml基础培养基即得。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：所述的三维培养体系在建立结直肠癌异种移植瘤模型中的应用。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：一种三维培养体系的建立方法，包括以下步骤：
(a)取结直肠癌患者体积约400-500mm3的肿瘤，保存至20ml DMEM (200U/ml青霉素/链霉素)，不超过24小时。
(b)在冰上将肿瘤组织置于培养皿中，用PBS清洗至清洁后，将组织切成 2-4mm3大小的碎片，置于15ml离心管(含冰PBS约10ml)；离心：3min， 1500rpm；吸除上清液，获得组织碎片沉淀。
(c)加入5ml消化液，重悬沉淀，剧烈震荡后，37℃,5％CO2温箱中孵育30min。
(d)再次剧烈震荡后，加入5ml FCS(fetal calfserum)混匀，静置2min，吸出上清液。
(e)上清液经100-μm筛网过滤至50ml离心管，得到过滤液，富集腺体碎片。
(f)将过滤液离心：5min，180g；弃上清，加入5ml基础培养基(Basal culture medium，BCM)使沉淀重新悬浮。重复3次。
(g)重悬液取20ul进行细胞计数，腺体总数等于显微镜下腺体数目的500 倍。取出所需要的体积，移至5ml EP管中。(20000个细胞/50ul Matrigel胶/ 孔)
(h)离心：5min，180g。弃上清。置冰上1min。
(i)EP管加入温敏型生物凝胶Matrigel胶(20000个细胞/50ul Matrigel胶/ 孔)，4℃液态。预冷200ul枪头吹吸Matrigel胶数十次，避免产生气泡。
(j)24孔培养板在37℃预热30min，细胞凝胶混合液50μL/孔滴加至预热培养板上，使凝胶迅速转化为果冻状。
(k)37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育30min，加入HISC培养基700ul；
(l)连续培养5-7天形成克隆环。
为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：前述方法所获得的三维培养体系。
为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是：一种基于三维培养体系建立结直肠癌异种移植瘤模型的方法：在培养7天后可以每孔形成50个以上细胞构成的细胞团的克隆，去除凝胶上方HISC培养基，将24孔板置冰上 15min，待Matrigel胶成液态后置于冰上5ml EP管中。用预冷的1ml无菌注射器将液态Matrigel胶注射于非肥胖型糖尿病重症联合免疫缺陷小鼠 (NOD-SCID小鼠)或裸小鼠(Balb/c-nu小鼠)皮下，SPF环境下饲养4-6周，建成结直肠癌裸鼠皮下成瘤PDX模型。
优选的，所述的步骤(l)中IV期结直肠癌的细胞团的克隆(每孔形成50个以上细胞环)，去除上方HISC培养基，将24孔板置冰上15min，待Matrigel 胶成液态后置于冰上5ml EP管中。用预冷的1ml无菌注射器将液态Matrigel 胶注射于裸小鼠(balb/c-nu)脾脏内，SPF环境下饲养6周，建成结直肠癌肝转移PDX裸鼠模型。
本发明优点在于：
1、本发明经实验证明，结直肠癌细胞在本发明的温敏型生物凝胶体三维培养体系中，可以进行进一步扩增生长，并增强其在免疫缺陷鼠中的成瘤能力。
2、该体系培养出的多克隆肿瘤细胞，在裸鼠中具有良好的皮下成瘤能力 (皮下成瘤率＞83％)。
3、本发明为建立结直肠癌异种移植瘤动物模型，对结直肠癌的个体化治疗提供模式动物，并且证明了该模型从遗传物质层面上较好的模拟了供体肿瘤的特征。
4、本发明制备方法简单，工艺成熟，可大幅度降低人源性结直肠癌异种移植瘤模型的构建的工时成本。
附图说明
附图1是基于温敏型生物凝胶三维培养体系体外培养的克隆环(白色箭头显示)。其中，A部分，bar＝500um；B部分，bar＝200um。
附图2～7是克隆环注射方法对比组织包埋方法的PDX皮下成瘤生长曲线，以及移植瘤与相应克隆环、供体肿瘤的组织结构(HE染色)。
附图2：A组、B组3号病例NOD-SCID小鼠皮下成瘤。
附图3：C组、D组3号病例NOD-SCID小鼠皮下成瘤。
附图4：A组和B组移植后4周瘤体积对比。
附图5：C组和D组移植后4周瘤体积对比。
附图6：C组和D组移植后6周瘤体积对比。
附图7：A组1-3号(1号：M37；2号：M39；3号：M40)移植瘤与相应细胞克隆环、供体肿瘤的组织结构(HE染色)。
附图8～11是全外显子和转录组测序显示II、III、IV期供体肿瘤vs移植瘤的同质性检验。
附图8，全外显子测序：A组1-3号(1号：M37；2号：M39；3号：M40) 供体肿瘤vs.移植瘤的Top 40肿瘤突变负荷分布，其中3号同质性最高，2号同质性相对较低。
附图9，全外显子测序：1-3号供体肿瘤vs.移植瘤以及TCGA数据库肠癌 1-19号染色体超突变频率(共386个外显子)的分布，同质性3号最高，1号次之，2号较低。
附图10，转录组测序：1-3号供体肿瘤vs.移植瘤的肠癌分子分型和疗效预测肿瘤负荷相关基因的表达谱对比，同质性3号最高，1号次之，2号较低。
附图11，转录组测序：1-3号供体肿瘤vs.移植瘤的全转录组表达量对比，经Pearson检验；同质性评分3号(0.99)>2号(0.83)>1号(0.82)；所有评分都大于0.80，表明在转录组层面，温敏型基质胶3D培养体系构建的人结直肠癌裸鼠移植瘤模型还原供体肿瘤的模拟度较高。
附图12～16是基于温敏型生物凝胶建立人结直肠癌肝转移移植瘤裸鼠模型建立流程和肝转移灶。
附图12：人结直肠癌肝转移移植瘤裸鼠模型建立流程。
附图13：E组裸小鼠(Balb/c-nu小鼠)皮下成瘤。
附图14：E组瘤体积-时间曲线。
附图15：F组裸小鼠脾脏移植瘤，肝脏转移瘤。
附图16：F组裸小鼠体重-时间曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
除非另有描述，本发明的实施采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，均是本领域技术人员所知的。参考下列文献中有完整的描述：《核酸杂交》(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑.1984)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait 编辑，1984)；《蛋白质纯化：原理和实践》第2版(Springer-Verlag，N.Y.)，以及《实验免疫学手册》I-IV卷(D.C.Weir和C.C.Blackwell编辑1986)；《DNA 克隆》第I和II卷(D.N.Glover编辑1985)；Sambrook《分子克隆实验指南》第 2版(1989)；Hans Clevers，et al.Prospective Derivation of a Living Organoid Biobank ofColorectal CancerPatients.Cell(2015)。或者，按照试剂生产商所提供的说明书进行。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。
温敏型生物凝胶是指Matrigel胶(BD公司；货号：356234)，富含肿瘤细胞所在的细胞外基质所含有的层黏连蛋白、胶原IV、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白等物质，充分模拟肿瘤在体内的生长环境，使结直肠癌细胞可以在凝胶中生长，并分泌IV型胶原酶溶解基质，形成显微镜下可见的克隆环。
分离和培养肿瘤细胞需要的消化液、基础培养基、人肠道干细胞培养基 (Human Intestinal Stem Cell medium，HISC medium)的配伍如下：
所述的消化液，具体配置：将0.8mg透明质酸酶，60mg胶原酶II于40ml PBS缓冲液混匀，即得消化液。
所述的基础培养基，具体配置是：将5ml 1M 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)， 25ml 200mM谷胺酰胺溶液，5ml 100×青霉素/链霉素溶液于465ml，即得基础培养基，4℃保存14天。
所述的HISC培养基，具体配置如下：将5ug人R-spondin 1(Peprotech公司，货号120-38)，5ug人Noggin(Peprotech公司，货号120-10C)，5ug人 EGF(Peprotech公司，货号AF-100-15)，2ml 50×B27(gibco公司，货号12587010)， 20.4mg N-乙酰半胱氨酸，1221mg尼克酰胺，21g人胃泌素I(Tocris公司，货号3006)，0.5ul 100mMA83-01溶液(Tocris公司，货号2939；溶剂：二甲基亚砜)，1ul 300mM SB202190(sigma公司，货号S7067-5MG)，0.1ul 10mM前列环素E2(Tocris公司，货号2296)，0.2ml Primocin(Invivogen公司，货号ant-pm-2) 加入至100ml基础培养基，即得HISC培养基。
实施例1
1例结直肠癌患者应用温敏型生物凝胶三维培养体系中培养结果，具体步骤如下：
(1)将1例患者手术切除的新鲜结直肠癌组织(离体15分钟内)置入含有20ml DMEM(200U/ml青霉素/链霉素)的离心管中，置于4℃环境，迅速转移到超净台，备用。
(2)在冰上将肿瘤组织置于培养皿中，用PBS清洗至清洁后，将组织切成2-4mm3大小的碎片，置于15ml离心管(含冰PBS约10ml)；离心：3min， 1500rpm；吸除上清液，获得组织碎片沉淀。
(3)加入5ml消化液，重悬沉淀，剧烈震荡后，37℃,5％CO2温箱中孵育30min。再次剧烈震荡后，加入5ml FCS(fetal calfserum)混匀，静置2min，吸出上清液。上清液经100-μm筛网过滤至50ml离心管，得到过滤液，富集腺体碎片。
(4)将过滤液离心：5min，180g；弃上清，加入5ml基础培养基使沉淀重新悬浮。重复3次。重悬液取20ul进行细胞计数，腺体总数等于显微镜下腺体数目的500倍。取出所需要的体积，移至5ml EP管中(20000个细胞/50ul Matrigel胶/孔)。离心：5min，180g。弃上清。置冰上1min。
(5)EP管加入4℃液态的温敏型生物凝胶Matrigel胶(20000个细胞/50ul Matrigel胶/孔)。预冷200ul枪头吹吸Matrigel胶数十次，避免产生气泡。
(6)细胞、凝胶混合液50μL/孔滴加至预热24孔培养板上，凝胶遇热迅速转化为果冻状；37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育30min，加入HISC培养基700ul；37℃、5％CO2细胞培养箱中连续培养5-7天。37℃、5％CO2细胞培养箱中连续培养5-7天。10×物镜下进行克隆环拍照。
(7)实验过程中，发现有活性的循环肿瘤细胞在培养12小时后，开始出现显著增殖，并部分消化周围3D基质在镜下形成折射度不同的“克隆环”(图中白色箭头所示)。进一步的形态观察发现，在培养7天后可以形成50个以上细胞构成的细胞团，部分增殖能力较强的克隆细胞数可达104数量级。
实施例2
6例结直肠癌患者基于温敏型生物凝胶三维培养体系方法对比组织块皮下包埋方法建立结直肠癌患者来源的异种移植瘤小鼠模型，其建立方法为：
(1)分别将6例患者手术切除的新鲜结直肠癌组织(离体15分钟内)置入含有20ml DMEM(200U/ml青霉素/链霉素)的离心管中，置于4℃环境，迅速转移到超净台，备用。
(2)在冰上将肿瘤组织置于培养皿中，用PBS清洗至清洁后，将组织切成2-4mm3大小的碎片，置于15ml离心管(含冰PBS约10ml)；离心：3min， 1500rpm；吸除上清液，获得组织碎片沉淀。
(3)加入5ml消化液，重悬沉淀，剧烈震荡后，37℃，5％CO2温箱中孵育30min。再次剧烈震荡后，加入5ml FCS(fetal calfserum)混匀，静置2min，吸出上清液。上清液经100-μm筛网过滤至50ml离心管，得到过滤液，富集腺体碎片。
(4)将过滤液离心：5min，180g；弃上清，加入5ml基础培养基使沉淀重新悬浮。重复3次。重悬液取20ul进行细胞计数，腺体总数等于显微镜下腺体数目的500倍。取出所需要的体积，移至5ml EP管中(20000个细胞/50ul Matrigel胶/孔)。离心：5min，180g。弃上清。置冰上1min。
(5)EP管加入4℃液态的温敏型生物凝胶Matrigel胶(20000个细胞/50ul Matrigel胶/孔)。预冷200ul枪头吹吸Matrigel胶数十次，避免产生气泡。
(6)细胞、凝胶混合液50μL/孔滴加至预热24孔培养板上，凝胶遇热迅速转化为果冻状；37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育30min，加入HISC培养基700ul；37℃、5％CO2细胞培养箱中连续培养5-7天。37℃、5％CO2细胞培养箱中连续培养5-7天。选用A组共18只雄鼠，4周龄，重量18-22g，非肥胖型糖尿病重症联合免疫缺陷小鼠(NOD/SCID)。选取每个患者对应的体外培养的细胞分别接种在3只小鼠的前肢肩背部皮下。具体接种方法：在培养7 天后可以每孔形成50个以上细胞构成的细胞团的克隆，去除凝胶上方HISC 培养基，将24孔板置冰上15min，待Matrigel胶成液态后置于冰上5ml EP管中。用预冷的1ml无菌注射器将液态Matrigel胶注射于NOD/SCID小鼠皮下 (50ul/只)。
(7)选用B组共12只雄性，4周龄，重量18-22g，非肥胖型糖尿病重症联合免疫缺陷小鼠(NOD/SCID)。每个患者的结直肠癌组织取3个小块，分别接种在2只小鼠的前肢肩背部皮下，具体接种方法为：在小鼠腹部备皮，再以碘伏消毒，用20号套管针将总量2×2×2mm3的结直肠癌组织于腹部腋中线处刺入，针头走行于皮肤与腹膜间，最终将组织送入前肢肩背部皮下，压迫伤口至无出血。
(8)SPF级环境下A、B组常规饲养4周，完成建立结直肠癌患者来源异种移植瘤模型，并对模型编号1-6号(每个编号所对应5只小鼠中大于等于 1只成瘤，即认定改变好模型建模成功)。A、B组小鼠接种移植后观察小鼠一般活动及营养状态等。每三天用游标卡尺测量移植瘤长(L)短(W)径平均值，按体积公式V＝1/2(L*W2)计算移植瘤平均体积。A组移植约2周后肉眼可见局部形成肿瘤结节，第4周肿瘤呈半球形，平均瘤体积约791.3mm3。而B 组约4周后肉眼可见局部形成肿瘤结节，解剖小鼠，大体移植瘤组织呈鱼肉状，血供丰富，部分肿瘤中央可见坏死，H&E染色后确认病理分型为结直肠细胞癌，与对应患者病理分型相一致。并对1号(III期)、2号(II期)、3期(IV 期)的移植瘤与供体肿瘤进行外显子测序、转录组测序，DNA、mRNA层面上验证遗传物质的统一性。而B组约3周后肉眼可见局部形成肿瘤结节，4周时平均瘤体积100.2mm3，解剖小鼠，大体移植瘤组织呈鱼肉状，血供丰富，部分肿瘤中央可见坏死，H&E染色后确认病理分型为结直肠细胞癌，与对应患者病理分型相一致。经过上述步骤，A组：1号、2号、4号模型所对应3 只小鼠中有3只成瘤，3号、5号模型有2只成瘤。最终建立5个模型，小鼠的成瘤率为83.3％，4周瘤体积超过600mm3的小鼠共6只；B组：1号、2号、 3号模型所对应2只小鼠中有2只成瘤。最终建立3个模型，小鼠的成瘤率为 50％，4周瘤体积超过600mm3的小鼠共0只。
实施例3
6例结直肠癌患者基于结直肠癌细胞生物凝胶三维培养体系方法对比组织块皮下包埋方法建立结直肠癌患者来源的异种移植瘤小鼠模型，其建立方法为：
(1)分别将6例患者手术切除的新鲜结直肠癌组织(离体15分钟内)置入含有20ml DMEM(200U/ml青霉素/链霉素)的离心管中，置于4℃环境，迅速转移到超净台，备用。
(2)在冰上将肿瘤组织置于培养皿中，用PBS清洗至清洁后，将组织切成2-4mm3大小的碎片，置于15ml离心管(含冰PBS约10ml)；离心：3min， 1500rpm；吸除上清液，获得组织碎片沉淀。
(3)加入5ml消化液，重悬沉淀，剧烈震荡后，37℃,5％CO2温箱中孵育30min。再次剧烈震荡后，加入5ml FCS(fetal calfserum)混匀，静置2min，吸出上清液。上清液经100-μm筛网过滤至50ml离心管，得到过滤液，富集腺体碎片。
(4)将过滤液离心：5min，180g；弃上清，加入5ml基础培养基使沉淀重新悬浮。重复3次。重悬液取20ul进行细胞计数，腺体总数等于显微镜下腺体数目的500倍。取出所需要的体积，移至5ml EP管中(20000个细胞/50ul Matrigel胶/孔)。离心：5min，180g。弃上清。置冰上1min。
(5)EP管加入4℃液态的温敏型生物凝胶Matrigel胶(20000个细胞/50ul Matrigel胶/孔)。预冷200ul枪头吹吸Matrigel胶数十次，避免产生气泡。
(6)细胞、凝胶混合液50μL/孔滴加至预热24孔培养板上，凝胶遇热迅速转化为果冻状；37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育30min，加入HISC培养基 700ul；37℃、5％CO2细胞培养箱中连续培养5-7天。37℃、5％CO2细胞培养箱中连续培养5-7天。选用C组共12只雄鼠，4周龄，重量18-22g，非肥胖型糖尿病重症联合免疫缺陷小鼠(NOD/SCID)。选取每个患者对应的体外培养的细胞分别接种在2只小鼠的前肢肩背部皮下。具体接种方法：在培养7天后可以每孔形成50个以上细胞构成的细胞团的克隆，去除凝胶上方HISC培养基，将24孔板置冰上15min，待Matrigel胶成液态后置于冰上5ml EP管中。用预冷的1ml无菌注射器将液态Matrigel胶注射于NOD/SCID小鼠皮下(50ul/ 只)。
(7)选用D组共18只雄性，4周龄，重量18-22g，非肥胖型糖尿病重症联合免疫缺陷小鼠(NOD/SCID)。每个患者的结直肠癌组织取3个小块，分别接种在3只小鼠的前肢肩背部皮下，具体接种方法为：在小鼠腹部备皮，再以碘伏消毒，用20号套管针将总量2×2×2mm3的结直肠癌组织于腹部腋中线处刺入，针头走行于皮肤与腹膜间，最终将组织送入前肢肩背部皮下，压迫伤口至无出血。
(6)SPF级环境下C、D组常规饲养6周，完成建立结直肠癌患者来源异种移植瘤模型，并对模型编号1-6号(每个编号所对应5只小鼠中大于等于 1只成瘤，即认定改变好模型建模成功)。C、D组小鼠接种移植后观察小鼠一般活动及营养状态等。每三天用游标卡尺测量移植瘤长(L)短(W)径平均值，按体积公式V＝1/2(L*W2)计算移植瘤平均体积。C组移植约2周后肉眼可见局部形成肿瘤结节，第4周肿瘤呈半球形，平均瘤体积约937.7mm3；第 6周部分小鼠出现肿瘤中心溃烂，平均瘤体积约1678.8mm3。而D组约3周后肉眼可见局部形成肿瘤结节，平均瘤体积186mm3；6周时有1例移植瘤呈半球形，平均瘤体积277.3mm3，解剖小鼠，大体移植瘤组织呈鱼肉状，血供丰富，H&E染色后确认病理分型为结直肠细胞癌，与对应患者病理分型相一致。经过上述步骤，C组：1-6号模型所对应2只小鼠中均有2只成瘤，最终建立6 个模型，小鼠的成瘤率为100％，4周瘤体积超过600mm3的小鼠共8只，6周瘤体积超过600mm3的小鼠有11只；D组：1号、2号模型所对应3只小鼠中有1只成瘤，4号模型所对应3只小鼠中有2只成瘤。最终建立3个模型，小鼠的成瘤率为50％，4周瘤体积超过600mm3的小鼠共0只，6周瘤体积超过 600mm3的小鼠有1只。
实施例4
1例结直肠癌患者基于结直肠癌细胞生物凝胶三维培养体系方法建立结直肠癌患者来源的异种移植瘤小鼠肝转移模型，其建立方法为：
(1)将1例患者手术切除的新鲜结直肠癌组织(离体15分钟内)置入含有20ml DMEM(200U/ml青霉素/链霉素)的离心管中，置于4℃环境，迅速转移到超净台，备用。
(2)在冰上将肿瘤组织置于培养皿中，用PBS清洗至清洁后，将组织切成2-4mm3大小的碎片，置于15ml离心管(含冰PBS约10ml)；离心：3min， 1500rpm；吸除上清液，获得组织碎片沉淀。
(3)加入5ml消化液，重悬沉淀，剧烈震荡后，37℃,5％CO2温箱中孵育30min。再次剧烈震荡后，加入5ml FCS(fetal calfserum)混匀，静置2min，吸出上清液。上清液经100-μm筛网过滤至50ml离心管，得到过滤液，富集腺体碎片。
(4)将过滤液离心：5min，180g；弃上清，加入5ml基础培养基使沉淀重新悬浮。重复3次。重悬液取20ul进行细胞计数，腺体总数等于显微镜下腺体数目的500倍。取出所需要的体积，移至5ml EP管中(20000个细胞/50ul Matrigel胶/孔)。离心：5min，180g。弃上清。置冰上1min。
(5)EP管加入4℃液态的温敏型生物凝胶Matrigel胶(20000个细胞/50ul Matrigel胶/孔)。预冷200ul枪头吹吸Matrigel胶数十次，避免产生气泡。
(6)细胞、凝胶混合液50μL/孔滴加至预热24孔培养板上，凝胶遇热迅速转化为果冻状；37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育30min，加入HISC培养基 700ul；37℃、5％CO2细胞培养箱中连续培养5-7天。37℃、5％CO2细胞培养箱中连续培养5-7天。选用4只雄鼠，4周龄，重量18-22g，裸小鼠(Balb/c-nu)。具体接种方法：在培养7天后可以每孔形成50个以上细胞克隆环，去除凝胶上方HISC培养基，将24孔板置冰上15min，待Matrigel胶成液态后置于冰上 5ml EP管中。注射前冰上保存。用预冷的1ml无菌注射器将液态Matrigel胶注射于Balb/c-nu裸小鼠皮下(50ul/只)。SPF级环境下E组常规饲养4周，取4 只小鼠皮下移植瘤，重复(1)-(6)步骤，获得细胞、凝胶混合液。
(7)选用F组3只雄鼠，4周龄，重量18-22g，裸小鼠(Balb/c-nu)。优选体外培养的细胞(每孔克隆环大于50个)，接种在3只小鼠的脾脏内。手术操作：小鼠麻醉后，按背部左侧肋缘下路径，取1cm切口，将脾脏下元轻柔拖出，用预冷的1ml无菌注射器将液态Matrigel胶注射于小鼠盲肠系膜内(50ul/ 只)。
(8)SPF级环境下F组常规饲养6周，完成建立结直肠癌患者来源异种移植瘤肝转移模型，并对模型编号1-3号(3只小鼠中大于等于1只肝脏出现转移瘤，即认定该转移模型建模成功)。3只小鼠接种移植后观察小鼠一般活动、营养状态(体重)和体检腹部肿块情况等。接种后5周余3号小鼠死亡，6周时处死小鼠，观察肝脏成瘤情况，取标本用游标卡尺测量移植瘤长(L)短(W) 径平均值，按体积公式V＝1/2(L*W2)计算移植瘤平均体积。1号小鼠饲养6 周时体重轻微减轻(8周龄和10周龄体重分别是22.2g和21.8g)。2号小鼠体重于饲养6周时体重明显的减轻(8周龄和10周龄体重分别是22.0g和18.2g)，腹部肿块未触及。3号小鼠饲养5周时体重明显减轻(7周龄和9周龄体重分别是20.9g和17.5g)，腹部肿块未触及。解剖1号小鼠，脾脏下极见一原发灶，直径2mm，肝脏单发转移肿瘤，直径3mm，肺及腹盆腔未见转移灶，脾、肝脏移植瘤组织均呈鱼肉状，血供丰富，H&E染色后确认病理分型为结直肠细胞癌，与对应患者病理分型相一致。解剖2号小鼠，脾脏下极和上极各有一处移植瘤(最大径2mm和3mm)，肝脏七个肝叶多发散在转移灶(最大者，直径为5mm)，呈粟粒样分布，肺及腹盆腔未见转移灶，脾、肝脏移植瘤组织均呈鱼肉状，血供丰富，H&E染色后确认病理分型为结直肠细胞癌，与对应患者病理分型相一致。3号小鼠死亡，解剖时组织已降解，组织HE染色不能确认脾脏、肝脏转移灶存在。经过上述步骤最终建立2个肝转移模型，接种后6 周可形成肝转移灶。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。